Os procedimentos são escritos de acordo com os padrões nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Tennessee (UTHSC).
NOTA: Os leitões do grupo experimental são submetidos à ligadura e punção cecal, enquanto o grupo simulado só sofre abertura do abdômen sem ligadura ou punção cecal. Leitões em ambos os grupos são mantidos sob anestesia por 12 h após o procedimento para permitir tempo suficiente para que a sepse e a lesão renal aguda (LRA) ocorram no grupo experimental. A medida da TFG transdérmica ocorrerá às 8 h após o procedimento por um total de 12 h.
1. Fornecimento e alojamento dos leitões
- Identifique uma fazenda de suínos local que possa fornecer leitões neonatais com idades entre 3 e 5 dias. Agende a entrega no início da semana para completar a experimentação antes que qualquer leitão tenha mais de 7 dias.
NOTA: O fornecedor forneceu três a cinco leitões às segundas-feiras para esta experiência; na sexta-feira, os leitões teriam sido submetidos ao experimento. Usar o mesmo sexo e idade próxima da mesma idade é essencial para evitar fatores de confusão.
- Após a chegada do leitão, certifique-se de que ele tenha uma identificação individual (por exemplo, uma marca auricular e um registro que inclua peso e idade).
- Abrigue os leitões em uma unidade de cuidados com animais de laboratório (LACU) sob os cuidados de um veterinário licenciado. Os animais são alojados como um grupo em um curral espaçoso com um piso de concreto sólido que é facilmente lavado com água para manter um bom saneamento.
- Adicione um móvel, como uma bola pesada, para permitir o enriquecimento e a estimulação ambiental.
- Garantir que o LACU ofereça condições ambientais ideais, incluindo os seguintes elementos-chave: saneamento, nutrição, controle de temperatura, ventilação e ciclo dia-noite, controlando a iluminação.
- Peça ao veterinário que verifique o leitão diariamente, incluindo a medição do peso, para informar o investigador se algum leitão parecer doente, o que pode exigir a exclusão da experiência.
- Deixe os leitões por pelo menos 1 dia para se aclimatar ao ambiente, o que ajuda a minimizar o estresse.
2. Preparação pré-operatória
- Prepare a estação cirúrgica antes de iniciar o experimento. Isso inclui uma almofada de aquecimento, cateteres, um ventilador, um tubo endotraqueal, solução salina heparinizada e um saco de fluido de lactato de ringer.
NOTA: Os leitões têm fraca capacitância termorreguladora e são propensos à hipotermia que altera a hemodinâmica22,23. Portanto, permitir tempo suficiente para que a almofada de aquecimento aqueça é essencial.
- Preparar 10 mg/ml de α-cloralose misturando-a com solução salina a 60 °C até que a mistura esteja límpida. Não superaqueça a solução para evitar a cristalização da medicação após o resfriamento. Filtrar com um filtro de seringa (tamanho 0,22 μm) antes de administrar aos leitões.
- Elaborar medicação anestésica à base de peso animal - Cetamina: 20 mg/kg e Xilazina: 2,2 mg/kg. Use α-cloralose (5 mL/kg) para manter a anestesia.
NOTA: α -cloralose é utilizado devido à facilidade de administração IV quando comparado com o inalado
anestésicos, pois estes últimos requerem uma máquina anestésica e um sistema de limpeza apropriado para serem administrados através de um tubo endotraqueal.
3. Anestesia
- Realizar a indução da anestesia no curral de suínos, ambiente familiar para leitões, para evitar estresse indevido.
- Escolha suavemente o leitão pelas patas traseiras e administre cetamina: 20 mg/kg e Xilazina: 2,2 mg/kg na perna traseira no músculo semimembranoso/semitendíneo, usando uma agulha 23 G 3/4.
- Reserve alguns minutos para que os medicamentos façam efeito. Verifique o nível adequado de anestesia, garantindo que o animal esteja relaxado o suficiente para ficar imóvel, com perda do reflexo palpebral e do tônus da mandíbula para permitir o transporte fácil e seguro para o posto cirúrgico. Avalie o reflexo palpebral tocando o canto interno do olho; ausência de piscar indica anestesia adequada.
4. Traqueostomia
NOTA: Este experimento não é de sobrevivência, de modo que uma traqueostomia é realizada para estabelecer uma via aérea para ventilação mecânica. A traqueostomia é um procedimento rápido e fácil, ao contrário da intubação endotraqueal, que é desafiadora em leitões dada a anatomia da cabeça e das vias aéreas superiores24,25. Além disso, laringoespasmo é comumente relatado durante a intubação, resultando em um período prolongado de hipóxia e hipercarbia que pode comprometer os resultados26.
- Posicione o leitão em decúbito dorsal. Identifique a cartilagem cricotireóidea palpando a proeminência da cartilagem tireoidiana que se sente firme. Esterilize a área usando iodopovidona e etanol a 70% antes de aplicar uma cortina estéril.
- Usando uma lâmina cirúrgica, faça uma incisão da linha média ventral de 2-3 cm inferior à extremidade caudal da cartilagem tireoide.
- Usando um hemostato curvo de mosquito, disseque sem rodeios os tecidos e músculos subcutâneos sobrejacentes (esterno-hioideus e coli cutânea) até que a membrana cricotireoidiana e os primeiros anéis traqueais sejam visualizados. Ao dissecar, seja cauteloso para evitar ferir quaisquer vasos sanguíneos.
- Obtenha uma visão clara da membrana cricotireóidea e dos anéis traqueais24 e, em seguida, use um par de pinças de ângulo reto misturadoras longas para elevar as estruturas.
- Com um par de tesouras pequenas, faça um pequeno corte na membrana cricotireoidiana ou no primeiro anel traqueal. Estenda o corte horizontalmente até ~0,5 cm para passar um tubo endotraqueal de 3,0 mm.
- Insira o tubo na marca de 5 cm. Certifique-se de expansão torácica bilateral e sons respiratórios antes de fixar o tubo.
- Passe fita umbilical ao redor da traqueia para prendê-la no lugar. Fita adicional é usada para prender o tubo à base da mandíbula.
- Ligue o ventilador, conecte o tubo endotraqueal e enrole os botões específicos (por exemplo. Botões SIMV, botões PEEP, etc.) para selecionar as seguintes configurações de linha de base. Modo de Controle de Pressão: ventilação mecânica intermitente sincronizada (SIMV); pico de pressão inspiratória (PIP) - 15; pressão expiratória final positiva (PEEP) - 5; Taxa- 20; Tempo I - 0,6. Após a primeira análise de gases sanguíneos, ajuste as configurações do ventilador de acordo com os resultados da gasometria, com o objetivo de manter a oxigenação e ventilação adequadas.
5. Canulação do vaso femoral
- Estabeleça as vias aéreas e a ventilação, antes de chamar a atenção para os vasos femorais para acesso venoso e monitorização invasiva da pressão arterial. A artéria femoral é identificada pela sensação de um pulso no sulco entre os músculos sartório e grácil, e a veia pode ser encontrada apenas medial à artéria.
- Enquanto o leitão estiver deitado em uma posição dorsal reclinada, esterilize a área da virilha usando iodopovidona e etanol e aplique uma cortina de tamanho apropriado.
- Use uma lâmina cirúrgica para criar uma incisão longitudinal de 3-4 cm, começando cranialmente no vinco inguinal e estendendo-se distalmente ao longo do canal femoral.
- Aplique dissecção contundente e afiada, usando pinça curva do mosquito e tesoura, respectivamente, para dissecar até o nível do feixe neurovascular femoral. O feixe pode ser encontrado profundamente no corpo do músculo gracilil27. Dissecar circunferencialmente a artéria e a veia femoral ao longo de 2-3 cm para permitir a canulação. Ligue pequenos ramos laterais, se necessário.
- Aplique uma gravata de seda 3.0 nas extremidades proximais e distais da artéria e da veia para aplicar tração. Amarre a sutura de seda distal na veia e na artéria, ligando os vasos.
- Começando com a veia femoral, mantenha a tração distal e proximal nas gravatas de seda e, em seguida, use um par de micro tesouras para criar uma venotomia.
- Em seguida, use um introdutor de cateter de coleta de veias para abrir o vaso enquanto insere um cateter de poliuretano pré-medido com um diâmetro interno x diâmetro externo de 0,86 mm x 1,32 mm. Uma vez inserido, amarre a sutura de seda 3.0 proximal para fixar o cateter. Lavar o cateter com 3 mL de solução salina heparinizada (1 U/mL). Esta solução pode ser feita adicionando 0,5 mL de heparina a 50 mL de solução salina normal.
- Insira um cateter de pressão arterial invasivo usando a mesma abordagem acima para criar uma arteriotomia e passar o cateter.
NOTA: Manter a tração distal e proximal é essencial para minimizar a perda de sangue ao acessar a artéria.
- Uma vez que os cateteres estejam presos, cubra o local com gaze embebida em solução salina e, se necessário, a pele pode ser suturada usando uma sutura de seda 3.0 para prevenir a infecção.
6. Manutenção da anestesia, fluidos e gasometria
- Monitore a profundidade da anestesia durante todo o experimento, usando o tom da mandíbula e o reflexo palpebral, e administre α-cloralose, por via intravenosa, conforme necessário para manter o animal sob anestesia profunda. Use uma dose de carga inicial de 50 mg/kg e 20 mg/kg para bolos adicionais.
- Infundir lactato de campainha a uma taxa de 4 mL/kg/h durante todo o experimento como fluido de manutenção. Por exemplo, se o peso do leitão for de 3 kg, a taxa de infusão de fluidos é de 12 mL/h.
- Para a análise de gases à beira do leito, retire uma amostra de sangue arterial em uma seringa de gás sanguíneo heparinizada e apresente a amostra à máquina analisadora. Selecione a opção gasometria arterial e aguarde ~2-3 s para que o analisador apresente a agulha de coleta de sangue.
- Insira cuidadosamente a agulha na extremidade da seringa que contém a amostra de sangue. Aguarde até que o analisador aspira a amostra necessária e retire a seringa. Permita que a máquina analise o gás sanguíneo e apresente os resultados.
- Com base nos resultados, ajuste o ventilador para manter o pH entre 7,35--7,45, a pressão parcial de dióxido de carbono (PCO2) entre 35-45 mmHg e a pressão parcial de oxigênio (PaO2) entre 80-150 mmHg. As configurações diferem com base no tipo de ventilador, mas em grande parte envolvem aumentar ou reduzir a frequência respiratória usando botões apropriados para compensar a hipóxia e / ou hipercapnia.
- Extraia 3 mL de sangue em um tubo verde claro (heparina de lítio). Centrifugar a amostra a 2000 xg durante 15 min, mantida a 4 °C para extrair plasma. Uma vez concluído, o plasma pode ser analisado imediatamente para o nível de creatinina sérica com o analisador químico à beira do leito ou armazenado a -80 °C para análise posterior.
- Monitore a temperatura continuamente usando um termômetro de sonda retal e ajuste a temperatura da almofada de aquecimento para manter a temperatura do leitão entre 101 e 103 ° F.
7. Grupo experimental; ligadura e perfuração cecal (FLP) 25,28,29
NOTA: Para leitões do grupo experimental, realizar FLP para induzir sepse polimicrobiana28 e monitorar o animal por 12 h após a cirurgia para permitir tempo suficiente para que a sepse grave ocorra. A gravação transdérmica da TFG começa às 8 h de ligadura pós-cecal para permitir 4 h de gravação.
- Use uma lâmina cirúrgica para criar uma incisão vertical paramediana esquerda de 5-6 cm, pois o ceco em suínos encontra-se na fossa paralombar esquerda30. Dissecar as camadas da parede abdominal, evitando lesões nos vasos epigástricos superficiais.
- Uma vez que a camada peritoneal é incisada, use um afastador para melhorar o acesso às estruturas intrabdominais.
- Identifique o cólon espiral no quadrante superior esquerdo do abdômen. Trace o cólon espiral, caudal e dorsalmente, para localizar o ceco. O íleo é visto juntando-se ao cólon espiral na base do ceco.
- Lige o ceco apenas distal à junção ileocecal (Figura 1).
- Usando uma agulha 18 G, faça sete punções no ceco e extrudir fezes para a área peritoneal.
- Feche o abdômen em camadas com uma sutura de seda 3.0 usando pontos simples interrompidos ou contínuos. Um grampeador também pode ser usado para fechar a camada da pele, se disponível.
8. Grupo falso
- Siga as etapas 7.2-7.4 como acima. Depois de identificar o ceco, coloque-o de volta intocado e feche a parede abdominal da mesma forma.
- Monitore leitões no grupo simulado por 12 h para eliminar qualquer viés de confusão atribuído à exposição prolongada à anestesia.
9. Configuração do dispositivo de TFG transdérmica
- Após 8 h de ligadura cecal, prepare-se para iniciar a medição transdérmica da TFG.
- Use o software de serviço MB versão 3.0 para ajustar a taxa de amostragem no dispositivo GFR. Resumidamente, conecte o dispositivo de TFG transdérmico ao software do computador usando o conector USB. Abra o software, clique em conectar e ajuste o tempo para 4000 ms. Clique em escrever para salvar as configurações.
NOTA: Isso dá até 6 h de tempo total de amostragem. Nos suínos, a TFG transdérmica é completada em 4 h. Para experimentos que exigem amostragem de até 12 h, escolha a opção de 8000 ms.
- Anexe os adesivos de dupla face com uma janela transparente ao dispositivo. Conecte o dispositivo a um lado, garantindo que o diodo emissor de luz sobreponha a janela transparente para permitir a detecção do traçador.
- Raspe a área que recobre a parede torácica lateral. Conecte a bateria ao dispositivo e cole imediatamente o adesivo com o dispositivo no lugar e verifique se ele está bem preso (Figura 2). Como os leitões são profundamente anestesiados, a fita adesiva pode ser desnecessária para manter o dispositivo no lugar.
NOTA: O adesivo por si só é suficiente para fixar. No entanto, em procedimentos em que o animal seria manipulado, se tornaria ativo ou onde a anestesia poderia ser interrompida, pode ser importante aplicar uma fita. O curativo também pode ser uma abordagem alternativa31.
- Um registro basal de 3-5 min é necessário antes de administrar FITC-sinistrina.
10. Preparação e injeção de FITC-sinitrina
- Preparar uma mistura de FITC-sinistro com solução salina até uma concentração final de 50 mg/ml. A dose administrada ao leitão é de 20 mg/kg. FITC-sinistrin é fornecido em forma de pó.
NOTA: A FITC-sinistro também pode ser administrada através de um cateter venoso periférico inserido na veia auricular. É essencial atingir um alto nível de pico administrando FITC-sinitrina como um bolo de empurrar através do cateter venoso da veia femoral.
- Anexe a seringa com medicação a um lado de uma torneira de três vias e a uma descarga salina do outro lado da torneira de parada. Empurre o FITC-sinistro e siga imediatamente com um bolus salino de 5 mL antes de fechar a torneira de parada de três vias para a veia do leitão.
11. Registro transdérmico da TFG
- Mantenha o dispositivo ligado ao leitão durante 4 h. Durante este tempo, mantenha o leitão sob anestesia usando doses intermitentes de α-cloralose a uma concentração de 20 mg / kg para evitar qualquer artefato de movimento.
- No final das 4 h, remova o dispositivo e desconecte imediatamente a bateria.
12. Medição da TFG
- Conecte o dispositivo de TFG transdérmico ao computador usando o conector USB fornecido pelo fornecedor.
- Abra o software de leitura para recuperar dados do dispositivo. Salve os dados brutos clicando na sequência: conectar, ler, renomear e salvar. Conforme instruído no manual, processe e avalie os dados salvos no software de análise.
- Resumidamente, abra o software versão 3.0 e importe os dados. Ajuste as posições de deslocamento, início e fim usando os marcadores automatizados. Remova os artefatos, se necessário, e clique em ajustar. Isso fornece uma leitura que mostra a depuração FITC-sinistrina em minutos (t1/2). O t1/2 é subsequentemente utilizado para calcular aTFGt 32,33 da seguinte forma:

NOTA: Em consulta com o fabricante, o fator de conversão utilizado para suínos é de 20 (indicando que 20% do peso corporal é espaço extracelular), em oposição a 21,33 em ratos (TFGt em mL/min) e 14.616,8 em camundongos (TFGt em μL/min). Isso porque a TFG é medida com precisão em função do líquido extracelular34,35, que por sua vez é dependente do peso corporal 36.
13. Eutanásia de leitões
- Recolher 3 ml de sangue após 12 h de FLP para posterior análise bioquímica.
- Eutanasiar o leitão administrando 0,2 mL/kg de mistura pré-misturada de pentobarbital sódico a 20% e fenitoína sódica por via intravenosa.
- Colha o rim direito para estudo histopatológico antes de levar o leitão ao necrotério.