Microengenharia 3D Colágeno Hidrogéis com Alinhamento de Fibras de Longo Alcance

Resumo

Este protocolo demonstra o uso de um canal microfluídico com geometria variável ao longo da direção do fluxo de fluido para gerar deformação extensional (alongamento) para alinhar as fibras em um hidrogel de colágeno 3D (<250 μm de espessura). O alinhamento resultante se estende por vários milímetros e é influenciado pela taxa de deformação extensional.

Resumo

As fibras alinhadas de colágeno I (COL1) guiam a motilidade das células tumorais, influenciam a morfologia das células endoteliais, controlam a diferenciação das células-tronco e são uma marca registrada dos tecidos cardíaco e musculoesquelético. Para estudar a resposta celular a microambientes alinhados in vitro, vários protocolos foram desenvolvidos para gerar matrizes de COL1 com alinhamento de fibras definido, incluindo métodos magnéticos, mecânicos, baseados em células e microfluídicos. Destas, as abordagens microfluídicas oferecem recursos avançados, como controle preciso sobre os fluxos de fluidos e o microambiente celular. No entanto, as abordagens microfluídicas para gerar matrizes alinhadas de COL1 para plataformas avançadas de cultura in vitro têm sido limitadas a "esteiras" finas (<40 μm de espessura) de fibras de COL1 que se estendem por distâncias inferiores a 500 μm e não são propícias a aplicações de cultura celular 3D. Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar matrizes 3D de COL1 (130-250 μm de espessura) com regiões de alinhamento de fibras definidas em escala milimétrica em um dispositivo microfluídico. Esta plataforma fornece recursos avançados de cultura de células para modelar microambientes de tecidos estruturados, fornecendo acesso direto à matriz micro-projetada para cultura de células.

Introdução

As células residem em uma complexa rede fibrosa 3D denominada matriz extracelular (MEC), cuja maior parte é composta pela proteína estrutural colágeno tipo I (COL1)^1,2. As propriedades biofísicas da MEC fornecem pistas de orientação às células e, em resposta, as células remodelam a microarquitetura da MEC ^3,4,5. Essas interações recíprocas célula-matriz podem dar origem a domínios alinhados das fibras COL1⁶ que promovem angiogênese e invasão celular no ambiente tumoral

Protocolo

1. Fabricação do canal de duas peças e da base da plataforma modular

NOTA: O canal microfluídico é construído usando duas partes — o "recorte" do canal microfluídico, que é cortado a partir de uma folha de polidimetil siloxano (PDMS) de espessura definida, e a tampa do canal, que se liga reversivelmente ao recorte e forma o canal. O canal é circundado por uma estrutura de poli(metacrilato de metila) (PMMA) que atuará como um reservatório de meio (Figura 1). O quadro de PMMA também pode ser usado para travar magneticamente módulos especializados para maior funcionalidade.

1. Canais de cor....

Resultados

Quando uma solução de COL1 automontável flui através de um canal com área de secção transversal decrescente, a velocidade de fluxo (v x) da solução de COL1 aumenta localmente em uma magnitude, ∂v x, ao longo do comprimento da constrição entre os dois segmentos (∂x), resultando em uma taxa de deformação extensional (ε̇) onde ε̇ = ∂v x/∂_x. A taxa de deformação extensional pode ser calculada a partir da velocidade do fluido, que é medida por meio da velocimetria por imagem de partículas (PIV.......

Discussão

Protocolos para geração de matrizes de COL1 com fibras alinhadas têm sido descritos utilizando métodos magnéticos, aplicação direta de deformações mecânicas e técnicas^{microfluídicas47}. Abordagens microfluídicas são comumente usadas para criar sistemas microfisiológicos devido às suas características de fluxo e transporte bem definidas, que permitem o controle preciso sobre o microambiente bioquímico. Uma vez que as fibras de COL1 alinhadas fornecem pistas instrutivas importantes durante processos .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(3-Aminopropil)trietoxissilano, 99% (APTES)	Sigma Aldrich	440140-100ML
20 Gauge IT Series Ponta de Dispensação Angular	Jensen Global	JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" de espessura Ímã Niquelado	KJ Magnetics	D31
3M (TC) 12X12-6-467MP	DigiKey	3M9726-ND
ACETONA ACS REAGENTE ≥ 99,5%	Signa Aldrich	179124-4L
BD-20AC LABORATÓRIO CORONA TREATER	Produtos Eletrotécnicos	12051A
Albumina de soro bovino (BSA), Fração V, 98%, grau de reagente, Alfa Aesar	VWR	AAJ64100-09
Folha de acrílico fundido transparente	McMaster-Carr	8560K181
Corning 100 mL Tripsina 10x, 2,5% Tripsina em HBSS [-] cálcio, magnésio, vermelho de fenol, Parvovírus Suíno Testado	VWR	45000-666
Condessa II Contador de Células Automatizado	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
software CT-FIRE	LOCI - Universidade de Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL	Lonza	CC-3162
Glutaraldeído 50% em solução aquosa, Grau de Reagente, Embalagem=Garrafa de HDPE, Tamanho=100 mL	VWR	VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50	Graphtec	CE LITE-50
HEPES (1 m)	Thermo Fisher Scientific	15-630-080
Borracha de Silicone de Alta Pureza .010" de Espessura, 6" X 8" Folha, 55A Durômetro	McMaster-Carr	87315K62
Veia Umbilical Humana Células endoteliais	Thermo Fisher Scientific	C0035C
Invitrogen  Mancha Azul de Tripano (0,4%)	Thermo Fisher Scientific	T10282
Isopropanol	Fisher Scientific	A4154
Cortador a laser	Full Spectrum	20x12 H-series
Microfluídica Bomba de seringa	New Era Bombas de seringa	NE-1002X
Microman E Pipettor de canal único, Gilson, Modelo M1000E	Gilson	FD10006
Sondas Moleculares Alexa Fluor 488 Faloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379
Sondas Moleculares Hoechst 33342, Tricloridrato, Trihidrato	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen	Advanced BioMatrix	5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4	VWR	70011044.00
PBS pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049.00
Solução salina tamponada com fosfato (PBS, 10x), com Triton X-100	Alfa Aesar	J63521
Folha de suporte de substituição para artesanato graphtec ROBO CC330L-20	USCUTTER	GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Seringa de Plástico 1 mL Luer Slip	Restek	22766.00
Wafer de Silício Wafer	Universitário	452
Hidróxido de Sódio, ACS, Embalagem=Garrafa de Polietileno, Tamanho=500 g	VWR	BDH9292-500G
Sylgard 184	VWR	102092-312
Thermo Scientific  Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352.00