Artigo de método

Quantificação de RNAs circulares usando PCR de gotículas digitais

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DOI:

10.3791/64464

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16 de setembro de 2022

 ,  , 
1Institute of Life Sciences, 2School of Biotechnology, KIIT University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o método detalhado de PCR de gotículas digitais (dd-PCR) para quantificação precisa dos níveis de RNA circular (circRNA) em células usando primers divergentes.

Resumo

A reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais (dd-PCR) é um dos métodos de quantificação mais sensíveis; ele fraciona a reação em quase 20.000 gotículas de água em óleo, e a PCR ocorre nas gotículas individuais. A dd-PCR tem várias vantagens sobre a qPCR convencional em tempo real, incluindo maior precisão na detecção de alvos de baixa abundância, omitindo genes de referência para quantificação, eliminando replicações técnicas para amostras e mostrando alta resiliência a inibidores nas amostras. Recentemente, o dd-PCR tornou-se um dos métodos mais populares para quantificar com precisão o DNA ou RNA alvo para análise e diagnóstico da expressão gênica. RNAs circulares (circRNAs) são uma grande família de moléculas de RNA covalentemente fechadas recentemente descobertas sem extremidades de 5' e 3'. Eles demonstraram regular a expressão gênica agindo como esponjas para proteínas de ligação ao RNA e microRNAs. Além disso, os circRNAs são secretados em fluidos corporais, e sua resistência às exonucleases faz com que eles sirvam como biomarcadores para o diagnóstico de doenças. Este artigo tem como objetivo mostrar como realizar o desenho de primer divergente, extração de RNA, síntese de cDNA e análise de dd-PCR para quantificar com precisão os níveis específicos de RNA circular (circRNA) nas células. Em conclusão, demonstramos a quantificação precisa de circRNAs usando dd-PCR.

Introdução

Avanços recentes em tecnologias de sequenciamento de RNA e novos algoritmos computacionais descobriram um novo membro da crescente família de RNAs não codificantes, chamado RNA circular (circRNA)1. Como o nome sugere, os circRNAs são uma família de moléculas de RNA de fita simples sem extremidades livres. Eles são formados por splicing não-canônico da cabeça à cauda chamado back-splicing, onde o local aceptor da emenda a montante se une covalentemente com o local doador da emenda a jusante para formar um círculo estável de RNA 1,2. Esse processo pode ser mediado por diversos fatores, incluindo elementos repetitivos de Alu invertidos presentes no montante e a jusante de éxons circularizados, ou pode ser mediado por alguns fatores de splicing ou proteínas de ligação de RNA (RBPs)2,3. Os RNAs circulares gerados exclusivamente a partir da sequência exônica ou intrônica são classificados como circRNA exônico e RNAs intrônicos circulares ou ci-RNAs, enquanto alguns circRNAs exônicos retêm o íntron e são chamados de circRNAs de íntron éxon (EIcircRNAs)3,4. As funções dos circRNAs são multifacetadas, incluindo a esponja de miRNA e/ou RBP, regulando a transcrição e regulando a função celular por meio da tradução em peptídeos 3,5,6,7. Vários relatos têm destacado a importância dos circRNAs em diversas doenças e processos fisiológicos8. Além disso, os padrões de expressão tecidual específicos e a resistência à digestão da exonuclease a tornam um biomarcador funcional para o diagnóstico da doença e também podem ser utilizados como alvo terapêutico adequado8. Considerando sua importância na regulação da saúde e das doenças, a quantificação precisa da expressão do circRNA é a necessidade da hora.

Vários métodos bioquímicos têm sido desenvolvidos para quantificar circRNAs em amostras biológicas9. Um dos métodos mais convenientes e amplamente aceitos para a quantificação do circRNA é a transcrição reversa, seguida pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (RT-qPCR) usando pares de iniciadores divergentes10. No entanto, a maioria dos circRNAs está em baixa abundância em comparação com os mRNAs lineares, o que torna difícil quantificá-los11. Para superar esse problema, buscou-se utilizar a PCR de gotículas digitais (dd-PCR) para quantificar com precisão o número de circRNAs em uma determinada amostra. O dd-PCR é uma tecnologia avançada de PCR que segue o princípio da microfluídica; gera múltiplas gotículas aquosas no óleo, e a PCR ocorre em cada gota como uma reação individual12. A reação ocorre em gotículas individuais e é analisada por meio de um leitor de gotículas, que fornece o número de gotículas positivas ou negativas para o gene de interesse12. É a técnica mais sensível para quantificar com precisão um gene de interesse, mesmo que haja apenas uma única cópia em uma determinada amostra. A diminuição da sensibilidade aos inibidores, a melhor precisão e a omissão do gene de referência para quantificação o tornam mais vantajoso do que a qPCR convencional13,14,15. Tem sido amplamente utilizado como ferramenta de pesquisa e diagnóstico para a quantificação absoluta de um gene de interesse16,17. Aqui, descrevemos o protocolo detalhado de dd-PCR para quantificação de circRNA na diferenciação de miotubos C2C12 de camundongos e mioblastos C2C12 de camundongos proliferantes usando primers divergentes.

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Protocolo

O RNA é sensível às RNases; portanto, todos os reagentes, instrumentos e espaços de trabalho devem ser livres de RNase e manuseados com cuidado.

1. Desenho do primer divergente para o circRNA (ver Figura 1)

  1. Recupere a sequência madura a partir de dados de anotação de circRNA usando BEDTools ou do navegador do genoma UCSC, unindo a sequência de éxons/íntrons presente entre as coordenadas da junção de backsplice18,19.
  2. Prepare uma sequência de modelo de PCR de 200 nucleotídeos de comprimento, unindo os últimos 100 nucleotídeos do comprimento total da sequência de circRNA aos primeiros 100 nucleotídeos da sequência de circRNA10.
    NOTA: Se o comprimento do circRNA for inferior a 200 nucleotídeos, divida-o em duas metades iguais e junte-se aos nucleotídeos da última metade até o início da primeira metade.
  3. Use a sequência de modelo acima para o design do primer usando a ferramenta web Primer3 e definindo um comprimento de produto de PCR variando de 120-180 nucleotídeos em comprimento20.
  4. Use as configurações padrão do Primer3 para outros parâmetros, como Tm e comprimento do primer. As sequências de primer para circBnc2 estão listadas na Tabela 1.
  5. Ordene as sequências de primer divergentes para síntese de qualquer empresa de síntese oligo.

2. Isolamento de RNA

NOTA: Isole o RNA total das células C2C12 do rato utilizando quaisquer kits comercialmente disponíveis ou método de isolamento de ARN interno. O método interno de isolamento de RNA aqui utilizado já foi descrito anteriormente21. As esferas de sílica magnética são preparadas em laboratório utilizando o protocolo previamente publicado22. Essas contas magnéticas também podem ser adquiridas de vários fornecedores.

  1. Tome um prato de 10 cm contendo cerca de 5 x 106 células mioblásticas C2C12 proliferantes e um miotubo C2C12 diferenciado de 4 dias para isolamento de RNA.
  2. Lave as células com 10 mL de 1x PBS três vezes e descarte o PBS usando uma pipeta.
  3. Raspar as células em 1 mL de PBS 1x usando um raspador de células, centrifugar-as a 4 °C por 5 min a 750 x g e descartar o PBS usando uma pipeta.
  4. Adicionar 1 mL de reagente de isolamento de RNA (RIR) e lisar as células por pipetagem vigorosa21.
  5. Adicionar 200 μL (1/5 do volume de RIR) de clorofórmio e vórtice durante 15 s. Centrifugar o tubo a 4 °C durante 10 min a 12.000 x g.
  6. Pegue 400 μL da camada aquosa superior, carregue-a em uma coluna de sílica e centrifuga-se por 1 min a 12.000 x g à temperatura ambiente. Leve o fluxo para um novo tubo e adicione 600 μL de etanol a 100%.
  7. Adicionar 20 μL de grânulos de sílica magnética e colocar o tubo num misturador ajustado a 25 °C e a 1.200 rpm durante 5 minutos.
    NOTA: O volume do grânulo pode ser aumentado ou diminuído dependendo do número inicial de células tomadas para lise. As contas de sílica magnética podem ser adquiridas de fornecedores comerciais.
  8. Coloque o tubo num suporte magnético durante 30 s ou até que a solução fique límpida. Descarte o sobrenadante cuidadosamente usando uma pipeta.
  9. Ressuscite as esferas de sílica magnética em um tampão de lavagem de 500 μL contendo etanol a 90%. Coloque o tubo no suporte magnético por 30 s. Gire o tubo duas vezes no suporte magnético para lavar as contas. Deixe as contas se assentarem em direção ao ímã e descarte o buffer usando uma pipeta.
  10. Repita a etapa 2.9 duas vezes. Após a lavagem, gire brevemente o tubo e coloque-o de volta no suporte magnético por 30 s. Descarte o buffer de lavagem restante. Seque o tubo a 50 °C a 50 °C durante 3 minutos numa termófora, mantendo a tampa aberta.
  11. Adicione 20 μL de água isenta de nuclease e ressuspenda as contas.
    NOTA: O volume de eluição de RNA pode ser reduzido para 10 μL para aumentar a concentração de RNA.
  12. Coloque os tubos por 2-3 min à temperatura ambiente. Coloque o tubo de volta no suporte magnético e deixe-o descansar por 30 s. Coletar o RNA dissolvido em um novo tubo para avaliação de quantidade e qualidade usando um espectrofotômetro.
    NOTA: O RNA pode ser armazenado a -20 °C ou -80 °C para armazenamento a longo prazo. Para obter um resultado ideal, recomenda-se prosseguir com a etapa de síntese de cDNA no dia seguinte.

3. cDNA síntese

  1. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro e tome 1 μg de RNA para a síntese de cDNA.
  2. Misture 1 μg de RNA total com 1 μL de mistura de dNTP (10 mM cada de dATP, dTTP, dGTP e dCTP), 4 μL de 5x tampão de transcriptase reversa (RT), 2 μL de primer aleatório 10x RT, 0,25 μL de enzima transcriptase reversa (200 U/μL) e 0,5 μL de inibidor de RNase (40 U/μL) e compense o volume até 20 μL usando água livre de nuclease.
    NOTA: O volume da enzima transcriptase reversa pode ser alterado dependendo da concentração inicial de RNA tomada para a síntese de cDNA.
  3. Bata no tubo para misturar a reação e gire brevemente. Colocar o tubo a 25 °C durante 10 minutos, seguido de 50 °C durante 1 h.
  4. Para inactivar a enzima, coloque o tubo a 85 °C durante 5 minutos.
  5. Gelo resfrie o tubo por 2 min e adicione 480 μL de água livre de nuclease ao tubo para fazer a concentração de cDNA para 2 ng / μL.
    NOTA: o cDNA pode ser armazenado a -20 °C ou usado imediatamente para análise de dd-PCR.

4. Fluxo de trabalho digital de PCR droplet (dd-PCR)

NOTA: O fluxo de trabalho do dd-PCR envolve várias etapas, começando pela preparação da amostra, seguida pela geração de gotículas, amplificação de PCR, contagem de gotículas e análise de dados. Cada etapa é crucial para a geração precisa de dados, pois a dd-PCR envolve a quantificação absoluta dos produtos e não precisa de nenhuma curva padrão. Assim, cada uma das diferentes etapas do dd-PCR foi descrita abaixo.

  1. Preparação da reação dd-PCR.
    1. Configure a reação de PCR de 22 μL em tubos ou tiras de PCR de 0,2 mL, juntamente com um tubo de controle negativo e tubos NTC (controle não modelo).
      NOTA: Cada par de iniciadores divergentes diferentes para a detecção de diferentes circRNAs deve ter uma reação NTC junto com amostras de teste.
    2. Adicione 11 μL de master-mix dd-PCR (por exemplo, EvaGreen Supermix) e 11 μL de água livre de nuclease para configurar o tubo de reação de controle negativo.
      NOTA: Descongele a master-mix dd-PCR à temperatura ambiente, seguida de um breve vórtice para formar uma mistura homogénea. Use a mesma água livre de nuclease para configurar o tubo de reação de controle negativo e os tubos NTC que foram usados para diluir o cDNA.
    3. Adicione 11 μL de master-mix dd-PCR, 5,5 μL de mistura específica de primer para frente e para trás específica de circRNA de concentração de 1 μM e 5,5 μL de água livre de nuclease para configurar os tubos de reação NTC.
      NOTA: Diluir os primers divergentes circulares de RNA para a frente e para trás de 100 μM de estoque de 100 μM e misturar para preparar uma concentração de trabalho de 1 μM de mistura de primer de circRNA para frente e para trás; assim, a concentração final do primer é de 250 nM na reação de 22 μL.
    4. Adicionar 11 μL de master-mix dd-PCR, 5,5 μL de mistura específica de primer para frente e para trás específica de circRNA de concentração de 1 μM e 5,5 μL de cDNA (2 ng/μL) para configurar os tubos de reação de ensaio.
    5. Vórtice completamente seguido de uma breve centrifugação de todos os tubos de reação para obter uma mistura de reação homogênea no fundo dos tubos.
  2. Geração de gotículas.
    1. Transfira os 20 μL de mistura de PCR de tubos de PCR de 0,2 mL para os poços de amostra do cartucho gerador de gotículas.
    2. Adicione 70 μL de óleo de geração de gotículas aos poços de petróleo do cartucho gerador de gotículas cuidadosamente usando uma pipeta multicanal.
      NOTA: Incubar o óleo de geração de gotículas à temperatura ambiente durante 15 minutos antes da utilização.
    3. Cubra o cartucho do gerador de gotas com a junta de borracha e coloque-o na máquina geradora de gotas para obter a mistura de gotas de amostra de óleo, gerada nos poços de gotículas do cartucho.
  3. Amplificação por PCR.
    1. Transfira 40 μL da mistura de gotículas de óleo de amostra dos poços de gotículas do cartucho gerador de gotas para uma placa de PCR de 96 poços usando uma pipeta multicanal.
      NOTA: Transfira cuidadosamente a mistura de gotículas de óleo de amostra enquanto faz um ângulo para os poços através das pontas da pipeta multicanal para evitar quebrar as gotículas ao transferi-las para a placa dd-PCR de 96 poços.
    2. Sele a placa de PCR de 96 poços com o selador de folha de alumínio, coloque-a no bloco da máquina seladora de placas pré-aquecido a 80 °C e clique na vedação para selar a placa de PCR.
    3. Agora, coloque a placa no termociclador dd-PCR e defina o programa conforme mencionado na Tabela 2 com a temperatura da tampa definida em 105 °C e uma taxa de rampa de 2 °C/s.
  4. Contagem de gotículas.
    1. Quando a PCR terminar, coloque a placa na máquina conta-gotas dd-PCR com o suporte da placa na posição correta para contar as gotículas.
    2. Abra o software de análise de gotículas e configure a execução fornecendo entrada para as informações da amostra.
    3. Clique na opção de configuração. Em seguida, clique na opção de modelo para abrir um novo modelo.
    4. Defina cada poço colocando os detalhes do experimento, como o nome da amostra (cDNA usado ou controle negativo ou NTC), o nome do alvo (nome do primer circRNA) e o tipo (desconhecido) e o tipo do experimento como ABS (quantificação absoluta) e Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) usados, etc.
    5. Finalmente, salve o modelo e inicie a execução clicando na opção de execução e selecione a contagem por linha ou coluna. Permita que a máquina conclua a contagem de gotículas, que leva cerca de 1 min/poço.
    6. Clique no botão Analisar para analisar os dados após a conclusão da leitura da gota.
    7. Clique no botão Amplitude 1D para ver as gotículas positivas e negativas
    8. Para segregar as gotículas positivas das gotículas negativas, coloque uma linha de limiar comum para todas as amostras com o mesmo alvo.
      NOTA: O total de gotículas em cada amostra deve ser superior a 10.000 para ser considerado para quantificação absoluta. O NTC não deve mostrar contagens de gotículas positivas. A presença de gotículas positivas no NTC indica contaminação dos reagentes ou amplificação dos dímeros do primer. É difícil descobrir se as gotículas positivas têm dímeros de primer ou produtos não específicos em NTC. É aconselhável verificar os primers e evitar qualquer contaminação dos reagentes como uma prática geral para qualquer PCR, incluindo dd-PCR.
    9. Clique no botão Exportar para exportar os dados de contagem de circRNA como um arquivo .csv. Os dados exportados mostram o número de circRNAs presentes em cada amostra.
    10. Calcule manualmente o número de circRNAs em cada amostra por nanograma de RNA, considerando a quantidade total de cDNA usada em cada reação.

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Resultados

O número absoluto de circRNAs em cada amostra pode ser derivado dos dados de dd-PCR exportados. A análise quantitativa em tempo real da PCR sugeriu expressão diferencial de circBnc2 nos miotubos C2C12 diferenciados (dados não mostrados). Aqui, queríamos verificar o número absoluto de cópias de circBnc2 em mioblastos e miotubos C2C12 proliferantes. Como a expressão de circBnc2 é comparada em duas condições, é realmente importante processar todas as amostras para isolamento de RNA, síntese de cDN...

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Discussão

A pesquisa de circRNA cresceu na última década com a descoberta de tecnologias de sequenciamento de alto rendimento. Como resultado, tem sido considerada uma molécula potencial para futuras terapias de RNA. Além disso, sabe-se que atua como biomarcador em diversas doenças, incluindo câncer e doenças cardiovasculares 4,8. No entanto, a identificação do circRNA é complicada devido à sua baixa abundância e possui apenas uma sequência específica de junção de backspli...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por financiamento intramural do Instituto de Ciências da Vida, a bolsa de pesquisa DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961 / 2018) e a Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18 / 2 / 504017] concedida a Amaresh C. Panda. Agradecemos a outros membros do laboratório pela revisão do artigo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de microcentifuge de 1,5 mlTarson500010
Tiras de tubo de 0,2 ml com tampaTarson610020, 510073
Pontas de filtroTarson528104
Água destilada sem DNase/RNaseThermo Fisher Scientific10977023
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)SigmaP4417
Cell sucateiroHiMediaTCP223
ClorofórmioSRL96764
Diluente de DNAHiMediaMB228
Primers aleatóriosThermo Fisher Scientific48190011
dNTP conjuntoThermo Fisher ScientificR0181
Inibidor de RNase murinoNEBM0314S
Maxima reverso transcriptaseThermo Fisher ScientificEP0743
QX200 dd-PCR Evagreen SupermixBio-Rad1864033
Óleo de geração de gotículas para EvagreenBio-Rad1864006
PCR Placa de vedação térmica, folha, perfurávelBio-Rad1814040
DG8 Cartuchos e juntasBio-Rad1864007
DG8 Cartucho suporteBio-Rad1863051
QX200 Gerador de GotículasBio-Rad1864002
ddPCR Placas de 96 PoçosBio-Rad12001925
PX1 PCR Seladora de PlacasBio-Rad1814000
C1000 Touch com 96– Módulo de Reação de Poço ProfundoBio-Rad1851197
QX200 Leitor de GotículasBio-Rad1864003
Quantasoft SoftwareBio-Rad1864011
Coluna de SílicaGuarda-chuvaCiências da Vida 38220090
UCSC Genome Browserhttps://genome.ucsc.edu/
Primer 3
https://primer3.ut.ee/

Referências

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