Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) são bactérias Gram-positivas que residem assintomático na nasofaringe da maioria dos indivíduos saudáveis ^1,2. Promovido por fatores não completamente definidos, o pneumococo pode transitar de colonizadores benignos da nasofaringe para patógenos que se disseminam para outros órgãos, resultando em infecções graves, incluindo otite média, pneumonia e bacteremia³. A apresentação da doença pneumocócica é, em parte, dependente de diferenças específicas da cepa, incluindo o sorotipo, que é baseado na composição dos polissacarídeos capsulares. Existem mais de 100 sorotipos caracterizados até o momento, e alguns estão associados a infecções mais invasivas ^4,5. Vários outros fatores aumentam o risco de doença pneumocócica. Um desses fatores é a infecção viral, em que o risco de pneumonia pneumocócica é aumentado em 100 vezes pelo IAV ^6,7. Historicamente, o S. pneumoniae é uma das causas mais comuns de pneumonia bacteriana secundária após influenza e está associado a piores desfechos⁸. Outro importante fator de risco é a idade avançada. De fato, o S. pneumoniae é a principal causa de pneumonia bacteriana adquirida na comunidade em idosos acima de 65 anos ^9,10. Os idosos são responsáveis pela maioria (>75%) dos óbitos por pneumonia e influenza, indicando que os dois fatores de risco - envelhecimento e infecção por VAI - pioram sinergicamente a suscetibilidade à doença^11,12,13,14. No entanto, os mecanismos pelos quais a infecção viral provoca a transição do pneumococo de colonizador assintomático para patógeno invasivo e como este é moldado por fatores do hospedeiro permanecem pouco definidos. Isso se deve em grande parte à ausência de um modelo animal de pequeno porte que recapitule a transição da colonização pneumocócica assintomática para doença clínica crítica.

Estudos de co-infecção têm sido classicamente modelados em camundongos inoculados com pneumococos diretamente nos pulmões 7 dias após a infecção por influenza^15,16. Isso reproduz a suscetibilidade à pneumonia bacteriana secundária e é ideal para estudar como as respostas imunes antivirais prejudicam as defesas antibacterianas¹⁷. Entretanto, estudos longitudinais em humanos têm demonstrado que o carreamento pneumocócico na nasofaringe, onde a bactéria pode formar biofilmes^{assintomáticos18}, está uniformemente associado a doenças invasivas^19,20. Isolados bacterianos de infecções de orelha média, pulmão e sangue são geneticamente idênticos aos encontrados na nasofaringe²⁰. Assim, para estudar a transição de carreamento assintomático para doença invasiva após infecção por VA, estabeleceu-se um modelo em que camundongos receberam pneumococo cultivado com biofilme por via intranasal seguido de infecção por IAV na nasofaringe^21,22. A infecção viral das vias aéreas superiores levou a alterações no ambiente do hospedeiro que levaram à dispersão dos pneumococos dos biofilmes e sua disseminação para as vias aéreas inferiores²¹. Essas bactérias dispersas apresentaram expressão regulada de fatores de virulência importantes para a infecção, convertendo-as de colonizadoras em patógenos²¹. Essas observações destacam a complexa interação entre vírus, hospedeiro e bactéria e demonstram que as alterações no hospedeiro desencadeadas pela infecção viral têm impacto direto no comportamento pneumocócico, que, por sua vez, altera o curso da infecção bacteriana. No entanto, esse modelo falha em recapitular os sinais graves de doença observados em humanos, provavelmente porque o vírus é limitado à cavidade nasal, e os efeitos sistêmicos da infecção viral na imunidade do hospedeiro e danos pulmonares não são recapitulados.

Recentemente, estabelecemos um modelo que incorpora a complexa interação entre o hospedeiro e os patógenos, mas também mimetiza mais de perto a gravidade da doença observada em humanos²³. Neste modelo, camundongos são primeiramente infectados intranasalmente com pneumococos cultivados com biofilme para estabelecer carreamento assintomático, seguido por infecção por IAV tanto na nasofaringe quanto nos pulmões. Isso resultou em disseminação bacteriana para os pulmões, inflamação pulmonar e doença que progrediu para letalidade em uma fração de camundongos jovens²³. Este estudo prévio demonstrou que tanto a infecção viral quanto a bacteriana alteraram a defesa do hospedeiro: a infecção viral promoveu disseminação bacteriana e a colonização bacteriana prévia prejudicou a capacidade do hospedeiro de controlar os níveis pulmonares de VAI²³. O exame da resposta imune revelou que a infecção por IAV diminuiu a atividade antibacteriana dos neutrófilos, enquanto a colonização bacteriana atenuou a resposta do interferon tipo I crítica para a defesa antiviral²³. É importante ressaltar que esse modelo reproduzia a suscetibilidade do envelhecimento. Comparados a camundongos jovens, os camundongos velhos apresentaram sinais de doença mais precocemente, apresentaram doença clínica mais grave e sucumbiram à infecção com maior frequência²³. O trabalho apresentado neste manuscrito mostra que o grau da doença também é dependente da cepa bacteriana, pois cepas invasivas de pneumococo apresentam disseminação mais eficiente na infecção por IAV, mostram sinais mais evidentes de inflamação pulmonar e resultam em taxas aceleradas de doença em comparação com cepas não invasivas. Assim, este modelo de co-infecção S. pneumoniae/IAV permite o exame detalhado de fatores patogênicos e do hospedeiro e é adequado para estudar respostas imunes a infecções polimicrobianas nas diferentes fases da progressão da doença.

Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com as recomendações do Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Búfalo.

1. Preparação de meios quimicamente definidos (MDL)

1. Prepare os estoques da seguinte forma:
   1. Dissolver os compostos da mistura I listados na Tabela 1 em 100 mL de água ultrapura agitando. Conservar em alíquotas de 200 μL a −20 °C.
   2. Dissolver os compostos da mistura II listados na Tabela 1 em 20 mL de NaOH 0,1 M agitando. Conservar em alíquotas de 100 μL a −20 °C.
   3. Dissolver os compostos da mistura III listados na Tabela 1 em 1 mL de água ultrapura agitando. Conservar em alíquotas de 10 μL a 4 °C.
   4. Dissolver o composto da mistura IV indicado na Tabela 1 em 1 mL de água ultrapura agitando. Conservar em alíquotas de 10 μL a −20 °C.
   5. Dissolver os compostos listados na Tabela 2 inicialmente em 15 mL de água ultrapura agitando. Ajustar o pH para 7,0 com algumas gotas de NaOH 0,1 M e ajustar o volume final para 20 mL usando água ultrapura. Conservar em alíquotas de 1 ml a −20 °C.
   6. Dissolver os compostos indicados no quadro 3 em 90 ml de água ultrapura numa placa quente a 50 °C enquanto agita. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 0,1 M e, em seguida, ajustar o volume final para 100 mL usando água ultrapura. Conservar em alíquotas de 5 ml a -20 °C.
2. Faça o estoque de partida sempre dissolvendo os compostos da Tabela 4 em 70 mL de água ultrapura enquanto agita.
3. À calção inicial fresca, adicionar por ordem as seguintes misturas: 200 μL de caldo Mix I (Quadro 1), 80 μL de stock Mix II (Quadro 1), 10 μL de stock Mix III (Quadro 1), 10 μL de stock Mix IV (Quadro 2), 1 ml de stock de vitaminas (Tabela 3) e 5 mL de stock de aminoácidos (Tabela 4).
4. Uma vez adicionados os estoques, ajustar o volume final para 100 mL adicionando 30 mL de água ultrapura ao copo.
5. Completar o MDL com compostos da Tabela 4. Uma vez misturado completamente, filtrar-esterilizar e armazenar a 4 °C por um máximo de 2 semanas.

2. Cultivo do biofilme de S. pneumoniae

1. Preparar o meio RP-10 misturando 445 mL de RPMI 1640 com 50 mL de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor e 5 mL de penicilina/estreptomicina a 10.000 U/mL e 10.000 μg/mL, respectivamente.
2. Cultivar a linhagem celular do carcinoma mucoepidermóide NCI-H292 (H292). Adicionar as células de um frasco para injetáveis comprado a 5 ml de meio RP-10 num balão T-25 tratado com cultura de tecidos. Incubar a 37 °C/5% CO₂ por 3-5 dias até atingir 100% de confluência.
3. Verificar as células ao microscópio de luz com aumento de 10x para avaliar a confluência.
   NOTA: Quando todas as células estão em contato com outras células e não há lacunas entre elas, então a confluência desejada de 100% é alcançada.
4. Lavar as células 2x em 5 mL de PBS à temperatura ambiente. Certifique-se de que o tampão está isento de cálcio para evitar a quelação do EDTA na etapa seguinte.
5. Adicionar 1 ml de tripsina-EDTA ao balão e incubar a 37 °C/5% CO₂ durante 5-10 min até que as células se desprendam. Neutralizar com 4 mL de meio RP-10. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo e transfira para um tubo cônico de 50 mL.
6. Adicionar 500 μL da suspensão celular por poço a uma placa de 24 poços tratada com cultura de tecidos. De um frasco T-25 confluente, esperar 2 × 10 6-4 × 10⁶ células/mL.
7. No dia seguinte, verifique as células sob um microscópio de luz para certificar-se de que estão confluentes, como no passo 2.3. Se não estiverem, incube por mais tempo.
8. Uma vez que as células H292 estejam 100% confluentes na placa de 24 poços, lave suavemente as células 3x com 1 mL de PBS à temperatura ambiente para garantir que nenhum meio contendo antibióticos ou detritos permaneça.
9. Após lavar as células, adicionar 250 μL/poço de paraformaldeído a 4% para fixar as células. Incubar durante 1 h no gelo ou durante a noite a 4 °C.
10. Na noite anterior à fixação celular, estriar a cepa de interesse de S. pneumoniae em placas de ágar sangue e incubar durante a noite a 37 °C/5% CO₂.
    NOTA: Os dados aqui apresentados são com as seguintes cepas de S. pneumoniae obtidas via troca colaborativa: sorotipo 19F otite média isolado EF3030 24, sorotipo clássico 2 Avery cepa D39²⁵ e sorotipo 4 bacteremia isolado TIGR4²⁶. As cepas também estão disponíveis em coleções públicas referenciadas na Tabela de Materiais.
11. Preparar MDL mais oxirase (0,15 U/mL) adicionando 100 μL de oxirase (30 U/mL) a 20 mL de MDL.
    NOTA: A oxirase é utilizada para eliminar oxigênio e permitir o crescimento eficiente de S. pneumoniae em cultura líquida²⁷.
12. Inocular as bactérias da placa em MDL + oxirase fresca, lavando as bactérias da placa adicionando 1 mL de MDL + oxirase e levantando suavemente as colônias bacterianas usando o lado de uma ponta de pipeta de 1 mL, tomando cuidado para não raspar o ágar. Alternativamente, use uma alça de inoculação para levantar as bactérias e inocular-as em um tubo contendo 1 mL de MDL + oxirase.
13. Diluir as bactérias em MDL + oxirase para um OD_{inicial de 600} de 0,05.
14. Cultivar as bactérias em um tubo cônico de 50 mL frouxamente tampado a 37 °C/5% CO 2 até que um OD₆₀₀ de 0,2 seja atingido (isso levará entre_2-5 h). Verifique o OD₆₀₀ a cada hora para garantir que o OD não exceda 0,2.
15. Uma vez que a DO tenha atingido 0,2, vórtex o tubo de cultura bacteriana. Semeando 0,5 mL da bactéria nas células H292 fixas e adicionando mais 0,5 mL de meio MDL + oxirase por poço. Adicionar 1 mL de MDL + oxirase aos poços controle sem bactérias. Incubar a placa durante 48 h a 34 °C/5% CO₂.
    NOTA: O crescimento a 34 °C é usado para mimetizar mais de perto a temperatura mais baixa na nasofaringe²¹.
16. A cada 12 h após a semeadura inicial, remova suavemente 0,5 mL do meio e reabasteça com 0,5 mL de MDL fresco + oxirase. Tenha cuidado para não interromper o biofilme em formação. Verifique o fundo da placa para biofilme e procure aumentar a nebulosidade com o passar do tempo devido ao crescimento do biofilme. Para controlar a contaminação, verifique os poços sem bactérias para garantir que os poços de controle permaneçam limpos.
17. Às 48 h após a inoculação, retire o sobrenadante e lave 2x muito suavemente com 1 mL de PBS. Ressuspender em 1 mL de MDL fresco e pipetar para cima e para baixo vigorosamente para levantar o biofilme. Para cada cepa bacteriana, agrupe as bactérias de todos os poços em um tubo cônico de 50 mL. Misture bem inclinando suavemente o tubo bem tampado para cima e para baixo várias vezes.
18. Ao tubo cônico de 50 mL, adicionar 40% de glicerol em CDM em volumes iguais para obter uma suspensão bacteriana com concentração final de 20% de glicerol. Aliquota 1 mL em tubos de microcentrífuga, congele rapidamente em gelo seco e economize a -80 °C.
19. Antes do uso, enumerar as bactérias descongelando uma alíquota no gelo, girando o tubo a 1.700 × g por 5 min, removendo o sobrenadante, ressuspendendo o pellet em 1 mL de PBS e plaqueando diluições seriadas em placas de ágar sangue²⁸.
20. Cultivar as placas de ágar durante a noite a 37 °C/5% CO₂ e contar as colónias em diluições relevantes para obter a concentração bacteriana em unidades formadoras de colónias (UFC)/ml.
    NOTA: Recomenda-se enumerar as bactérias nos estoques pelo menos um dia após o congelamento ou mais tarde, pois há uma queda na viabilidade bacteriana dentro das primeiras 24 h. As alíquotas congeladas armazenadas podem ser usadas para infecção subsequente de camundongos por no máximo 2 meses.

3. Inoculação intranasal de camundongos com S. pneumoniae cultivada em biofilme

1. Compre ratos e use na idade desejada.
   NOTA: Camundongos com idade entre 3-4 meses de idade são preferidos para modelar hospedeiros jovens, e camundongos com idade entre 21-24 meses podem ser usados para modelar indivíduos idosos >65 anos de idade²⁹. Os dados aqui apresentados são com camundongos machos C57BL/6.
2. Descongele as alíquotas bacterianas cultivadas em biofilme no gelo e gire a 1.700 × g por 5 min. Retire e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem interromper o pellet, lave as bactérias ressuspendendo o pellet em 1 mL de PBS e gire novamente a 1.700 × g por 5 min. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet no volume necessário para atingir a concentração desejada (almejar 5 ×^{10 6} UFC/10 μL para inoculação intranasal). Confirmar as quantidades de bactérias administradas plaqueando o inóculo preparado em placas de ágar sangue como na etapa 2.19.
3. Inocular os camundongos por via intranasal com 5 × 10⁶ UFC pipetando 5 μL do inóculo diluído em cada naris. Certifique-se de segurar os ratos firmemente, estabilizando a cabeça, até que o volume seja inalado (normalmente dentro de segundos após pipetar o volume nas narinas). Realizar esta etapa na ausência de anestesia para evitar aspiração pulmonar do inóculo.

4. Infecção viral pelo vírus influenza A (IAV)

1. Às 48 h após a inoculação intranasal com S. pneumoniae, descongelar a cepa IAV de interesse no gelo.
   NOTA: Os dados aqui apresentados são com uma cepa adaptada de camundongo do vírus influenza A A/PR/8/34 H1N1 que foi obtida via troca colaborativa³⁰.
2. Uma vez descongelado o vírus, diluir o vírus em PBS até a concentração desejada; visam 20 unidades formadoras de placa (UFP)/50 μL para infecção intratraqueal e 200 UFP/10 μL para infecção intranasal. Para grupos infectados e somente com bactérias, use PBS para inocular os camundongos.
3. Coloque lubrificante oftálmico nos olhos dos ratos antes da anestesia. Anestesiar os camundongos com isoflurano a 5% e confirmar a anestesia com pinça firme dos dedos.
4. Uma vez anestesiado o animal, retire-o da câmara de isoflurano e infecte imediatamente os camundongos anestesiados com 50 μL (20 UFP) de VAI intratraquealmente usando pinça romba para puxar a língua para fora da boca e pipetando o volume de líquido pela traqueia.
5. Coloque os ratos em uma gaiola separada e monitore até a recuperação completa (eles são capazes de manter a decúbito esternal [capaz de deitar ereto no peito]).
6. Após a recuperação, inocular imediatamente os camundongos intranasalmente com 10 μL (200 UFP) de IAV usando o método de inoculação na etapa 3.3.
7. Camundongos domésticos que sofreram infecção bacteriana e viral única ou dupla com o mesmo grupo de infecção e os separam dos outros grupos.

5. Monitorando os camundongos quanto aos sintomas da doença

1. Monitore os camundongos diariamente por pelo menos 10 dias e pontue cegamente para sinais de doença da seguinte maneira:
   1. Escore igual ou inferior para perda de peso: 0 = 5% ou menos; 1 = 5%-10%; 2 = 10%-15%; 3 = 20% ou mais. Eutanasiar os camundongos usando inalação de CO₂ quando o escore de perda de peso estiver em 3.
   2. Escore da seguinte forma para atividade: 0 = normal/ativo; 1 = movimento, mas ligeiramente diminuído; 2 = diminuído; 3 = diminuído gravemente/letárgico (só se move se tocado), 4 = coma/imóvel. Eutanasiar os ratos quando a pontuação de atividade estiver em 3.
   3. Escore da seguinte forma para postura: 0 = sem palpite (normal); 1 = postura levemente curvada; 2 = palpite severo. Eutanasiar os camundongos quando o escore postural estiver em 2.
   4. Escore igual para os olhos: 0 = normal; 1 = protrusão; 1 = afundado; 1 = fechado; 1 = alta. Pode ser uma combinação. Adicione os totais para a pontuação final do olho.
   5. Escore da seguinte forma para respiração: 0 = Respiração normal; 1 = irregular ou alterado (maior/menor índice); 2 = laborioso (esforço exagerado ou ofegante). Eutanasiar os ratos quando o escore respiratório estiver em 2.
2. Com base nos critérios acima, soma-se os escores individuais para um escore clínico total de saudável (0) a extremamente doente (15). Considere que qualquer mouse que exibe uma pontuação total acima de 2 está doente. Eutanasiar humanamente todos os camundongos que apresentarem um escore total acima de 9 ou os escores indicados para cada critério e marcá-los na curva de sobrevivência.

6. Processamento de tecidos infectados para enumeração bacteriana

1. Às 48 h após a infecção por IAV, eutanasiar os camundongos.
2. Coloque o rato em decúbito dorsal. Usando etanol 70%, borrife o peito e o abdômen do camundongo para limpar o pelo. Usando pinças, aperte o pelo e a pele no meio do rato e corte o pelo com 4,5 em tesoura de dissecção para expor a área do fígado até o peito.
3. Coleta de sangue
   1. Usando tesoura de dissecção, corte suavemente na cavidade peritoneal para expor o fígado. Usando pinças, expor a veia porta hepática na parte superior do fígado, perto do diafragma. Cortar a veia porta hepática com a tesoura de dissecção. Uma vez que o sangue começa a se acumular na cavidade peritoneal, colete 10 μL de sangue usando uma micropipeta e coloque em 90 μL de solução anticoagulante (solução de EDTA 50 mM em PBS) em um tubo de microcentrífuga para plaqueamento para carga bacteriana.
   2. Use uma micropipeta P-1000 para coletar o restante do sangue, coloque-o em um tubo de coleta de sangue e centrifugue a 7.600 × g por 2 min para coletar o soro. Guarde os soros em tubos de microcentrífuga a -80 °C para análise subsequente de qualquer citocina ou metabolito desejado.
4. Coleta pulmonar
   1. Usando tesoura de dissecção, faça um corte nas laterais da caixa torácica exposta e puxe suavemente as costelas para cima em direção à cabeça do mouse para expor o coração. Insira uma agulha de 25 G acoplada a uma seringa de 10 mL pré-cheia com PBS no ventrículo direito e comece a perfundir lentamente. Procure clareamento dos pulmões como indicador de perfusão bem-sucedida. Lave lentamente para evitar a quebra do tecido pulmonar.
   2. Levante o coração com a pinça e faça um corte para separar os pulmões e o coração. Uma vez separado, pegue todos os lóbulos do pulmão com a pinça e enxágue em um prato com PBS estéril para remover qualquer sangue residual. Em uma placa de Petri, pique os pulmões em pequenos pedaços e misture bem. Remova metade da mistura pulmonar para determinação da UFC bacteriana ou da UFP viral e coloque-a em um tubo de fundo redondo de 15 mL pré-preenchido com 0,5 mL de PBS para homogeneização.
      NOTA: É importante não tomar lobos diferentes do mesmo pulmão para as várias avaliações. Em vez disso, todos os lóbulos devem ser picados, bem misturados e analisados igualmente para as diferentes avaliações.
   3. Remova a outra metade do pulmão para citometria de fluxo (seção 7 abaixo) e coloque-a em uma placa de 24 poços não tratada com cultura de tecidos, com cada poço pré-preenchido com 0,5 mL de RP-10. Deixar à temperatura ambiente até ao processamento.
5. Coleção Nasofaringe
   1. No pescoço, use a tesoura de dissecção para cortar o pelo e, em seguida, cortar o músculo e expor a traqueia.
      NOTA: A traqueia é uma estrutura semelhante a um tubo localizada sob o músculo.
   2. Coloque pequenas pinças sob a traqueia a uma distância de 1 cm da mandíbula do rato para estabilizá-la. Com tesoura de dissecção, faça suavemente uma fenda de 0,1 cm na porção anterior da traqueia, evitando cortar completamente a traqueia.
   3. Prepare uma seringa de 1 mL preenchida com 0,5 mL de PBS com tubo de 0,58 mm acoplado a uma agulha de 25 G. Coletar a lavagem nasal inserindo a tubulação na traqueia indo para cima em direção à nasofaringe. Uma vez que a resistência é sentida entrando na cavidade nasal, coloque um tubo de microcentrífuga no nariz e lave lentamente o PBS através da traqueia para coletar a lavagem nasal.
   4. Coloque o mouse em decúbito ventral. Borrife a cabeça do rato com etanol. Use tesoura de dissecção para cortar o pelo e almofada mistáquica para expor o osso da cabeça do rato.
   5. Usando a tesoura de dissecção, faça um corte de 1 cm nas laterais da mandíbula e entre os olhos. Usando pinças, puxe lentamente os ossos faciais para longe do corpo para expor a cavidade nasal.
   6. Use pinça para remover suavemente o tecido nasal e coloque-o em um tubo de fundo redondo pré-preenchido com 0,5 mL de PBS para homogeneização.
6. Para homogeneizar o tecido coletado, primeiro limpe a sonda homogeneizadora, colocando-a em etanol 70% e ligando o homogeneizador a 60% de potência por 30 s. Repita o passo em água estéril por 10 s. Homogeneizar cada tecido por 1 min. Limpar a sonda homogeneizadora em água estéril entre cada amostra e em um tubo fresco de etanol 70% entre cada órgão e grupo amostral.
7. Enumeração dos números bacterianos
   1. Uma vez que todos os órgãos tenham sido colhidos e homogeneizados, diluições seriadas em placas de ágar sangue. Para calcular a UFC total, use 10 μL para placa e anote o volume final em mL para cada amostra. Plaquear as amostras de nasofaringe em placas de ágar sangue suplementadas com 3 μg/mL de gentamicina para selecionar o crescimento de S. pneumoniae enquanto inibe o crescimento de outros microrganismos que colonizam esse tecido. Incubar durante a noite a 37 °C/5% CO₂.
   2. Para enumerar as UFC bacterianas para o pulmão e nasofaringe, primeiro conte as colônias nas placas de ágar sangue. Em seguida, use a equação (1) e a equação (2) para calcular a quantidade por mL e o número total.
      Quantidade por ml = número de colónias × factor de diluição × 100 (1)
      Número total = quantidade por mL × volume total por amostra (2)
      NOTA: Na equação (1), 100 é usado para multiplicar, uma vez que 10 μL é plaqueado, o que é uma diluição de 100 vezes de 1 mL. O volume total por amostra na equação (2) é da etapa 6.7.1, que resulta no limite de detecção de 100 por órgão.
   3. Para enumerar a UFC bacteriana para bacteremia, primeiro conte as colônias nas placas de ágar sangue. Em seguida, use a equação (3) para determinar a quantidade por mL de sangue.
      Quantidade por mL de sangue = número de colônias × fator de diluição × 100 × 10 (3)
      NOTA: Na equação (3), 100 é usado como 10 μL é plaqueado, que é uma diluição de 100 vezes de 1 mL, e 10 indica uma diluição de 1:10 do sangue em anticoagulante. Isso resulta no limite de detecção de 1.000/mL.

7. Processamento das amostras de pulmão para citometria de fluxo

1. Prepare a mídia necessária da seguinte maneira:
   1. Prepare o RP-10 conforme descrito na etapa 2.1.
   2. Preparar o tampão de digestão misturando RP-10 com 2 mg/mL de colagenase e 30 μL/mL de DNase I.
   3. Preparar tampão de lise dissolvendo 8,29 g de NH₄Cl, 1 g de NaHCO₃ e 0,038 g de EDTA em 1 L de H₂O.
   4. Preparar 10x tampão FACS misturando 450 mL de HBSS com 50 mL de FBS inativado pelo calor e 5 g de azida sódica.
   5. Preparar 1x tampão FACS diluindo 50 mL de tampão 10x FACS em 450 mL de HBSS.
2. Colher as amostras de pulmão do passo 6.4.3 e colocar numa placa de 24 poços. Adicionar 500 μL de tampão de digestão a cada poço. Incubar durante 45 min até 1 h a 37 °C/5% CO₂.
3. Pré-encher tubos cônicos de 50 mL para cada amostra com 5 mL de RP-10. Quando a incubação terminar, colocar um filtro de 100 μm na parte superior do tubo cônico de 50 mL e molhá-lo com 1 mL de RP-10.
4. Usando uma micropipeta P-1000, mova os pulmões digeridos e coloque-os no filtro. Use o êmbolo de uma seringa de 3 mL para amassar o órgão. Enxaguar 2x com 1 mL de RP-10 de cada vez.
5. Girar as amostras a 4 °C e 327 × g durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de tampão de lise. Deixe por 3 minutos para permitir a lise dos glóbulos vermelhos. Neutralizar com 5 mL de RP-10.
6. Girar as amostras a 4 °C e 327 × g durante 5 min. Aspirar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 1 mL de RP-10 e colher 10 μL para contagem das amostras.
7. Girar as amostras a 4 °C e 327 × g durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em RP-10 a 2 × 10 6-4 × 10⁶ células/mL. Adicionar 60 μL de cada amostra em uma placa de 96 poços para corar para os tipos celulares desejados²³ listados na etapa 7.9, Tabela 5 e Tabela 6.
8. Gire a placa a 4 °C e 327 × g por 5 min.
9. Enquanto isso, prepare as misturas mestras de anticorpos, florescente menos um (FMOs) e controles de coloração única com os anticorpos desejados. Para coloração para leucócitos polimorfonucleares (PMNs), macrófagos, monócitos, células dendríticas e células T, utilizar os anticorpos e diluições finais listados na Tabela 5 e Tabela 6. Use um volume total de 100 μL/poço da mistura de anticorpos. Siga as diluições indicadas nos quadros para determinar o volume adequado da mistura principal e os anticorpos individuais necessários.
10. Quando o spin estiver feito (passo 7.8), decantar o sobrenadante, ressuspender os pellets em 100 μL das misturas de anticorpos, FMOs ou controles de coloração única e incubar no gelo por 30 min no escuro.
11. Lavar as células 2x adicionando 150 μL de tampão FACS aos poços e girando a placa a 4 °C e 327 × g durante 5 min.
12. Quando o spin estiver feito, decantar o sobrenadante, ressuspender os pellets em 100 μL de tampão de fixação e incubar no gelo por 20 min.
13. Lavar as células 2x adicionando 150 μL de tampão FACS aos poços e girando a placa a 4 °C e 327 × g durante 5 min.
14. Prepare tubos FACS marcados com 200 μL de tampão FACS. Ressuspender os pellets em 150 μL de tampão FACS. Filtrar individualmente cada amostra no tubo FACS correspondente utilizando um filtro de 100 μm. Manter no gelo ou a 4 °C e protegido da luz até estar pronto para analisar.
15. Analise as células usando um citômetro de fluxo.

8. Ensaio de placa para enumeração do IAV

1. Prepare a mídia necessária da seguinte maneira:
   1. Preparar o meio de infecção dissolvendo 2,5 g de albumina de soro bovino (BSA) em 40 mL de DMEM agitando a 37 °C por 10-20 min até dissolver. Filtrar-esterilizar em 460 mL de DMEM.
   2. Preparar 2,4% de celulose microcristalina dissolvendo 1,2 mg de celulose microcristalina em 50 mL de H₂O. Autoclave no ajuste líquido e armazenar à temperatura ambiente.
   3. Preparar 5% de BSA DMEM dissolvendo 2,5 g de BSA em 40 mL de DMEM enquanto agita a 37°C por 10-20 min. Adicione os 10 mL restantes de DMEM para um volume final de 50 mL. Filtrar-esterilizar e armazenar a 4 °C.
   4. Preparar 2x MEM/0,5% BSA misturando 1 mL de 5% BSA DMEM com 9 mL de 2x MEM.
   5. Preparar meio de cobertura de baixa viscosidade misturando uma proporção de 1:1 de 2,4% de celulose microcristalina e 2x MEM/0,5% BSA com 1 mg/mL de TPCK (inibidor da quimotripsina) tripsina.
   6. Preparar EMEM/FBS a 10% misturando 450 mL de Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) com 50 mL de FBS inativado pelo calor.
2. Cultivar a linhagem celular de rim canino Madin-Darby (MDCK). Adicionar as células de um frasco para injetáveis comprado a 5 ml de EMEM/FBS a 10% num balão T-25 tratado com cultura de tecidos. Incubar por 3-5 dias a 37 °C/5% CO₂ até que as células atinjam 100% de confluência. Verifique se há confluência como na etapa 2.3.
3. Retire e descarte o meio de cultura e enxágue 2x com 5 mL de PBS à temperatura ambiente. Adicionar 1 ml de tripsina-EDTA ao balão e incubar a 37 °C/ 5% CO₂ durante 10-15 minutos até que as células se desprendam. Uma vez levantado, neutralizar com 4mL de EMEM/FBS a 10% para obter uma suspensão celular a 2 × 10⁵ células/mL.
4. Semeando as células MDCK em uma placa de cultura de tecido de 12 poços adicionando 1 mL de células ressuspensas por poço (a 2 × 10^{a 5} células/poço) 1 dia antes de iniciar o ensaio de placa.
   NOTA: Certifique-se de que as células atinjam 100% de confluência antes do uso e incubem por mais tempo, se necessário, para atingir a confluência.
5. Para utilização como normas, efectuar diluições em série de 10 vezes (10^6-10 1) de existências IAV (de um título conhecido) no meio de infecção indicado no passo 8.1.1. Completar 1,2 ml de cada diluição para testar em triplicata.
6. Descongelar o órgão homogeneiza no gelo. Gire para baixo em uma centrífuga de mesa a 2.000 × g e colete o sobrenadante claro.
7. Repetir o passo 8.5, mas com o sobrenadante das amostras do passo 8.6.
8. Aspirar o meio das células e lavar 2x com 1 mL de PBS para remover todo o SFB.
9. Adicionar 300 μL de cada diluição padrão ou amostra diluída em série suavemente ao longo do lado de cada poço, começando pela diluição mais elevada até à mais baixa, e fazê-lo em triplicata.
10. Colocar as placas na incubadora a 37 °C/5% CO₂, agitando a placa a cada 10 min por um total de 50 min. Certifique-se de colocá-los na incubadora e não empilha-los.
11. Após os 50 min, lavar as células 2x com 1 mL de PBS.
12. Adicionar 2 mL do meio de cobertura de baixa viscosidade em cada poço, exceto nos poços de menor diluição e sem vírus; a estes, adicionar meio de infecção e tripsina.
13. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 °C/5% CO 2 por_2-4 dias para obter placas que possam ser visualizadas a olho nu.
14. Lave as placas adicionando 2 mL de PBS em cada poço rapidamente do lado e agite suavemente para suspender o meio de sobreposição de baixa viscosidade assentado.
15. Descarte todo o volume de líquido no poço pipetando suavemente o meio.
16. Repita a lavagem mais uma vez com 2 mL de PBS em cada poço e, em seguida, descarte todo o volume de líquido por pipetagem suave.
17. Para fixar as placas, adicione 500 μL de paraformaldeído a 4% em cada poço, agite e deixe descansar por 30 min.
18. Lave lentamente o lado com 1 mL de PBS; Em seguida, descarte suavemente o líquido.
19. Adicionar 500 μL de violeta de cristal a 1% (diluído em água) a cada poço para cobrir a monocamada celular. Incubar por 5 min.
20. Lavar com 1 mL de água da torneira. Certifique-se de descartar todo o líquido no poço por pipetagem suave. Coloque o prato de cabeça para baixo em uma almofada de fraldas para secar durante a noite.
21. Conte as placas visualmente e salve as imagens em qualquer imageador disponível.

S. pneumoniae cultivada com biofilme (Figura 1A) foi usada para infectar camundongos (Figura 1B) usando um pequeno inóculo de 10 μL administrado intranasalmente a camundongos não anestesiados. Esse inóculo de pequeno volume resulta em carreamento pneumocócico consistente restrito à nasofaringe (Figura 2A, grupos +sp), evitando disseminação sistêmica (grupos Figura 2B,C, +sp). Dois dias após a inoculação intranasal, os camundongos foram infectados com um vírus influenza A A/PR/8/34 (IAV) adaptado à múrbia22,30, administrado tanto por via intranasal quanto intratraqueal para obter uma entrega consistente de quantidades específicas para a nasofaringe e os pulmões 23.

Aqui, o modelo foi usado para comparar o curso da doença após infecção viral em camundongos desafiados intranasalmente com diferentes cepas de S. pneumoniae, incluindo TIGR4 e D39, que são cepas invasivas que resultam em pneumonia que evolui para bacteremia, e EF3030, que é uma cepa de otite média 21,24,25,26,31. A apresentação da doença em camundongos co-infectados com S. pneumoniae/IAV foi dependente da cepa bacteriana (Figura 2). Embora não tenha havido diferença significativa no número bacteriano da nasofaringe (Figura 2A) entre nenhuma das cepas, S. pneumoniae TIGR4 e D39, mas não EF3030, disseminaram-se para os pulmões por 48 h após a infecção pelo IAV (Figura 2B). Quarenta por cento dos camundongos infectados intranasalmente com S. pneumoniae TIGR4 apresentaram disseminação bacteriana para os pulmões, e destes, metade deles tornou-se bacterêmica (Figura 2C), consistente com achados anteriores23.

Camundongos infectados intranasalmente com S. pneumoniae D39 mostraram disseminação mais eficiente, pois a disseminação para os pulmões foi observada em 100% dos camundongos co-infectados (Figura 2B). Semelhante ao S. pneumoniae TIGR4, metade deles apresentou bacteremia (Figura 2C). No rastreamento da sobrevida global, independentemente da cepa bacteriana, a taxa de sobrevivência dos camundongos co-infectados foi significativamente menor do que os camundongos desafiados isoladamente com S. pneumoniae isoladamente para todas as cepas testadas (Figura 2D). Em comparação com os camundongos controle desafiados apenas com IAV, os camundongos intranasalmente infectados com S. pneumoniae TIGR4 e D39, mas não EF3030, exibiram taxas aceleradas de doença. No dia 2 pós-infecção com IAV, 30% (D39) e 20% (TIGR4) dos camundongos haviam sucumbido, enquanto os grupos controle somente com IAV não começaram a sucumbir até o dia 5 pós-desafio (Figura 2D). Os camundongos co-infectados com S. pneumoniae EF3030 e IAV apresentaram sintomas tardios, mais semelhantes aos controles somente com IAV (Figura 2D). Esses achados demonstram que o modelo de co-infecção resulta em doença em camundongos jovens saudáveis que é dependente de cepa bacteriana, o que o torna ideal para explorar os fatores bacterianos necessários em cada etapa da progressão da doença.

Esse modelo foi usado para avaliar a presença de várias células imunes nos pulmões (tipos celulares e estratégia de gating na Figura 3) após infecção por IAV em camundongos inoculados intranasalmente com diferentes cepas de S. pneumoniae. As cepas bacterianas D39 e TIGR4, que se dispersaram nos pulmões após a infecção pelo IAV, provocaram um aumento significativo acima do valor basal (não infectado) no influxo de células imunes inflamatórias da circulação, como neutrófilos (PMNs) e monócitos, enquanto EF3030 não o fez (Figura 4A-C). A infecção isolada por IAV provocou um aumento significativo acima da linha de base no influxo de células imunes importantes para a defesa do hospedeiro contra a infecção viral, como as células NK e as células T gama-delta (Figura 4A-C). Essas respostas antivirais foram significativamente embotadas em camundongos infectados intranasalmente com S. pneumoniae antes do desafio viral (Figura 4A-C). Isso é consistente com estudos anteriores avaliando as respostas de citocinas que descobriram que o carreamento de S. pneumoniae diminuiu a produção de interferons tipo I e prejudicou a capacidade do hospedeiro de controlar as cargas de IAV nos pulmões23. Esses achados demonstram que o modelo de coinfecção pode ser usado para estudar como as respostas imunes mudam em infecções mono versus polimicrobianas.

Esse modelo também foi usado para avaliar o efeito do envelhecimento no curso da doença após a infecção por IAV em camundongos infectados intranasalmente com S. pneumoniae TIGR4. Em camundongos isolados, os títulos virais não variaram entre as coortes jovens e idosas (Figura 5A)23. Como em estudos anteriores23, camundongos velhos apresentaram sinais de doença mais precoces e significativamente mais graves em comparação com seus colegas jovens, como demonstrado pelos escores clínicos mais altos (Figura 5B). Consistente com os sintomas da doença, camundongos velhos inoculados com S. pneumoniae começaram a morrer mais rapidamente dentro de 24 h após a infecção por IAV, e todos sucumbiram à doença, enquanto os controles jovens sobreviveram à infecção em uma taxa significativamente maior (33%) (Figura 5C). Esses achados demonstram que o modelo de coinfecção pode ser usado para detectar doença mais grave em hospedeiros vulneráveis, tornando-o ideal para explorar fatores do hospedeiro que conferem resistência ou suscetibilidade à coinfecção.

Figura 1: Linha do tempo da coinfecção e processamento de órgãos para a avaliação do influxo de células imunes e carga de patógenos . (A) Streptococcus pneumoniae são cultivados em biofilmes. (B) Camundongos são inoculados intranasalmente com 5 × 106 UFC da cepa indicada de S. pneumoniae cultivada com biofilme para estabelecer carreamento nasofaríngeo ou não tratada. Quarenta e oito horas depois, os camundongos são tratados com PBS ou recebem 200 UFP do vírus influenza A PR8 por via intranasal e 20 por via intratraqueal. Os camundongos são monitorados ao longo do tempo quanto aos escores clínicos da doença e à sobrevida. (C) Às 48 h após a infecção por IAV, são avaliadas UFC bacterianas ou UFP virais nos diferentes órgãos ou influxo de células imunes nos pulmões. Abreviaturas: UFC = unidades formadoras de colônias; UFP = unidades formadoras de placa; IAV = vírus influenza A PR8; TI = intratraqueal; NP = nasofaríngeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A dupla infecção intranasal/intratraqueal por IAV de camundongos inoculados com S. pneumoniae leva à disseminação bacteriana e doença dependente da cepa bacteriana. Camundongos C57BL/6 (B6) machos jovens (10-12 semanas de idade) foram infectados como na Figura 1. O número de bactérias na nasofaringe (A), (B) pulmões e (C) sangue foi determinado 48 h após a infecção por IAV. (B,C) As porcentagens denotam a fração de camundongos que exibiu disseminação. (D) A sobrevida foi monitorada por 10 dias após a infecção por IAV. Dados agrupados de (A,B) n = 5, (C) n = 11 e (D) n = 6 camundongos por grupo são mostrados. Cada círculo corresponde a um mouse, e as linhas tracejadas indicam o limite de detecção. (A-C)*, indica diferença significativa (p < 0,05) entre os grupos indicados, conforme determinado pelo teste de Kruskal-Wallis. (D) *, indica uma diferença significativa (p < 0,05) entre camundongos +sp e Co-inf por cepa bacteriana, conforme determinado pelo teste log-rank (Mantel-Cox). Abreviações: +sp = camundongos infectados intranasalmente com bactérias utilizando apenas a cepa indicada; Co-inf = camundongos infectados por bactérias que estavam infectados com IAV; IAV = camundongos que receberam o vírus influenza A; UFC = unidades formadoras de colônias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Estratégia de confinamento de células imunes. Os pulmões foram colhidos e o influxo de células imunes foi determinado por citometria de fluxo. A estratégia de gating representativa dos diferentes tipos celulares é mostrada. (A) CD45+, células únicas vivas foram acopladas e as porcentagens de (B) PMNs (Ly6G+, CD11b+), macrófagos (Ly6G-, Ly6C-, F480+) e monócitos (Ly6G-, Ly6C+), (C) DCs (Ly6G-, CD11c+) e células NK (NK1.1+, CD3-), (D) TCR-γΔ e CD8 (CD8+, TCRβ+) e CD4 (CD4+, TCRβ+ ) Células T foram determinadas. Abreviações: SSC-A = área do pico de dispersão lateral; FSC-A = área do pico de dispersão anterior; FSC-H = altura do pico de dispersão anterior; SSC-W = largura do pico de dispersão lateral; L/D = vivo/morto; FMO = fluorescente menos um; NK = assassino natural; PMN = leucócitos polimorfonucleares; DC = célula dendrítica; TCR = receptor de células T. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: As respostas imunes pulmonares são bacterianas-dependentes. Camundongos jovens (10-12 semanas de idade) machos C57BL/6 não foram infectados, inoculados isoladamente com a cepa indicada de Streptococcus pneumoniae (+sp), desafiados isoladamente com IAV (IAV) ou coinfectados com S. pneumoniae e IAV (Co-inf). Quarenta e oito horas após a infecção pelo IAV (ver o desenho experimental na Figura 1), os pulmões foram colhidos e o influxo de células imunes foi determinado por citometria de fluxo seguindo a estratégia de gating na Figura 3. (A) As porcentagens médias de cada tipo de célula indicado dentro da porta CD45 são exibidas para todos os grupos de tratamento no mapa de calor. (B) Gráficos de pontos representativos dos tipos celulares que apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos são mostrados para cada grupo de camundongos. (C) As porcentagens dos tipos de células imunes indicadas são mostradas. Cada círculo corresponde a um rato. (A,C) Dados agrupados de n = 5 camundongos por grupo são mostrados. *, indica diferença significativa (p < 0,05) entre Co-inf e não infectados; $, indica um significativo entre IAV e não infectados; #, indica uma diferença significativa entre Co-inf e IAV isoladamente. Diferenças significativas entre os grupos desafio para cada tipo celular foram determinadas por ANOVA seguida pelo teste de Tukey. Abreviações: NK = natural killer; PMN = leucócitos polimorfonucleares; DC = célula dendrítica; TCR = receptor de células T; IAV = vírus influenza A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Envelhecimento e aumento da suscetibilidade do hospedeiro à coinfecção IAV/Streptococcus pneumoniae . Camundongos machos C57BL/6 jovens (10-12 semanas) e com idade (21-22 meses) foram coinfectados com S. pneumoniae TIGR4 i.n. e IAV i.n. e i.t. (como na Figura 1) ou desafiados isoladamente com IAV isoladamente. (A) Os títulos virais foram determinados 48 h depois. Os asteriscos indicam significância estatística (p < 0,05) determinada pelo teste t de Student. Os dados são agrupados a partir de n = 4 camundongos por grupo. (B) O escore clínico e (C) a sobrevida foram monitorados ao longo do tempo. (B) A média ± MEV agrupada de n = 6 camundongos por grupo é mostrada. Os asteriscos indicam significância estatística (p < 0,05) entre os camundongos jovens versus velhos no momento indicado, conforme determinado pelo teste de Mann-Whitney. (C) Os dados são agrupados a partir de n = 6 camundongos por grupo. Os asteriscos indicam significância estatística (p < 0,05) entre camundongos jovens versus velhos, conforme determinado pelo teste log-rank (Mantel-Cox). Abreviações: IAV = vírus influenza A; i.n. = intranasal; i.t. = intratraqueal; EPM = erro padrão da média. A Figura 5A é reimpressa com permissão de Joma et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Quadro 1: Misturar existências I, II, III e IV para MDL. Abreviação: MDL = mídia quimicamente definida.

Tabela 2: Estoque de mix vitamínico para MDL. Abreviação: MDL = mídia quimicamente definida.

Tabela 3: Estoque de aminoácidos para MDL. Abreviação: MDL = mídia quimicamente definida.

Quadro 4: Existências iniciais e suplementos finais para o MDL. Abreviação: MDL = mídia quimicamente definida.

Tabela 5: Painel de anticorpos 1.

Tabela 6: Painel de anticorpos 2.

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.