Artigo de método

Modelagem do Desenvolvimento Cerebelar Humano In Vitro em Estrutura 2D

DOI:

10.3791/64462

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16 de setembro de 2022

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1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo explica a geração de uma monocamada 2D de células cerebelares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas para investigar os estágios iniciais do desenvolvimento cerebelar.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O desenvolvimento preciso e oportuno do cerebelo é crucial não só para a coordenação motora precisa e equilíbrio, mas também para a cognição. Além disso, a interrupção no desenvolvimento cerebelar tem sido implicada em muitos distúrbios do neurodesenvolvimento, incluindo autismo, transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) e esquizofrenia. Investigações do desenvolvimento cerebelar em humanos anteriormente só foram possíveis através de estudos post-mortem ou neuroimagem, mas esses métodos não são suficientes para entender as mudanças moleculares e celulares que ocorrem in vivo durante o desenvolvimento inicial, que é quando muitos distúrbios do neurodesenvolvimento se originam. O surgimento de técnicas para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) a partir de células somáticas e a capacidade de rediferenciar ainda mais as iPSCs em neurônios abriram o caminho para a modelagem in vitro do desenvolvimento cerebral inicial. O presente estudo fornece passos simplificados para a geração de células cerebelares para aplicações que requerem uma estrutura monocamada 2-dimensional (2D). As células cerebelares que representam os estágios iniciais de desenvolvimento são derivadas de iPSCs humanas através das seguintes etapas: primeiro, os corpos embrionários são feitos em cultura tridimensional (3D), depois são tratados com FGF2 e insulina para promover a especificação do destino cerebelar e, finalmente, são terminalmente diferenciados como uma monocamada em substratos revestidos de poli-l-ornitina (PLO) / laminina. Aos 35 dias de diferenciação, as culturas de células cerebelares derivadas de iPSC expressam marcadores cerebelares, incluindo ATOH1, PTF1α, PAX6 e KIRREL2, sugerindo que esse protocolo gera precursores neuronais cerebelares glutamatérgicos e GABAérgicos, bem como progenitores de células de Purkinje. Além disso, as células diferenciadas apresentam morfologia neuronal distinta e são positivas para marcadores de imunofluorescência de identidade neuronal, como o TUBB3. Essas células expressam moléculas de orientação axonal, incluindo semaforina-4C, plexina-B2 e neuropilina-1, e poderiam servir de modelo para investigar os mecanismos moleculares de crescimento de neuritos e conectividade sináptica. Este método gera neurônios cerebelares humanos úteis para aplicações a jusante, incluindo expressão gênica, estudos fisiológicos e morfológicos que exigem formatos de monocamada 2D.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Compreender o desenvolvimento cerebelar humano e as janelas de tempo críticas desse processo é importante não apenas para decodificar as possíveis causas dos distúrbios do neurodesenvolvimento, mas também para identificar novos alvos para a intervenção terapêutica. Modelar o desenvolvimento cerebelar humano in vitro tem sido um desafio, mas ao longo do tempo, muitos protocolos diferenciando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou iPSCs com destinos de linhagem cerebelar surgiram 1,2,3,4,5,6,7,8 . Além disso, é importante desenvolver protocolos que gerem resultados reprodutíveis, sejam relativamente simples (para reduzir o erro) e não sejam pesados em custos monetários.

Os primeiros protocolos de diferenciação cerebelar foram gerados a partir de culturas 2D de corpos embrionários banhados (EBs), induzindo o destino cerebelar com vários fatores de crescimento semelhantes ao desenvolvimento in vivo, incluindo WNT, BMPs e FGFs 1,9. Protocolos publicados mais recentemente induziram diferenciação principalmente em cultura organoide 3D com FGF2 e insulina, seguidos por FGF19 e SDF1 para estruturas rômbicas semelhantes a lábios3,4, ou usaram uma combinação de FGF2, FGF4 e FGF85. Ambos os métodos de indução de organoides cerebelares resultaram em organoides cerebelares 3D semelhantes, pois ambos os protocolos relataram expressão de marcadores cerebelares semelhantes em pontos de tempo idênticos. Holmes e Heine estenderam seu protocolo 3D5 para mostrar que as células cerebelares 2D podem ser geradas a partir de hESCs e iPSCs, que começam como agregados 3D. Além disso, Silva et al.7 demonstraram que células que representam neurônios cerebelares maduros em 2D podem ser geradas com uma abordagem semelhante a Holmes e Heine, usando um ponto de tempo diferente para mudar de 3D para 2D e estendendo o tempo de crescimento e maturação.

O protocolo atual induz o destino cerebelar em iPSCs livres de alimentadores, gerando corpos embrionários (EBs) flutuantes livres usando insulina e FGF2 e, em seguida, chapeando os EBs em pratos revestidos de OLP / laminina no dia 14 para crescimento e diferenciação 2D. No dia 35, as células com identidade cerebelar são obtidas. A capacidade de recapitular os estágios iniciais do desenvolvimento cerebelar, especialmente em um ambiente 2D, permite que os pesquisadores respondam a perguntas específicas que exijam experimentos com uma estrutura monocamada. Este protocolo também é passível de modificações adicionais, como superfícies micropadronizadas, ensaios de crescimento axonal e classificação celular para enriquecer as populações celulares desejadas.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A pesquisa em seres humanos foi aprovada sob o número de aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Iowa 201805995 e o número de aprovação do Comitê de Células-Tronco Pluripotentes Humanas da Universidade de Iowa 2017-02. As biópsias de pele foram obtidas dos sujeitos após a obtenção do termo de consentimento livre e esclarecido. Os fibroblastos foram cultivados em DMEM com soro fetal bovino a 15% (FBS) e solução de aminoácidos não essenciais a 1% de MEM a 37 °C e 5% de CO2. Os fibroblastos foram reprogramados usando um kit de reprogramação episómica seguindo o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais) usando um nucleofector para eletroporação. Todos os procedimentos foram realizados em um gabinete de segurança biológica Classe II Tipo A2 ("capuz" para abreviar). Todos os meios de cultura celular eram livres de antibióticos; portanto, cada componente que entrava no capô era limpo com etanol a 70%. Todos os meios e componentes da cultura celular foram filtrados ou abertos estéreis no exaustor para manter sua esterilidade.

1. Preparação experimental

  1. Preparar placas revestidas com matriz de membrana basal (BMM).
    NOTA: BMM solidifica mais rapidamente em temperaturas mais quentes. As placas devem ser preparadas rápida e imediatamente colocadas a 4 °C para armazenagem.
    1. Descongelar o BMM (ver Tabela de Materiais) no gelo, a 4 °C durante, pelo menos, 2 h, ou durante a noite.
    2. Misture DMEM/F12 e BMM até uma concentração final de 80 μg/mL. Distribuir a solução de BMM em placas de cultura de tecidos (1 ml para 35 mm e 2 ml para placas de 60 mm) e incubar a 37 °C durante, pelo menos, 1 h ou durante a noite antes de chapear as células.
      NOTA: Os pratos não utilizados podem ser armazenados a 4 °C durante 2 semanas.
  2. Preparar placas revestidas com poli-L-ornitina/laminina (PLO/laminina).
    1. Prepare 20 μg/mL de PLO (ver Tabela de Materiais) em DPBS+/+ estéril e adicione 1 mL a cada poço de uma placa de 6 poços. Incubar durante a noite a 37 °C na incubadora.
    2. No dia seguinte, aspirar a OLP com um aspirador a vácuo e lavar duas vezes com DPBS+/+. Seque ao ar livre no capô.
      NOTA: As placas secas ao ar podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas, envoltas em papel alumínio, para uso futuro.
    3. Prepare 10 μg/mL de laminina (ver Tabela de Materiais) em DPBS+/+ e adicione 1 mL a cada poço de uma placa de 6 poços. Incubar pelo menos durante 3 h ou durante a noite a 37 °C na incubadora.
    4. Aspirar a laminina com um aspirador a vácuo e adicionar 1 ml de DPBS+/+ estéril ou estéril.
      NOTA: O revestimento de laminina não deve secar. PBS ou um meio de cultura apropriado deve ser adicionado imediatamente para evitar isso. As placas revestidas podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas.
  3. Prepare a solução de passagem de PSC.
    NOTA: Um osmômetro (consulte Tabela de Materiais) é necessário para fazer a solução de passagem de PSC10.
    1. Dissolver 11,49 g de cloreto de potássio (KCl) e 0,147 g de citrato de sódio di-hidratado (HOC(COONa)(CH 2 COONa)2*2H2O)em 400 ml de água de cultura celular estéril (ver Tabela de Materiais).
    2. Meça o volume da solução e registre-o como o volume inicial (Vi).
    3. Meça a osmolaridade e ajuste-a a 570 mOsm adicionando água de grau de cultura de células estéreis usando a fórmula Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. Filtrar-esterilizar a solução com um filtro de 0,20 μm e fazer alíquotas de 10 mL. Armazenar as alíquotas à temperatura ambiente (RT) por até 6 meses.
  4. Preparar meio pluripotente de células-tronco (PSC).
    NOTA: As iPSCs são mantidas em um meio contendo FGF2 estável ao calor (consulte Tabela de Materiais), fornecendo um cronograma de alimentação sem fim de semana. Outras mídias PSC comercialmente disponíveis não foram testadas para este protocolo.
    1. Descongele o suplemento médio de PSC durante a noite a 4 °C.
    2. Adicione 10 mL de suplemento de meio PSC a 500 mL de meio PSC basal. Fazer alíquotas de 25 ml e conservar a -20 °C.
      NOTA: As alíquotas congeladas podem ser armazenadas a -20 °C durante 6 meses. As alíquotas descongeladas devem ser armazenadas a 4 °C e utilizadas no prazo de 2 semanas. As células podem ser congeladas para armazenamento a longo prazo em um meio PSC com 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO).
  5. Prepare o meio de descongelamento PSC.
    1. Suplemento de meio PSC com 50 nM de cromo, 1,5 μM de emricasan, 1x suplemento de poliamina e 0,7 μM de trans-ISRIB (coquetel CEPT11) (ver Tabela de Materiais).
    2. Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,20 μm e conservar a 4 °C durante um período máximo de 4 semanas.
  6. Prepare pipetas de vidro puxadas.
    1. Puxe pipetas Pasteur de vidro de 22,9 cm (9 pol) em duas peças acima de um queimador Bunsen, ~2 cm abaixo do pescoço, criando duas pipetas, com o lado mais fino sendo ~4 cm mais curto que o outro.
    2. Com a ajuda da chama, dobre as pontas do lado puxado para criar um "r" suave.
    3. Coloque as pipetas puxadas nas mangas da autoclave e na autoclave para esterilização.
  7. Preparar meio de diferenciação cerebelar (MDL).
    1. Misture IMDM e mistura de nutrientes F12 de Ham em uma proporção de 1: 1. Complemente a mistura com 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina, concentrado lipídico quimicamente definido a 1% (v/v), 0,45 mM 1-tio-glicerol, 15 μL/mL de apo-transferrina, 5 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA) e 7 μg/mL de insulina (ver Tabela de Materiais).
    2. Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,20 μm, conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 1 mês.
  8. Preparar o meio de maturação cerebelar (CMM).
    1. Suplemento de meio neurobasal com 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina e 1x suplemento de N-2 (ver Tabela de Materiais).
    2. Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,20 μm, conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 2 semanas.

2. Cultura iPSC sem alimentador

  1. Descongele as células seguindo as etapas abaixo.
    1. Colocar uma placa BMM (passo 1.1) na incubadora a 37 °C para gelificar durante, pelo menos, 1 h ou durante a noite antes de descongelar as células.
    2. Pré-aqueça 10 mL de meio de descongelamento PSC (etapa 1.5) a 37 °C.
    3. Transferir o criovial com células do azoto líquido para banho-maria a 37 °C.
      NOTA: Para evitar a geração de uma fonte de contaminação no espaço de cultura celular, não é recomendado o uso de banho-maria padrão. Em vez disso, a água doce pode ser aquecida em um copo pequeno a 37 ° C para gerar um banho de água de uso único.
    4. Quando houver um pequeno pedaço de gelo deixado no tubo, retire-o do banho-maria, seque o tubo e pulverize com etanol a 70%. Transfira o tubo para o exaustor e use uma pipeta sorológica de 2 mL ou 5 mL (ver Tabela de Materiais) para transferir suavemente as células para um tubo cônico de 15 mL.
    5. Adicione 8 mL de meio de descongelamento PSC às células gota a gota enquanto gira o tubo cônico. Centrífuga a 200 x g durante 5 min a RT.
    6. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo sem perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em 2 mL de meio de descongelamento de PSC.
    7. Aspirar o BMM da placa e adicionar as células ressuspensas gota a gota sobre a placa para uma distribuição uniforme.
    8. Colocar a placa na incubadora a 37 °C, 5% de CO2. Atualize o meio no dia seguinte com o PSC médio. Depois disso, mude o meio diariamente.
  2. Mantenha as células seguindo as etapas abaixo.
    1. Pré-aqueça o volume necessário do meio PSC a 37 °C (por exemplo, 1 mL de meio por placa de 35 mm).
    2. Investigar as placas para células ou colônias diferenciadas e remover as células diferenciadas com uma pipeta de vidro puxada (etapa 1.6).
      NOTA: As colônias de iPSC têm bordas lisas com células morfologicamente idênticas.
    3. Mude o meio gasto diariamente e a passagem a cada 3-4 dias ou quando 70% de confluência for atingida.
  3. Passe as células.
    1. Coloque a quantidade necessária de placas BMM na incubadora por pelo menos 1 h ou durante a noite antes de passar. Pré-aqueça a quantidade necessária de meio PSC (passo 1.3) a 37 °C.
    2. Usando uma pipeta de vidro puxada, limpe todas as células ou colônias diferenciadas.
    3. Aspirar o meio gasto com aspirador a vácuo e adicionar meio de dissociação PSC, 1 mL por prato de 35 mm. Incubar a 37 °C durante 1-3 min.
      NOTA: Se as colônias estiverem decolando na solução de passagem de PSC antes de adicionar o meio de PSC, o tempo de incubação pode ser reduzido.
    4. Aspirar a solução de PSC passaging e adicionar o meio PSC pré-aquecido.
    5. Usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μL, risque linhas paralelas umas às outras em uma direção, gire a placa em 90° e faça um segundo conjunto de linhas de risco perpendiculares às anteriores (fazendo um padrão de eclosão cruzada em toda a placa).
    6. Aspirar a solução BMM das placas ajustadas. Coletar as colônias usando uma pipeta sorológica e distribuí-las para novas placas BMM.
    7. Incubar a 37 °C, 5% de CO2. Mude o meio diariamente.
  4. Congele as células.
    1. Prepare os criovianos rotulando o conteúdo e esterilize sob luz ultravioleta (UV) no exaustor (consulte a Tabela de Materiais) por 30 min.
    2. Prepare o meio de congelamento PSC suplementando o meio PSC com DMSO a 10% (v/v). Siga as etapas 2.3.2-2.3.5.
    3. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL com pipeta sorológica de 5 mL e centrífuga a 200 x g por 5 min no RT.
    4. Aspirar cuidadosamente o meio e ressuspender o pellet celular em meio de congelamento PSC.
    5. Distribuir em crioviais. Coloque os frascos para injetáveis num recipiente de congelação e coloque o recipiente num congelador a -80 °C.
    6. No dia seguinte, transfira os criovitais para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

3. Diferenciação cerebelar

NOTA: Antes de iniciar a diferenciação, as iPSCs são passadas para seis placas de 35 mm e estão prontas para a diferenciação quando estão em 70% de confluência. Cada placa de 35 mm será transferida para um poço da placa de 6 poços.

  1. No dia 0, levante as colônias saudáveis de iPSC para a formação de EB.
    1. Adicionar 1 mL de MDL (etapa 1.7) suplementado com 10 μM Y-27632 e 10 μM SB431542 (ver Tabela de Materiais) a cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa (ULA) de 6 poços e colocar na incubadora até que as colônias levantadas estejam prontas para serem adicionadas aos poços.
    2. Limpe as células diferenciadas usando uma pipeta de vidro puxada. Aspirar o meio e adicionar 1 mL de solução de PSC para cada prato de 35 mm. Incubar por 3 min a 37 °C, aspirar, e adicionar 2 mL de MDL suplementado com 10 μM Y-27632 e 10 μM SB431542.
      NOTA: Se as colônias estiverem decolando na solução de passagem de PSC antes de adicionar MDL, o tempo de incubação pode ser reduzido.
    3. Sob um microscópio invertido de luz transmitida, levante suavemente as colônias usando a borda dobrada da pipeta de vidro puxada usando ampliação de 4x. Uma vez que cada colônia é levantada, transfira suavemente tudo para um poço da placa ULA de 6 poços usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Repita este processo para cada placa iPSC. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Se as colônias forem muito grandes ou forem fundidas, elas podem ser cortadas com a ponta da pipeta de vidro puxada para criar EBs menores.
  2. No dia 2, adicione FGF2 a cada poço a uma concentração final de 50 ng/mL.
    NOTA: O FGF2 utilizado para diferenciação cerebelar não é estável ao calor. Este protocolo não foi testado com FGF2 estável ao calor.
  3. No dia 7, faça uma mudança média de 1/3. Para 3 mL de meio total em um poço, com um pipettor de 1.000 μL, aspirar suavemente 1 mL de meio gasto e substituí-lo por 1 mL de MDL fresco. Incubar os EBs por 7 dias.
  4. No dia 14, aspirar suavemente quase todo o meio gasto usando um pipettor de 1.000 μL. Para garantir danos mínimos aos EBs, gire a placa para reunir todos os EBs no centro da placa e, em seguida, incline a placa e aspirar lentamente da borda.
    1. À medida que a quantidade média diminui, coloque lentamente a placa plana e continue a aspirar. Deixe o meio suficiente para evitar secar os EBs. Posteriormente, adicione 3 mL de MDL fresco suplementado com 10 μM Y-27632. Transfira os EBs usando uma pipeta sorológica de 10 mL para um prato revestido de PLO/laminina (etapa 1.2).
      NOTA: Dependendo da aplicação a jusante, os EBs podem ser transferidos para uma placa PLO/laminina de 6 poços ou os EBs únicos podem ser transferidos para um único poço de uma placa de 24 poços revestida de PLO/laminina ou deslizamento de cobertura.
  5. No dia 15, aspirar o meio e substituí-lo por MDL fresco.
    NOTA: É importante adicionar meio suficiente aos poços para garantir um meio suficiente entre as mamadas, pois, com o tempo, haverá evaporação (por exemplo, para um poço em uma placa de 6 poços, adicione 3 mL de meio). Se o meio começou a acidificar (ficar claro e amarelo), atualize o meio mesmo que não esteja no cronograma de alimentação até o final do protocolo.
  6. No dia 21, aspirar o meio gasto e substituí-lo por CMM. No dia 28, troque o meio com CMM fresco. No dia 35, colha as células para outras aplicações.

4. Preparação da amostra para isolamento de ARN

  1. Aspirar o meio e adicionar 500 μL de reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) a cada poço da placa de 6 poços. Deixe-o ligado por alguns segundos e piratee.
  2. Incubar a placa, com a tampa ligada, à temperatura ambiente durante 2 min. Toque nas laterais da placa para separar as células.
  3. Adicione 1 mL de CMM (etapa 1.8) e colete as células em um tubo de 1,5 mL.
  4. Pellet as células por centrifugação usando uma minicentrífuga de bancada (ver Tabela de Materiais) por 30 s a RT (velocidade máxima 2000 x g), descarte o meio e adicione 1 mL de 1x PBS pH 7,4 para lavar o pellet celular.
  5. Pellet as células novamente usando uma minicentrífuga de bancada por 30 s no RT e lave com PBS mais uma vez.
  6. Pellet as células e descartar o PBS. Lise as células do fenol e do isotiocianato de guanidina contendo reagente (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: As células lisadas em fenol e isotiocianato de guanidina contendo reagente podem ser armazenadas a -80 °C por até 1 ano. As células podem ser lisadas diretamente no prato, dependendo do método de isolamento de RNA e dos reagentes que estão sendo usados. Devido ao baixo número de células em um prato, isolar o RNA usando colunas de spin de sílica (ver Tabela de Materiais) resultará em maiores rendimentos de RNA.

5. Preparação de células para coloração imunofluorescente

NOTA: Para uma placa de 24 poços, um EB por poço é suficiente.

  1. No dia 35, aspirar o meio gasto e lavar as células adicionando 1 mL de DPBS+/+ por poço (para um poço de uma placa de 24 poços).
  2. Aspirar o DPBS+/+ e adicionar 500 μL de paraformaldeído frio a 4% (PFA, ver Tabela de Materiais) preparado em DPBS+/+ por poço. Incubar por 20 min no RT.
  3. Remova 4% de PFA e lave as células duas vezes com DPBS+/+, como na etapa 5.1. Adicionar 1 ml de DPBS+/+ e conservar as células a 4 °C até à coloração.
    NOTA: Recomenda-se fazer a coloração imunofluorescente dentro de 1 semana após a fixação para evitar o descolamento celular e a perda de antígenos. No entanto, dependendo do anticorpo e da localização celular do alvo, a coloração pode ser feita em momentos posteriores até 4 semanas após a fixação.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visão geral da diferenciação cerebelar 3D para 2D
As células cerebelares são geradas a partir de iPSCs. A Figura 1A mostra o fluxo de trabalho geral e a adição dos principais componentes para diferenciação. No dia 0, os EBs são feitos levantando suavemente as colônias de iPSC (Figura 1B) usando uma pipeta de vidro puxada em MDL contendo SB431542 e Y-27632 e colocados em placas de fixação ultrabaixa. FGF2 é adicionado no dia 2. No dia 7, um te...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A capacidade de modelar o desenvolvimento cerebelar humano in vitro é importante para a modelagem de doenças, bem como para promover a compreensão do desenvolvimento normal do cérebro. Protocolos menos complicados e econômicos criam mais oportunidades para a geração de dados replicáveis e ampla implementação em vários laboratórios científicos. Um protocolo de diferenciação cerebelar é descrito aqui usando um método modificado de geração de EBs que não requer enzimas ou agentes de dissociação, usando fatores de c...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Jenny Gringer Richards por seu trabalho minucioso na validação de nossos sujeitos de controle, a partir do qual geramos as iPSCs de controle. Este trabalho foi apoiado pelo NIH T32 MH019113 (para D.A.M. e K.A.K.), o Nellie Ball Trust (para T.H.W. e A.J.W.), NIH R01 MH111578 (para V.A.M. e J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (para A.J.W.), e o Roy J. Carver Charitable Trust (para V.A.M., J.A.W. e A.J.W.). As figuras foram criadas com BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pipeta sorológica de 10 mLFisher Scientific13-678-26D
1-tio-glicerolSigmaM6145
Pipeta sorológica de 2 mLFisher Scientific13-678-26B
Unidade de Filtro de 250 mL, 0.2 µ m aPES, 50 mm de diâmetroFisher ScientificFB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture DishFalcon353001
4D Nucleofector core unitLonza276885Nucleofector
5 mL Pipeta sorológicaFisher Scientific13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture DishFalcon353004 6
poços placas de fixação ultra-baixaCorning3471
9" Pipetas Pasteur DescartáveisFisher Scientific13-678-20D
Apo-transferrinaSigmaT1147
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaA9418
Água de grau de cultura celularCytivaSH30529.02
Concentrado lipídico quimicamente definidoGibco11905031
Chroman 1Cayman34681
Classe II, Tipo A2, Gabinete de Segurança BiológicaNuAire, Inc.NU-540-600Capuz, luz UV
Placa Costar de 24 poços, TC tratadacom Corning3526
Placa de 6 poços Costar, TC tratadacom solução Corning3516
DAPIThermo Scientific62248
DMEMGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO (Dimetly sulfóxido)KitD2438
DPBS+/+Gibco14040133
EmricasanCayman22204
Epi5TechnologiesA15960
Essential 8-FlexGibcoA2858501PSC com sistema de
imagem de núcleo FGF2 EVOS XLao calor LifeTechnologies AMEX1000
Soro fetal bovino - Premium SelectAtlanta BiologicalsS11150
FGF2Peprotech100-18B
Suplemento GlutaMAXGibco35050061Suplemento de L-alanina-L-glutamina
Mistura de Nutrientes F12 da Ham'sGibco11765054
Incubadora de CO2 HERAcell VIOS 160iThermo Scientific50144906
Anti-EN2 humano, biotecnologiaSC-293311Santa Cruz
do rato Anti-Ki67/MKI67 humano, coelhoR& D SystemsMAB7617
Anti-PTF1a humano, coelhoNovus BiologicalsNBP2-98726
Anti-TUBB3 humano, camundongoBiolegend801213
IMDMGibco12440053
InsulinaGibco12585
Laminina Proteína de camundongoGibco23017015
MatrizMatrigelMatrizmembrana de porãoCorning 354234
MEM-NEAAGibco11140050
Mini CentrífugaMonarcaLabnet InternationalC1310
50 µ g)New England BioLabsT2040Colunas de rotação de sílica
Monarca Total RNA Miniprep KitNew England BioLabsT2010Colunas de rotação de sílica
N-2 suplementoGibco17502-048
Meio neurobasalGibco21103049
PBS, pH 7,4Gibco10010023
PFA 16%Microscopia Eletrônica Ciências15710
Suplemento de poliaminaSigmaP8483
Poli-L-Ornitina (PLO)Sigma3655
Cloreto de potássioSigma746436
SB431542Sigma54317
Bolsas auto-seláveis transparentesSterikingSS-T2 (90x250)Bolsas de autoclave
Sódio citrato di-hidratado Fisher ScientificS279-500
Filtros de seringa, estéreis, PES 0.22 µ m, 30 mm DiaResearch Products International256131
Trans-ISRIBCayman16258
TRIzol ReagentInvitrogen15596018Fenol e isotiocianato de guanidina
Enzima TrypLE Express (1x)Gibco12604039Reagente de dissociação celular 
Osmômetro de pressão de vaporWescor, Inc.Modelo 5520Osmômetro
Y-27632Biogems1293823
de reprogramação iPSC epissómal Sigma Life estável de de Kit de Limpeza de RNA da (

Referências

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