Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

Summary

Este protocolo descreve um método de triagem de alto rendimento baseado em citometria de fluxo para identificar drogas de moléculas pequenas que inibem a ativação de integrinas β2 em neutrófilos humanos.

Abstract

Este protocolo visa estabelecer um método para identificar pequenos antagonistas moleculares da ativação de integrinas β2, utilizando anticorpos notificadores de mudança conformacional e citometria de fluxo de alto rendimento. O método também pode servir como um guia para outros métodos de triagem de alto rendimento baseados em anticorpos. As integrinas β2 são moléculas de adesão leucocitárias específicas que são cruciais na resposta imune. Os neutrófilos dependem da ativação da integrina para sair da corrente sanguínea, não apenas para combater infecções, mas também para estar envolvidos em múltiplas doenças inflamatórias. O controle da ativação das integrinas β2 apresenta uma abordagem viável para o tratamento de doenças inflamatórias associadas a neutrófilos. Nesse protocolo, um anticorpo monoclonal, mAb24, que se liga especificamente ao headpiece de alta afinidade das integrinas β2, é utilizado para quantificar a ativação da integrina β2 em neutrófilos humanos primários isolados. N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) é usado como um estímulo para ativar integrinas β2 neutrófilos. Um citômetro de fluxo de alto rendimento capaz de executar automaticamente amostras de placas de 384 poços foi usado neste estudo. Os efeitos de 320 produtos químicos na inibição da integrina β2 são avaliados dentro de 3 h. Moléculas que têm como alvo direto integrinas β2 ou moléculas-alvo na via de sinalização de ativação de dentro para fora da integrina iniciada pelo receptor acoplado à proteína G podem ser identificadas através desta abordagem.

Introduction

Muitas doenças inflamatórias são caracterizadas pela infiltração de neutrófilos no local do edema ou lesão¹. Para infiltração desses tecidos, os neutrófilos devem completar a cascata de recrutamento de neutrófilos, que envolve parada no endotélio, extravasamento através da parede do vaso e recrutamento para o tecido². Os neutrófilos circulantes necessitam da ativação da integrina β2 para completar essa cascata, especialmente para a fase de parada. Assim, drogas inibidoras de integrinas que reduzem a adesão, o extravasamento e o recrutamento de neutrófilos podem efetivamente tratar doenças inflamatórias ^3,4.

As integrinas β2 já foram alvo de doenças inflamatórias anteriormente. O efalizumabe, um anticorpo monoclonal que tem como alvo direto a integrina αLβ2, foi desenvolvido para o tratamento da psoríase⁵. Entretanto, o efalizumabe foi suspenso devido ao seu efeito colateral letal - leucoencefalopatia multifocal progressiva resultante da reativação do vírus JC ^6,7. Novas terapias anti-inflamatórias baseadas em integrinas devem considerar a manutenção das funções anti-infecciosas dos leucócitos para minimizar os efeitos colaterais. Os efeitos colaterais do efalizumabe podem ser devidos à circulação prolongada de anticorpos monoclonais na corrente sanguínea, o que poderia inibir as funções imunes em longo prazo⁸. Um estudo recente mostra que o efalizumabe medeia ligações cruzadas αLβ2 e a internalização indesejada de integrinas α4, fornecendo uma explicação alternativa para os efeitos colaterais⁹. Assim, antagonistas de pequenas moléculas de curta duração poderiam evitar esse problema.

Um método de alto rendimento para triagem de antagonistas de integrinas β2 de pequenas moléculas usando neutrófilos humanos é apresentado aqui. A ativação da integrina β2 requer mudanças conformacionais do ectodomínio da integrina para obter acesso e aumentar sua afinidade de ligação ao seu ligante. No modelo canônico de switchblade, o ectodomínio de integrina dobrado-fechado primeiro se estende a uma conformação estendida-fechada e, em seguida, abre seu cabeçote para uma conformação estendida-aberta totalmente ativada^10,11,12,13. Há também uma via alternativa que parte do dobrado-fechado para o dobrado-aberto e estendido-aberto, eventualmente 14,15,16,17,18,19. O anticorpo conformação-específico mAb24 liga-se a um epítopo no domínio β2-I-like humano quando a cabeça do ectodomínio está aberta^20,21,22,23.

Aqui, mAb24-APC é usado para determinar se as integrinas β2 estão ativadas. Para ativar neutrófilos e integrinas, N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), um peptídeo quimiotático curto derivado de bactérias que pode ativar integrinas β2 de neutrófilos²⁴, é usado como estímulo nesse protocolo. Quando fMLP se liga ao Fpr1 em neutrófilos, cascatas de sinalização a jusante envolvendo proteínas G, fosfolipase Cβ e γ de fosfoinositida 3-quinase são ativadas. Esses eventos de sinalização acabam resultando na ativação da integrina através da via de sinalização de dentro para fora^18,25. Além de antagonistas de pequenas moléculas que se ligam diretamente às integrinas β2 e impedem mudanças conformacionais da ativação da integrina²⁶, compostos que podem inibir componentes da via de sinalização de ativação de dentro para fora da integrina β2 também seriam detectados com este método. Os citômetros de fluxo automatizados permitem a triagem de alto rendimento. A identificação de novos antagonistas pode não apenas aprofundar nossa compreensão da fisiologia das integrinas, mas também fornecer informações translacionais sobre a terapia anti-inflamatória baseada em integrina.

Protocol

Amostras de sangue total heparinizadas foram obtidas de doadores humanos saudáveis não identificados após a obtenção do consentimento informado, conforme aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UConn Health, seguindo os princípios da Declaração de Helsinque. Todos os doadores assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Os critérios de inclusão/exclusão deste estudo foram cuidadosamente desenvolvidos para garantir a adequação dos participantes e minimizar potenciais riscos. Os participantes elegíveis tinham idade entre 18 e 65 anos, de qualquer etnia, fluentes na língua inglesa e capazes de fornecer consentimento informado. Os participantes excluídos incluíram aqueles incapazes de fornecer consentimento informado para si mesmos, tais como aqueles que exigem um representante legalmente autorizado, indivíduos com menos de 18 anos ou mais de 65 anos, indivíduos encarcerados e mulheres grávidas. Além disso, os participantes tinham que estar livres do uso de medicamentos anti-inflamatórios e condições inflamatórias. Infecções atuais ou condições inflamatórias crônicas ou agudas em curso também foram critérios de exclusão. Finalmente, os indivíduos com uma história actual ou recente da infecção COVID-19 eram inelegíveis para o estudo. Esses critérios foram elaborados para garantir a segurança e adequação dos participantes, minimizando potenciais fatores de confusão que poderiam impactar os resultados do estudo.

1. Preparação dos reagentes

1. Meio neutrófilo: Preparar o meio neutrófilo adicionando albumina sérica humana a 2% ao RPMI-1640 sem vermelho de fenol (ver Tabela de Materiais).
2. Solução de fMLP: Prepare a solução de fMLP diluindo-a 100 vezes a partir da solução de armazenamento de dimetilsulfóxido de fMLP (DMSO) de 10 mM (consulte Tabela de Materiais) com RPMI 1640 sem vermelho de fenol, resultando em uma solução de fMLP de 100 μM.
3. Solução de anticorpos: Diluir 120 μL do anticorpo monoclonal conjugado com aloficocianina (APC) mAb24 (mAb24-APC) (ver Tabela de Materiais), que relata a conformação de alta afinidade da integrina β2, em 10 mL de meio neutrófilo, criando uma solução de 1,2 μg/mL de mAb24-APC.
4. Biblioteca de compostos: Diluir a biblioteca de compostos inicial com uma concentração de 10 mM a 1 mM adicionando 5 μL da biblioteca de 10 mM (ver Tabela de Materiais) a 45 μL de DMSO em placas de 384 poços usando o manipulador de líquidos. Posteriormente, transfira 5 μL por poço da biblioteca composta de 1 mM para uma placa vazia de 384 poços usando o manipulador de líquidos.
5. Conforme ilustrado na Figura 1, quatro colunas ( 1, 2, 23, 24) continham apenas DMSO, mas nenhum composto, servindo como controles positivo e negativo na triagem. Diluir ainda mais cada poço adicionando 45 μL de RPMI-1640 sem vermelho fenol, resultando em uma concentração final de 100 μM para todos os compostos.

2. Isolamento de neutrófilos do sangue humano

1. Usando uma pipeta sorológica, coloque cuidadosamente 4 mL de sangue sobre 8 mL de um meio de gradiente de densidade comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) em um tubo centrífugo de 15 mL (Figura 2A).
2. Centrifugar o sangue a 550 × g durante 30-50 minutos a 20 °C. Desacelerar o rotor gradualmente (fator de desaceleração de 1).
   NOTA: A separação bem sucedida dos neutrófilos (banda 2 na Figura 2B) das hemácias pode variar entre os doadores. Para a maioria dos doadores, uma centrifugação de 30 min é suficiente. No entanto, para alguns doadores, um adicional de 10-30 minutos de centrifugação pode ser necessário se a separação não for bem-sucedida (Figura 2C).
3. Remova cuidadosamente o plasma (o líquido amarelo no topo) e as células mononucleares (a faixa turva superior; PBMC band na Figura 2B) utilizando uma pipeta de 1 mL.
4. Coletar neutrófilos da banda turva inferior (banda de neutrófilos na Figura 2B) e aproximadamente 3-4 mL abaixo do líquido claro em um tubo centrífugo de 15 mL contendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Misture suavemente a suspensão de neutrófilos, invertendo-a 2-3 vezes.
5. Centrifugar a suspensão a 400 × g durante 10 min a 20 °C e, em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante por decantação.
6. Ressuspender suavemente o pellet com 5 mL de PBS e centrifuga-lo a 300 × g por 5 min a 20 °C.
7. Remova o sobrenadante por decantação e elimine cuidadosamente qualquer sobrenadante residual ao redor da boca do tubo e na parede do tubo usando sucção a vácuo. Ressuspender o pellet em 1 mL de meio neutrófilo.
8. Conte os números celulares usando um hemocitômetro. Tipicamente, 1 a 4 × 10⁷ neutrófilos foram obtidos a partir de 8 mL de sangue humano.
   NOTA: Pode haver contaminação de hemácias na suspensão de neutrófilos. As hemácias não afetam significativamente a maioria dos ensaios e podem prevenir a ativação/priming neutrofílico²⁷. As hemácias precisam ser lisadas antes da contagem para obter uma concentração precisa de neutrófilos. Adicionar 10 μL da suspensão celular a 891 μL de água deionizada por 10-30 s para lisar as hemácias, em seguida, adicionar 99 μL de 10× PBS para equilibrar a pressão osmótica, evitando a lise dos neutrófilos.
9. Ajustar a densidade celular para 6,25 × 10⁵ células/mL adicionando meio neutrófilo.

3. Preparação da placa de 384 poços

1. Em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, combinar 1 mL da solução de anticorpos (1,2 μg/mL mAb24-APC) com 0,2 mL de meio neutrófilo para criar uma solução de 1 μg/mL de mAb24-APC. Em seguida, adicione 25 μL dessa mistura aos poços de controle negativo em uma placa de 384 poços (os poços azuis da Figura 1).
2. Em um tubo de centrífuga de 15 mL, misturar 9 mL da solução de anticorpos com 21,6 μL da solução de fMLP (100 μM) e 1,7784 mL de meio neutrófilo para criar uma solução contendo 1 μg/mL de mAb24-APC e 200 nM de fMLP. Em seguida, adicione 25 μL dessa mistura aos poços de controle positivo e teste em uma placa de 384 poços (os poços vermelho e azul na Figura 1).
3. Transfira 5 μL das soluções compostas de 100 μM da placa de biblioteca de compostos para a placa de 384 poços usando uma pipeta multicanal.
4. Centrifugar o líquido durante 1 min a 500 × g, à temperatura ambiente.
   NOTA: Para centrifugar placas, é necessário um rotor de caçamba oscilante e caçambas de placa.

4. Tratamento de células

1. Adicionar 20 μL da suspensão de neutrófilos a cada poço usando uma pipeta de 16 canais (faixa de 5-50 μL, para cada coluna da placa de 384 poços). Misture suavemente 5-10 vezes usando a pipeta, mantendo um intervalo de tempo consistente entre cada pipetagem.
   NOTA: As concentrações finais nos poços são as seguintes: neutrófilos 2,5 × 10⁵ células/mL (todos os poços); mAb24-APC 0,5 μg/mL (todos os poços); fMLP 100 nM (poços de controle positivo e teste); compostos de 10 μM (poços de teste).
2. Incubar a placa num agitador a 300 rpm, à temperatura ambiente (TR), durante 10 min.
3. Fixar as células adicionando 3 μL de paraformaldeído (PFA) a 16% em cada poço usando uma pipeta de 16 canais (concentração final de PFA ~0,91%). Em seguida, incube no gelo por 10 min.
   NOTA: Recomenda-se manter um intervalo de tempo consistente entre colunas diferentes ao adicionar neutrófilos e PFA. Isso garante que os neutrófilos em cada poço tenham o mesmo tempo de incubação com fMLP e mAb24-APC.

5. Citometria de fluxo

1. Ligue o citômetro de fluxo (consulte Tabela de Materiais) e verifique se o computador conectado ao instrumento também está ligado.
2. Certifique-se de que o recipiente de fluido de bainha esteja cheio e que o recipiente de resíduos esteja vazio e devidamente conectado ao instrumento.
3. Coloque a placa de 384 poços no carregador de amostras do citômetro de fluxo. Certifique-se de que o poço A1 da placa esteja alinhado com a marca A1 na carregadeira.
4. Abra o software e crie um novo experimento. Selecione bem 384 e escolha os fluoróforos desejados. Em seguida, clique em Configuração da placa, arraste para selecionar todos os poços e, em seguida, clique em Amostra. Ative a opção "Alta taxa de transferência" e selecione Alta no painel de taxas.
   1. Na caixa de volume, digite 50. Selecione amostras em colunas ímpares e, em seguida, ative a opção "Agitação". Finalmente, nomeie os exemplos no painel direito.
5. Clique em Plot e gate. Em seguida, clique no botão Aplicar (duas setas em um círculo preenchido com verde) e, posteriormente, clique no botão de reprodução (forma de triângulo). Aguarde alguns segundos para observar algumas células do primeiro poço e, em seguida, clique no botão de pausa .
   1. Ajuste as tensões FSC e SSC para garantir a visualização adequada das células no gráfico. Clique em Aquisição e, em seguida, clique no botão play (forma de triângulo) para iniciar o ensaio.
6. O citômetro de fluxo coletará sequencialmente ~50 μL de 1000-3000 neutrófilos de cada poço. Levará aproximadamente 3 h para completar toda a placa de 384 poços.
7. Depois de concluir todos os exemplos, exporte os arquivos .fcs para a próxima etapa.

6. Análise dos dados

1. Abra o software de análise de dados de citometria de fluxo (consulte Tabela de Materiais). Selecione e arraste a pasta que contém todos os arquivos .fcs para a janela do software e, em seguida, solte para importar os dados para o software.
2. Clique duas vezes em uma amostra, com base em FSC e SSC^28,29,30 na janela pop-up^, como mostra a Figura 3. Selecione as linhas fechadas e arraste-as para a pasta e, em seguida, solte para aplicar o limite a todas as amostras nessa pasta.
3. Calcule e exporte a intensidade de fluorescência mediana (MFI) APC de neutrófilos de cada poço usando a função de editor de tabelas do software. Clique em Adicionar coluna na guia Editar . Selecione Mediana na guia Estatística , escolha os neutrófilos da população fechada e selecione APC como parâmetro. Clique no botão OK .
4. Retorne à guia "Editor de tabela", selecione Todas as amostras na guia "Grupo" e pressione o botão Criar tabela . Uma nova janela aparecerá exibindo a tabela criada. Salve-o como um arquivo de texto, CSV ou Excel.
5. Abra a tabela exportada, calcule o valor médio e o desvio padrão da IFM APC para as amostras controle positivo e negativo (Figura 4).
6. Calcule o fator Z (Z') da placa usando a equação:
   Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μ_p - μ_n),
   onde σ p e σ n são os desvios-padrão dos controles positivo e negativo, respectivamente, e μ_p e μ_n são as médias dos controles positivo e negativo, respectivamente³¹.
   NOTA: O fator Z' indica a separação das distribuições de controle positivo e negativo. Um Z' de 0 significa nenhuma separação, enquanto um Z' de 0,5 indica separação igual. Como mencionado em um estudo anterior³¹, Z' > 0,5 indica um excelente ensaio para triagem de compostos. Um Z' na faixa de 0,5 a 0 é aceitável, mas pode identificar apenas acertos fortes no ensaio, o que exigirá validação adicional em ensaios secundários.
7. Considerar compostos como "acertos" para triagem quando a IFM APC de neutrófilos tratados com compostos for menor que três vezes o desvio padrão da MFI de controle positivo subtraída da MFI de controle positivo (P = 0,0013, representada pela linha pontilhada na Figura 4).

Results

Dados de uma triagem representativa de placas de 384 poços (Figura 4) revelaram que os controles negativos tinham uma MFI de mAb24-APC de 3236 ± 110, enquanto os controles positivos tinham uma MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. O fator Z' para esta placa é de aproximadamente 0,33, que está dentro de uma faixa aceitável³¹. No entanto, Z' requer validação adicional em ensaios secundários.

Para normalizar os dados, todos os valores foram dimensionados para atribuir um valor máximo de 1 para a média positiva e um valor mínimo de 0 para a média negativa. O fator Z' passará por validação mais rigorosa em ensaios secundários. O ponto de corte para essa placa é de 0,41, o que significa que amostras com MFI relativo menor que 0,41 serão consideradas como acertos inibidores da ativação da integrina β2 induzida por fMLP em neutrófilos humanos. Nenhuma batida foi identificada a partir desta placa.

Para confirmar a eficácia do protocolo, foram utilizados o Nexinhib20, que inibe a ativação da integrina β2 antagonizando a função Rac-1, e o lifitegrast, que antagoniza diretamente a integrina αLβ2^32,33. No entanto, os tempos de incubação foram ajustados para uma hora para Nexinhib20 e meia hora para lifitegrast. Os dados resultantes desses experimentos foram normalizados usando o mesmo método de escalonamento descrito acima. Esses dados foram então combinados com os resultados da placa e analisados coletivamente (Figura 4).

Figura 1: Layout da placa para peneiramento composto. Um diagrama esquemático ilustrando a disposição dos compostos de triagem e controles em uma placa de 384 poços. Os poços de controle negativo são representados em azul (colunas 1 e 23), e os poços de controle positivo são mostrados em vermelho (colunas 2 e 24). Os poços de teste estão representados em bege (colunas 3 a 22). As setas indicam a sequência de leitura da placa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Separação dos neutrófilos utilizando meio de gradiente de densidade. Fotos representativas demonstrando a separação bem-sucedida e malsucedida de neutrófilos usando meio de gradiente de densidade. (A) Inicialmente, 4 mL de sangue são estratificados em 8 mL de meio de gradiente de densidade. (B) Após a centrifugação, duas bandas turvas devem ser visíveis: a banda superior contendo principalmente células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e a banda inferior contendo principalmente neutrófilos com algumas hemácias. A maioria das hemácias é peletizada na parte inferior. (C) Uma separação malsucedida onde as hemácias não são peletizadas e a banda de neutrófilos não é observada. Centrifugação adicional (10-30 min) seria necessária para separar a banda de neutrófilos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Agrupamento de neutrófilos utilizando gráficos FSC/SSC. Gráficos representativos de espalhamento anterior (FSC) e espalhamento lateral (SSC) ilustrando a estratégia de gating para identificar neutrófilos. (A) Os neutrófilos são fechados com base na área de espalhamento anterior (FSC-A) e dispersão lateral (SSC-A) registrada pelo citômetro de fluxo. (B) As células individuais são ainda limitadas com base na largura (FSC-W) e altura (FSC-H) da dispersão para a frente, e (C) na largura (SSC-W) e altura (SSC-H) da dispersão lateral. A escala de cores representa a densidade celular, fazendo a transição do vermelho para o amarelo, verde e azul à medida que a densidade diminui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados da triagem em uma placa representativa de 384 poços. A triagem resulta de uma placa representativa de 384 poços, demonstrando um fator Z' de 0,3. Os controles negativo e positivo são indicados por pontos azuis e vermelhos, respectivamente. Amostras de teste tratadas com vários compostos são representadas como pontos bege. A linha tracejada representa o ponto de corte da intensidade média de fluorescência (MFI) para identificar acertos. Nenhum dos compostos testados foi identificado como antagonistas de integrinas β2, pois todos os compostos testados apresentaram valores de IFM acima da linha de corte. Resultados de experimentos independentes testando antagonistas de integrina β2 conhecidos com tempos de incubação variados (Nexinhib20 por 1 h, lifitegrast por meia hora) são agrupados para apresentação nesta figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O início e o término da estimulação e coloração de neutrófilos são determinados pela adição de neutrófilos e do PFA fixador. Portanto, garantir o mesmo intervalo de tempo entre a pipetagem de neutrófilos ou PFA em cada coluna é fundamental. Isso garante que o tempo de estimulação e coloração dos neutrófilos de cada poço permaneça consistente. Devido ao curto tempo de vida dos neutrófilos, todo o experimento, desde a coleta de sangue de doadores até a conclusão da citometria de fluxo, deve ser realizado no mesmo dia. Os neutrófilos são altamente sensíveis às mudanças de temperatura e podem ser ativados quando expostos a aumentos rápidos de temperatura, como a transição de 4 °C para a temperatura ambiente ou da temperatura ambiente para 37 °C. Além disso, com base em nossa experiência anterior, a ativação da integrina β2 de neutrófilos induzida por fMLP não ocorre quando as células são armazenadas em gelo ou a 4 °C (dados não mostrados). Portanto, antes da fixação, o sangue total e os neutrófilos devem ser mantidos à temperatura ambiente ou a 20 °C (durante a etapa de centrifugação de isolamento). Não coloque sangue total e neutrófilos no gelo.

A coloração de mAb24 em controles negativos deve produzir resultados muito baixos. Se um alto nível de coloração de mAb24 for observado em um experimento, verifique o seguinte: (1) se houve uma mudança significativa de temperatura durante o experimento antes da fixação; (2) se houve contaminação por fMLP ou endotoxina no meio neutrófilo; (3) se o manuseio da amostra foi muito agressivo, como a geração de bolhas durante a pipetagem e mistura.

O protocolo atual emprega mAb24 para relatar a abertura do headpiece de integrina β2. Teoricamente, o KIM127, um anticorpo monoclonal que relata a extensão das integrinas β2 34,35^, pode ser usado em conjunto com o mAb24 para avaliar de forma abrangente a conformação das integrinas β2. No entanto, a relação sinal-ruído da coloração KIM127 (1,5 a 2 vezes) não é tão favorável quanto a do mAb24 (5 a 10 vezes), que normalmente não fornece um fator Z' satisfatório no ensaio da placa de 384 poços. No ensaio de placa de 96 poços, as amostras podem ser lavadas antes de realizar a citometria de fluxo, reduzindo os sinais de fundo derivados de anticorpos solúveis. Portanto, o ensaio baseado em KIM127 pode ser conduzido no ensaio de placa de 96 poços, que tem menor rendimento em comparação com o ensaio de placa de 384 poços.

Como esse método utiliza a intensidade da fluorescência como leitura para avaliar o efeito inibitório de integrinas de fármacos, algumas drogas fluorescentes podem interferir nos resultados. Além disso, drogas tóxicas que induzem morte de neutrófilos dentro do período de estimulação de 10 min também parecem relatar inibição de integrinas. Drogas que inibem a degranulação de neutrófilos suprimirão a expressão global de β2 integrinas. Esses inibidores de degranulação também serão identificados em nossa triagem. Portanto, a triagem secundária com outros controles é necessária para confirmar os efeitos inibitórios dos acertos. As telas secundárias são referenciadas como um meio de validar e determinar o mecanismo de ação dos acertos. Além da repetição dos testes de mAb24, a expressão total de CD18 na superfície celular será avaliada usando um anticorpo pan anti-human CD18. O nível de integrina β2 ativada, medido por mAb24, será normalizado pela expressão total de CD18. Isso nos permitirá determinar se o mecanismo de ação do agente envolve antagonizar a ativação da integrina e/ou inibir a expressão de CD18 na superfície celular. Um ensaio de viabilidade também deve ser realizado na tela secundária para excluir quaisquer efeitos tóxicos dos acertos.

Este protocolo tem limitações. Primeiro, o mAb24 é capaz de detectar o domínio β2 I-like apenas nos casos em que a integrina está em um estado de alta afinidade. Portanto, não pode identificar antagonistas alostéricos α/β I-like, como o lifitegrast, através da diminuição da ligação do mAb24. Lifitegrast induz mais ligação de mAb24³² e mostra um valor anormalmente aumentado de MFI com mAb24 (Figura 4). Para tais valores anormais, outros ensaios podem ser necessários para verificar se esses acertos são antagonistas alostéricos α/β I-like como o lifitegrast. Em segundo lugar, o fator Z' para este ensaio é subótimo e poderia ser potencialmente melhorado através do uso de pipetagem e agitação automáticas. Infelizmente, nosso laboratório não possui os equipamentos necessários para testar essa hipótese. Duplicar ou triplicar ensaios será útil na identificação de falsos positivos e negativos, caso o fator Z' não possa ser melhorado com os métodos acima. Além disso, pode ser benéfico estender o tempo de incubação para identificar mais hits, como observado com o conhecido inibidor de ativação de integrinas β2 Nexinhib20, que requer uma hora de incubação para produzir efeitos inibitórios. Este estudo teve como foco a identificação de agentes de ação rápida. Os pesquisadores devem observar que eles podem modificar o tempo de incubação para atender às suas necessidades específicas.

Até onde sabemos, este é o primeiro método de triagem de alto rendimento para antagonistas de integrinas β2. Essa abordagem poderia ser usada para identificar compostos de pequenas moléculas que se ligam diretamente às integrinas β2 e prevenir mudanças conformacionais que levam a estados de integrinas intermediárias/de alta afinidade, semelhantes a antagonistas sem propriedades "agonísticas" recentemente descritas para integrinas αIIbβ3 e α4β1²⁶. Os neutrófilos são críticos em muitas doenças inflamatórias, como lesão de isquemia-reperfusão miocárdica 36, sepse³⁷ e doenças autoimunes^38,39. Drogas de moléculas pequenas podem oferecer mais flexibilidade no tratamento dessas doenças em comparação com drogas baseadas em anticorpos. Acessos de nossa tela podem fornecer tratamentos potenciais para doenças inflamatórias.

O método atual é uma tela de alto rendimento baseada em anticorpos fluorescentes. Como anticorpos repórteres de ativação também estão disponíveis para integrinas β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 e αL^47,48,49,50, esse método pode ser estendido para identificar antagonistas para outras integrinas. Um anticorpo conformacionalmente sensível como o HUTS-21, que se liga ao domínio híbrido β1 51,52,53, tem sido usado em uma triagem de alto rendimento para identificar antagonistas alostéricos muito tardios do antígeno-4 (VLA-4^, integrina α4β1) ⁵⁴. O presente método de triagem também pode ser modificado e estendido para encontrar drogas que inibem ou promovam a expressão de outros receptores de superfície, como compostos que aumentam a expressão de superfície do cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) em células da fibrose cística (FC). Na FC, múltiplas mutações levam ao desdobramento do CFTR, resultando na ausência de expressão do CFTR na membrana celular⁵⁵. Demonstrou-se que fármacos de moléculas pequenas restauram a expressão de CFTR⁵⁶. Para modificações no protocolo, é necessário aumentar o tempo de incubação dos fármacos para várias horas para permitir que ocorram mudanças na expressão proteica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipetas de 16 canais	Thermo	4661090N
Instrumento Placa de 384 poços	Greiner	784201	Materiais
APC anti-humano CD11a/CD18 (LFA-1) Anticorpo Clone: m24	BioLegend	363410	Reagentes
Bravo  Plataforma Automatizada de Manuseio de Líquidos	Agilent	16050-102	384 manipulador de líquidos multicanal
Centrífuga	Eppendorf	Modelo 5810R
Instrumento FlowJo	Becton, Dickinson & Empresa	NA	Software
Solução de Albumina de Soro Humano (25%)	GeminiBio	800-120	Reagentes
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Reagentes
Nexinhib20	Tocris	6089	Reagentes
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Reagentes
Paraformaldeído 16% solução	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagentes
Baldes de placa	Eppendorf	UL155	Agitador de placa acessória
	Instrumento Fisher	88-861-023
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (1114683 anterior)	Reagentes
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)	Prestwick Chemical Libraries	Ver19_384	1520 pequenas moléculas, 98% de medicamentos aprovados no mercado (aprovado pela FDA, EMA, JAN e outras agências)
RPMI 1640 Médio, sem fenol vermelho	Gibco	11-835-030	Reagentes
Rotor de balanço-bucket	Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5 Analisador de Células	Bio-Rad Laboratories	Modelo ZE5	Instrumento