Quantificando a atividade antifúngica de peptídeos contra Candida albicans

Resumo

Este protocolo descreve um método para a obtenção de dados quantitativos sobre a atividade antifúngica de peptídeos e outros compostos, como agentes antifúngicos de moléculas pequenas, contra Candida albicans. Seu uso de densidade óptica em vez de contar unidades formadoras de colônias para quantificar a inibição do crescimento economiza tempo e recursos.

Resumo

Os métodos tradicionais para a realização de testes de suscetibilidade antifúngica para Candida albicans são demorados e carecem de resultados quantitativos. Por exemplo, uma abordagem comum baseia-se no revestimento de células tratadas com diferentes concentrações de moléculas antifúngicas em placas de ágar e, em seguida, na contagem das colônias para determinar a relação entre a concentração da molécula e a inibição do crescimento. Este método requer muitas placas e tempo substancial para contar as colônias. Outra abordagem comum elimina as placas e a contagem de colônias, inspecionando visualmente as culturas tratadas com agentes antifúngicos para identificar a concentração mínima necessária para inibir o crescimento; no entanto, a inspeção visual produz apenas resultados qualitativos e as informações sobre o crescimento em concentrações subinibitórias são perdidas. Este protocolo descreve um método para medir a suscetibilidade de C. albicans a peptídeos antifúngicos. Baseando-se em medições ópticas de densidade de culturas, o método reduz o tempo e os materiais necessários para obter resultados quantitativos sobre o crescimento da cultura em diferentes concentrações de peptídeos. A incubação do fungo com peptídeos é realizada em uma placa de 96 poços usando um tampão apropriado, com controles representando nenhuma inibição de crescimento e inibição completa do crescimento. Após a incubação com o peptídeo, as suspensões celulares resultantes são diluídas para reduzir a atividade peptídica e, em seguida, cultivadas durante a noite. Após o crescimento noturno, a densidade óptica de cada poço é medida e comparada com os controles positivos e negativos para calcular a inibição de crescimento resultante em cada concentração de peptídeo. Os resultados usando este ensaio são comparáveis aos resultados usando o método tradicional de chapeamento das culturas em placas de ágar, mas este protocolo reduz o desperdício de plástico e o tempo gasto na contagem de colônias. Embora as aplicações deste protocolo tenham se concentrado em peptídeos antifúngicos, o método também será aplicável ao teste de outras moléculas com atividade antifúngica conhecida ou suspeita.

Introdução

Candida albicans é um membro da microbiota humana que coloniza vários locais, incluindo a cavidade oral, pele, trato gastrointestinal e vagina¹. Para pacientes imunocomprometidos devido a doenças como o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e tratamentos imunossupressores, a colonização de C. albicans pode levar à candidíase local ou sistêmica ^2,3. O uso de terapias antifúngicas de moléculas pequenas atualmente disponíveis, como anfotericina B, azóis ou equinocandinas, pode ser complicado por problemas de solubilidade e toxicidade e pela resistência de infecções à ter....

Protocolo

A aprovação foi obtida da University of Maryland, College Park, Institutional Biosafety Committee (IBC) para o trabalho com C. albicans neste protocolo (PN 274). A cepa SC5314 de C. albicans (ver Tabela de Materiais) foi utilizada no presente estudo; no entanto, qualquer outra estirpe também pode ser utilizada.

1. Preparação do tampão, da água estéril e do meio de cultura

1. Preparar tampão de fosfato de sódio estéril 0,1 M (NaPB)²⁶ a pH 7,4 e diluir a 2 mM e 1 mM com água estéril. Preparar 100 mL cada de 2 mM de NaPB e 1 mM de NaPB será mais do que suficient....

Resultados

O uso de medições de OD₆₀₀ para quantificar a redução no crescimento devido a peptídeos antifúngicos economiza tempo substancial em comparação com o revestimento de amostras e a contagem de UFCs. O método descrito neste protocolo requer a conclusão das etapas em três dias diferentes. No primeiro dia, aproximadamente 1 h é necessário para preparar os tampões e meios (não incluindo o tempo de esterilização) e inocular a cultura inicial de C. albicans para incubação noturna. No segundo dia, as etapas req.......

Discussão

Este protocolo descreve uma abordagem eficiente para a obtenção de dados quantitativos sobre a atividade antifúngica de AMPs contra o patógeno fúngico C. albicans. Uma abordagem alternativa comum para testar peptídeos e outros agentes antifúngicos é a microdiluição em caldo descrita no padrão M27¹⁸ do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), mas esse padrão se concentra na obtenção de resultados visuais qualitativos em vez de resultados quantitativos. Outra abordagem alternativa é .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de 96 poços (fundo redondo)	VWR	10062-902
Leitor de microplacas de absorbância	N/A	N/A	Qualquer leitor de microplacas disponível é suficiente
C. albicans strain SC5314	ATCC	MYA-2876	Outros C. albicans também podem ser usados
Hemocitômetro	N/A	N/A	Pode ser usado para fazer uma curva padrão relacionando o número de células com OD600
Agitador de microplacas	VWR	2620-926
Peptídeo(s)	N/A	N/A	Os peptídeos podem ser sintetizados comercialmente por qualquer fornecedor confiável; uma pureza de ≥ Recomenda-se a remoção de 95% e de sal de ácido trifluoroacético para sal de cloridrato
Reservatórios de reagentes para pipetadores multicanais	VWR	18900-320	Simplifica a pipetagem em placas multipoços com pipetador multicanal
Fosfato de sódio, dibásico	Fisher Scientific	BP332-500	Para fazer NaPB
Fosfato de sódio, monobásico	Fisher Scientific	BP329-500	Para fazer NaPB
espectrofotômetro UV	N/A	N/A	Qualquer espectrofotômetro UV disponível é suficiente
YPD pó médio	BD Life Sciences	242820	Também pode ser feito de extrato de levedura, peptona e dextrose