Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Resumo

O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.

Resumo

A aneuploidia é a principal anormalidade genética que causa aborto espontâneo precoce e falha na gravidez em humanos. A maioria dos erros na segregação cromossômica que dão origem à aneuploidia ocorre durante a meiose em ovócitos, mas por que a meiose de ovócitos é propensa a erros ainda não é totalmente compreendida. Durante a divisão celular, as células evitam erros na segregação cromossômica ativando o ponto de verificação de montagem do fuso (SAC). Este mecanismo de controle baseia-se na detecção de ligações cinetócoro-microtúbulo (MT) e na detecção da tensão gerada pelas fibras do fuso. Quando os KTs são desconectados, o SAC é ativado e impede a progressão do ciclo celular. O SAC é ativado primeiramente pela MPS1 quinase, que desencadeia o recrutamento e a formação do complexo de pontos de verificação mitóticos (CCM), composto por MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1. Em seguida, o CCM se difunde no citoplasma e sequestra o CDC20, um ativador de complexo/ciclossomo promotor de anáfases (APC/C). Uma vez que os KTs se ligam aos microtúbulos e os cromossomos são alinhados na placa metafásica, o SAC é silenciado, o CDC20 é liberado e o APC/C é ativado, desencadeando a degradação da ciclina B e da securina, permitindo assim o início da anáfase. Em comparação com as células somáticas, o SAC nos oócitos não é tão eficaz porque as células podem sofrer anáfase, apesar de terem KTs desligados. Entender por que o SAC é mais permissivo e se essa permissividade é uma das causas dos erros de segregação cromossômica nos oócitos ainda precisa de mais investigação. O presente protocolo descreve as três técnicas para avaliar de forma abrangente a integridade do SAC em ovócitos de camundongos. Essas técnicas incluem o uso de nocodazol para despolimerizar MTs para avaliar a resposta do SAC, o rastreamento do silenciamento do SAC seguindo a cinética da destruição da Securin e a avaliação do recrutamento de MAD2 para KTs por imunofluorescência. Juntas, essas técnicas investigam os mecanismos necessários para produzir óvulos saudáveis, fornecendo uma avaliação completa da integridade do SAC.

Introdução

A aneuploidia, que surge de erros na segregação cromossômica, é a principal causa de abortos espontâneos precoces e está altamente ligada a erros na meiose¹. A meiose é distinta da mitose porque consiste em duas rodadas de divisão celular sem uma etapa intermediária de replicação do DNA. Na meiose I, os cromossomos homólogos se separam, enquanto as cromátides irmãs permanecem juntas. Nos ovócitos, essa etapa é propensa a erros, levando à produção de óvulos aneuploides².

Para evitar erros de segregação cromossômica, a maioria dos tipos de células ativa um mecanismo de vigilância que pausa o cic....

Protocolo

Todos os ratos utilizados nesses protocolos foram alojados e criados de acordo com o Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais da Universidade Rutgers (Protocolo 201702497) e as diretrizes do National Institutes of Health. Esses órgãos reguladores aprovaram todos os procedimentos experimentais envolvendo estudos em animais. Todos os camundongos utilizados no presente estudo foram fêmeas com FC-1 de 6-8 semanas de idade.

1. Preparação experimental

1. Antes de iniciar as avaliações do SAC, coletar oócitos de camundongos seguindo o relatório publicado anteriormente¹². Divida os ovócitos co....

Resultados

Avaliação da responsividade do SAC pelo tratamento com nocodazol
O objetivo deste experimento é avaliar a ativação e a força do SAC. Ao usar nocodazol para despolimerizar os microtúbulos fusiformes, todos os cinetocoros serão desligados, o que causará uma parada do ciclo celular mediada por SAC. No presente sistema de imagem, os oócitos controle tratados com DMSO extruderam um corpo polar por volta de 14 h após a liberação da milrinona (Figura 1, painéis superiores). Cons.......

Discussão

O ponto de verificação de montagem do fuso é um mecanismo de controle crítico durante a divisão celular projetado para evitar erros de segregação cromossômica. Ele permite que a célula tenha tempo suficiente para corrigir anexos KT-MT inadequados. A meiose em oócitos é um processo propenso a erros, onde a maior parte da segregação incorreta cromossômica ocorre durante a meiose I, levando à geração de óvulos aneuploides que são a principal causa de abortos espontâneos precoces e infertilidade em humanos^<.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
Dimetil-sulfóxido (DMSO)	Sigma	D5879
Burro-anti-coelho-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto Imaging System	Life Technologies		Microscópio
de fluorescênciaEVOS Onstage Incubator	Life Technologies		Câmara de incubadora
com fundo de vidro 96- placas de poço N 1.5 não revestido	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
cabra-anti-humano-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
Anticorpos humanos anti-ACA	incorporados	15-234	Diluição 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 equipado com uma objetiva de imersão em óleo de 63&vezes;, 1.40 NA	Leica
MgSO4· 7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nocodazol	Sigma	M1404
Paraformaldído (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
Rabbit anti- MAD2	Biolegend	924601	Diluição 1/1000; anteriormente Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Vectashield	Laboratórios de vetores	H-1000