Summary
Questo protocollo descrive un metodo efficiente per differenziare le hiPSC in cluster di campi oculari e generare organoidi neuro-retinici utilizzando condizioni di coltura semplificate che coinvolgono sia sistemi di coltura aderenti che in sospensione. Altri tipi di cellule oculari, come l'RPE e l'epitelio corneale, possono anche essere isolati dai campi oculari maturi nelle colture retiniche.
Abstract
Le cellule staminali pluripotenti possono generare organoidi tissutali complessi che sono utili per studi di modellizzazione di malattie in vitro e per lo sviluppo di terapie rigenerative. Questo protocollo descrive un metodo più semplice, robusto e graduale per generare organoidi retinici in un sistema di coltura ibrido costituito da colture monostrato aderenti durante le prime 4 settimane di differenziazione retinica fino alla comparsa di cluster primordiali del campo oculare distinti e auto-organizzati (EFP). Inoltre, le isole neuroretiniche a forma di ciambella, circolari e traslucide all'interno di ciascun EFP vengono raccolte manualmente e coltivate sotto sospensione utilizzando piatti di coltura non aderenti in un mezzo di differenziazione retinica per 1-2 settimane per generare coppette ottiche 3D multistrato (OC-1M). Questi organoidi retinici immaturi contengono PAX6+ e ChX10+ proliferanti, precursori retinici multipotenti. Le cellule precursori sono linearmente auto-assemblate all'interno degli organoidi e appaiono come striature radiali distinte. A 4 settimane dalla coltura in sospensione, i progenitori retinici subiscono l'arresto post-mitotico e la differenziazione del lignaggio per formare organoidi retinici maturi (OC-2M). I precursori impegnati nella linea fotorecettoriale si sviluppano all'interno degli strati più esterni degli organoidi retinici. Queste cellule fotorecettrici CRX+ e RCVRN+ maturano morfologicamente per mostrare estensioni simili a segmenti interni. Questo metodo può essere adottato per generare organoidi retinici utilizzando cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Tutti i passaggi e le procedure sono chiaramente spiegati e dimostrati per garantire la replicabilità e per applicazioni più ampie nella scienza di base e nella ricerca traslazionale.
Introduction
La retina è un tessuto sensibile alla luce presente nella parte posteriore dell'occhio vertebrato che converte i segnali luminosi in impulsi nervosi da un fenomeno biochimico noto come via di foto-trasduzione. Gli impulsi nervosi iniziali generati nelle cellule fotorecettrici della retina vengono trasdotti ad altri interneuroni retinici e cellule gangliari retiniche (RGC) e raggiungono la corteccia visiva del cervello, che aiuta nella percezione dell'immagine e nella risposta visiva.
Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), circa 1,5 milioni di bambini sono ciechi, di cui 1 milione in Asia. La distrofia retinica ereditaria (IRD) è una delle principali malattie accecanti che colpisce 1 individuo su 4.000 in tutto il mondo 1,2,3, mentre la prevalenza della cecità associata alla degenerazione maculare legata all'età (AMD) varia dallo 0,6% all'1,1% nei paesi in via di sviluppo 4. Le IRD sono causate da difetti genetici ereditari in oltre 300 diversi geni coinvolti nello sviluppo e nella funzione retinica5. Tali cambiamenti genetici provocano l'interruzione delle normali funzioni retiniche e la graduale degenerazione delle cellule retiniche, vale a dire le cellule fotorecettrici e l'epitelio pigmentato retinico (RPE), portando così a gravi perdite della vista e cecità. Sono stati fatti enormi progressi in altre condizioni di accecamento che coinvolgono la cornea, il cristallino, ecc. Tuttavia, le distrofie retiniche e le atrofie del nervo ottico non hanno alcuna terapia comprovata fino ad oggi. Poiché una retina umana adulta non dispone di cellule staminali6, fonti alternative come le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte derivate dal paziente (iPSC) possono fornire una fornitura illimitata dei tipi di cellule desiderati e sono molto promettenti per lo sviluppo di organoidi tissutali complessi necessari per studi di modellizzazione di malattie in vitro e per lo sviluppo di terapie rigenerative7, 8,9,10.
Diversi anni di ricerca sulla retina hanno portato a una migliore comprensione degli eventi molecolari che orchestrano lo sviluppo precoce della retina. La maggior parte dei protocolli per generare cellule retiniche e organoidi 3D da PSC mirano a ricapitolare questi eventi di sviluppo in vitro, coltivando le cellule in un complesso cocktail di fattori di crescita e piccole molecole per modulare i processi biologici noti in modo graduale. Gli organoidi retinici così generati sono costituiti dalle principali cellule retiniche: cellule gangliari retiniche (RGC), interneuroni, fotorecettori ed epitelio pigmentato retinico (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Nonostante i tentativi riusciti di modellare gli IRD utilizzando organoidi retinici, la necessità del complesso cocktail di fattori di crescita e piccole molecole durante la differenziazione e l'efficienza relativamente bassa della generazione di organoidi retinici rappresenta una sfida importante per la maggior parte dei protocolli. Includono principalmente la formazione di corpi embrioidi, seguita dalla loro differenziazione graduale in linee retiniche utilizzando condizioni di coltura complesse in diversi stadi di sviluppo in vitro 20,21,22.
Qui, viene riportato un metodo semplificato e robusto per sviluppare organoidi neuro-retinici 3D complessi da hiPSC di controllo sano e specifiche per malattie retiniche. Il protocollo qui descritto utilizza la differenziazione diretta di colture hiPSC quasi confluenti senza bisogno di formazione di corpi embrioidi. Inoltre, la complessità del terreno di coltura è semplificata, rendendolo una tecnica economica e riproducibile che può essere facilmente adottata dai nuovi ricercatori. Si tratta di un sistema di coltura ibrido costituito da colture monostrato aderenti durante le prime 4 settimane di differenziazione retinica fino alla comparsa di cluster primordiali del campo oculare distinti e auto-organizzati (EFP). Inoltre, le isole neuroretiniche circolari all'interno di ciascun EFP vengono raccolte manualmente e coltivate in colture in sospensione per 1-2 settimane per preparare coppe retiniche 3D multistrato o organoidi costituiti da precursori neuro-retinici proliferanti PAX6+ e CHX10+. La coltura estesa di organoidi retinici in terreno contenente taurina da 100 μM per ulteriori 4 settimane ha portato alla comparsa di precursori dei fotorecettori RCVRN+ e CRX+ e cellule mature con estensioni rudimentali simili a segmenti interni.
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Protocol
Tutti gli esperimenti che coinvolgono hiPSC sono stati condotti in modo asettico, in aderenza alle pratiche di laboratorio standard, alle linee guida etiche e di biosicurezza e con l'approvazione di organismi di regolamentazione come il Comitato etico istituzionale (IEC), il Comitato istituzionale per la ricerca sulle cellule staminali (IC-SCR) e il Comitato istituzionale per la biosicurezza (IBSC).
1. Preparazione di coltura iPSC e terreno di differenziazione retinica e reagenti
- Coltura iPSC e terreno di manutenzione
- Coltura e mantenimento della normale linea hiPSC23 (hiPSC-F2-3F1) e di una linea CRISPR modificata, RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, con delezione biallelica, frameshift di 10 bp all'interno dell'esone 18 del gene umano RB1) in mezzo Essential 8 su piastre di coltura rivestite con matrigel (membrana basale rivestita; vedi Tabella dei materiali) in condizioni di coltura prive di alimentatore.
NOTA: Questo protocollo può essere reso totalmente privo di xeno sostituendo la matrice della membrana basale con il rivestimento di vitronectina ricombinante (VTN-N). Preparare il mezzo completo Essential 8 aggiungendo 50x Essential 8 supplemento (fornito con il kit medio Essential 8; vedere Tabella dei materiali) e 100 U / mL Penicillina-Streptomycin soluzioni. In alternativa, le hiPSC possono anche essere coltivate utilizzando il mezzo mTeSR1 completo.
- Coltura e mantenimento della normale linea hiPSC23 (hiPSC-F2-3F1) e di una linea CRISPR modificata, RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, con delezione biallelica, frameshift di 10 bp all'interno dell'esone 18 del gene umano RB1) in mezzo Essential 8 su piastre di coltura rivestite con matrigel (membrana basale rivestita; vedi Tabella dei materiali) in condizioni di coltura prive di alimentatore.
- Soluzione di dissociazione cellulare (1x CDS)
- Per una dissociazione e un passaggio senza enzimi delle iPSC umane, preparare il CDS contenente 0,5 mM EDTA, pH 8,0 e 30 mM NaCl in 1x soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) (vedere Tabella dei materiali).
- Per preparare 100 mL di 1x CDS, aggiungere 100 μL di 0,5M EDTA e 1 mL di 3 M NaCl soluzioni madre a 99 mL di 1x DPBS, mescolare bene e filtrare sterilizzando utilizzando un filtro da 0,22 μm.
- Differenziazione Induction Medium (DIM)
- Preparare DIM utilizzando DMEM-F12 terreno basale integrato con 10% Knockout Serum Replacement (KOSR), 1x Non-Essential Amino Acid (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/mL Penicillina-Streptomycin, 200 μM di acido L-ascorbico e 1% di integratore N2 (vedere Tabella dei materiali).
- Mezzo di differenziazione retinica (RDM)
- Preparare RDM utilizzando DMEM-F12 terreno basale integrato con 10% Knockout Serum (KOSR), 1x Non-Essential Amino Acid (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/mL Penicillina-Streptomycin, 200 μM di acido L-ascorbico e 2% di integratore B27 (con vitamina A) (vedi Tabella dei materiali).
- Superfici di coltura cellulare rivestite di matrice extracellulare
- Scongelare la matrice di membrana basale qualificata hESC per una notte in un secchiello del ghiaccio, preferibilmente all'interno di un frigorifero a 4-8 °C. Diluire lo stock di matrice 100x scongelato (5 ml) in rapporto 1:5 aggiungendo 20 mL di mezzo basale DMEM-F12 ghiacciato e mescolare ruotando delicatamente per preparare una soluzione madre 20x.
- Preparare 0,5 mL di aliquote su ghiaccio utilizzando puntali per pipette pre-refrigerati e provette sterili per microcentrifuga. Etichettare i flaconcini come 20x stock e conservarli congelati in un congelatore a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
- Per rivestire le superfici della coltura cellulare (piastre di coltura o piastre a 6 pozzetti), scongelare un'aliquota di matrice 20x sul ghiaccio e diluirla in un rapporto di 1:20 utilizzando il terreno basale DMEM-F12 ghiacciato per preparare 10 ml di soluzione di rivestimento a matrice 1x, sufficiente per rivestire un piatto da 100 mm o una piastra a 6 pozzetti (1,5 ml / pozzetto).
NOTA: Preraffreddare le pipette/micropunte aspirando DPBS ghiacciato e sterile prima di maneggiare la soluzione della matrice. Lo scongelamento e tutta la manipolazione della matrice devono essere effettuati su ghiaccio, utilizzando pipette/micropunte pre-refrigerate per evitare la polimerizzazione e la gelificazione a temperatura ambiente. - Aggiungere 1,5 ml di 1x soluzione di rivestimento a matrice a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, ruotare delicatamente la piastra per garantire un rivestimento uniforme e incubare le piastre a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 . Lasciare le piastre indisturbate per un minimo di 1 h per garantire un rivestimento uniforme della matrice sulle superfici di coltura.
- Prima di seminare le celle, aspirare la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta sterile da 5 ml ed eliminare i rifiuti liquidi. Aggiungere immediatamente terreno di coltura fresco (2 ml / pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) e seminare le cellule ad una densità di 150.000-200.000 cellule / pozzetto. Non lasciare asciugare le piastre durante la manipolazione.
NOTA: In alternativa, il rivestimento di vitronectina ricombinante (VTN-N) a una concentrazione finale di 0,5 μg/ml può essere utilizzato per un protocollo di coltura privo di xeno.
- Scongelare la matrice di membrana basale qualificata hESC per una notte in un secchiello del ghiaccio, preferibilmente all'interno di un frigorifero a 4-8 °C. Diluire lo stock di matrice 100x scongelato (5 ml) in rapporto 1:5 aggiungendo 20 mL di mezzo basale DMEM-F12 ghiacciato e mescolare ruotando delicatamente per preparare una soluzione madre 20x.
2. Stabilire colture iPSC umane
- Scongelamento e rinascita delle hiPSC
- Rivestire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1x soluzione di matrice a membrana. Incubare a 37 °C per 1 ora per consentire la polimerizzazione e il rivestimento uniforme della superficie di coltura.
- Dopo 1 ora di incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento e aggiungere 1 mL di terreno completo Essential 8 preriscaldato contenente 10 μM di inibitore della Rho-chinasi, Y-27632 (1 μL/mL di 10 mM di stock; vedere Tabella dei materiali), prima di ravvivare nuovamente le cellule.
- Rimuovere uno stock crioviale hiPSC (1 x 106 celle/flaconcino) dal contenitore di azoto liquido. Scongelare rapidamente il crioviale a bagnomaria a 37 °C con un leggero vortice.
NOTA: Non scongelare completamente il flaconcino; Annotare il numero di passaggio, sterilizzare la fiala in superficie e asciugarla con un tampone privo di lanugine contenente alcol isopropilico al 70%. - Utilizzando una punta sterile per pipetta da 1 ml, aspirare il contenuto crioviale in una provetta fresca da 15 mL costituita da 2 ml di terreno completo Essential 8 preriscaldato senza Y-27632. Centrifugare il tubo a 1.000 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 1,0 mL di mezzo completo Essential 8 contenente 10 μM Y-27632.
- Aggiungere questa sospensione cellulare sulle superfici rivestite di matrice senza disturbare la matrice erogandola lungo le pareti. Scuotere delicatamente la piastra trasversalmente per garantire la distribuzione uniforme delle celle.
- Incubare le piastre a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per consentire alle cellule di aderire e iniziare a proliferare.
- Dopo 12-24 ore, sostituire il mezzo esaurito e mantenere le colture in mezzo completo preriscaldato Essential 8 senza Y-27632.
- Cambia il terreno di coltura ogni 24 ore e passa le culture una volta raggiunta la confluenza del 70% -80%.
NOTA: Un rapporto di divisione di 1:6 viene seguito di routine per le colture hiPSC e viene fatto passare a intervalli regolari di 3-4 giorni.
- Passaging e placcatura delle hiPSC per avviare la differenziazione della linea retinica
- Aspirare il mezzo esaurito dal 70% all'80% di colture iPSC umane confluenti in piastre a 6 pozzetti.
- Aggiungere 1 mL di CDS (fase 1.2) a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 5-7 minuti fino a quando le cellule non si arrotondano. Rimuovere con cautela il CDS, facendo attenzione a non staccare le cellule, e aggiungere 2 ml di terreno fresco Essential 8 e triturare delicatamente con una pipetta.
- Raccogliere la sospensione cellulare da un pozzetto di una piastra a 6 celle in un tubo da centrifuga da 15 ml e ruotare il tubo a 1.000 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 1,2 mL di terreno Essential 8 ed erogare 200 μL della cella 200μL della sospensione cellulare (rapporto di divisione 1:6) in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti rivestita di matrice contenente 1,5 ml di terreno di coltura iPSC contenente 10 μM Y-27632, come descritto al punto 1.5.
- Dopo 12-24 ore, sostituire il mezzo esaurito e mantenere le colture in mezzo completo preriscaldato Essential 8 senza Y-27632.
- Cambia il terreno di coltura ogni 24 ore fino a quando le colture raggiungono il 70% -80% di confluenza.
3. Differenziazione delle hiPSCs in campi oculari e linea retinica
NOTA: nella Figura 1 è illustrato uno schema schematico del processo di differenziazione.
- Avviare la procedura di differenziazione una volta che le colture hiPSC raggiungono il 70%-80% di confluenza.
- Il giorno 0, cambiare il mezzo di mantenimento hiPSC in DIM (fase 1.3) contenente 1 ng/mL bFGF e 1 ng/mL Noggin. Aggiungere 2,0 ml di terreno per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e mantenere le celle a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
NOTA: La sospensione graduale di bFGF induce la differenziazione delle PSCs e l'aggiunta di concentrazioni crescenti di Noggin (inibitore di diversi BMP) durante le fasi iniziali induce differenziazione della linea ectodermica e nevralizzazione11,12 e blocca l'impegno del mesoderma e dell'endoderma. In alternativa, Noggin può essere sostituito da LDN193189. A differenza della strategia di doppia inibizione SMAD riportata in precedenza20,21, questo protocollo non richiede l'aggiunta di Activin o SB-431542. - Il giorno 1, cambiare il mezzo esaurito e aggiungere DIM contenente 1 ng/mL bFGF e 10 ng/mL Noggin. Aggiungere 2,0 ml per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare e mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
- Nei giorni 2-3, rimuovere il mezzo esaurito e aggiungere DIM contenente solo 10 ng/mL di Noggin. Aggiungere 2,0 ml per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e cambiare il mezzo ogni 24 ore. Incubare e mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
NOTA: Preriscaldare sempre il terreno di coltura a 30-37 °C prima dell'uso. L'eccesso di miodesopsie e cellule morte può essere osservato nelle colture di differenziazione precoce. In tali condizioni, lavare le colture una volta con 1x DPBS e aggiungere il mezzo di differenziazione retinica. I test di sterilità sul mezzo esaurito possono essere eseguiti settimanalmente o secondo necessità. - Il giorno 4, rimuovere il mezzo esaurito e aggiungere l'RDM (passaggio 1.4). Aggiungere 2,0 ml per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e continuare a mantenere le colture in RDM a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 , con un nuovo cambio di terreno ogni giorno.
NOTA: In alternativa, le PSC possono essere coltivate come colture in sospensione dal giorno 1-3, in piastre a 96 pozzetti non aderenti e a fondo arrotondato, ad una densità cellulare di 5 x 103 cellule/100 μL/pozzetto per formare corpi embrioidi (EB) in condizioni di coltura identiche in DIM. GLI EB ben formati il giorno 4 possono essere placcati su piastre rivestite di matrice contenenti RDM e possono aderire, proliferare e differenziarsi come descritto di seguito. - Intorno al giorno 14-18, osservare le colture al microscopio con un ingrandimento 10x per l'emergere di domini simili a rosette neurali costituiti da progenitori del campo oculare precoce (Figura 2B).
- Intorno al giorno 21-28 (3-4 settimane), osservare le colture al microscopio con ingrandimento 4x e 10x per osservare l'emergere di EFP auto-organizzate e distinte, con un'isola centrale di strutture neuro-retiniche 3D circolari circondate da escrescenze contigue di epitelio neurologico ed epitelio di superficie oculare (Figura 2C, D).
NOTA: Si possono osservare circa 20-30 EFP per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti di una normale coltura di differenziazione retinica hiPSC. Questo numero può variare con altre linee hiPSC specifiche della malattia, in base al loro background genetico e al potenziale di differenziazione della linea retinica.
4. Raccolta di organoidi retinici
- Trascinamento a fiamma delle pipette Pasteur in vetro per il prelievo manuale delle coppe retiniche.
NOTA: Utilizzare pipette Pasteur in vetro sterilizzato e sterilizzato per il prelievo del campo oculare.- Accendere un bruciatore Bunsen. Prendi una pipetta Pasteur sterile e tieni la base in una mano e la punta capillare nell'altra. Fiamma sterilizzare e riscaldare la regione vicino al centro della punta capillare, con movimenti rotazionali fino a quando il vetro diventa flessibile. Quindi allontanarsi dalla fiamma e tirare rapidamente verso l'esterno per creare una punta capillare fine con un lume chiuso.
- Tenere la punta sottile orizzontalmente davanti alla fiamma e passarla rapidamente attraverso la fiamma con un movimento verso l'esterno per creare un gancio liscio o una punta capillare a forma di L.
- Utilizzare la zona di curvatura esterna liscia del gancio capillare come un misurino sottile per sollevare delicatamente e staccare le coppe neuroretiniche intatte dai cluster EFP.
NOTA: L'angolo liscio del gancio capillare in vetro non provoca danni alle cellule né crea graffi sulle superfici di coltura. Questo semplice strumento può anche essere efficacemente utilizzato per la suddivisione delle singole colonie hiPSC in schemi di griglia e per passarli come piccoli cluster di cellule durante l'espansione clonale.
- Coltura e mantenimento di coppe retiniche per generare organoidi retinici 3D.
- Al giorno 25-30, aggiungere 4,0 ml di terreno di differenziazione retinica preriscaldato in un piatto da 60 mm a basso attacco prima di preparare la raccolta delle coppette neuro-retiniche.
- Lavora al microscopio stereo con un ingrandimento di 0,63x-4,5x per osservare e selezionare manualmente coppe neuroretiniche ben formate da singoli EFP.
NOTA: L'aspetto delle escrescenze delle cellule RPE pigmentate aiuta nella facile identificazione delle EFP e delle coppette neuroretiniche posizionate centralmente. Le coppe retiniche appaiono come strutture 3D a forma di ciambella, circolari e traslucide, con striature radiali chiare, formate dalle cellule staminali retiniche disposte linearmente e autoassemblate, al contrario dei cluster strettamente impacchettati e sferici o irregolari formati dai neuroni del SNC o dalle cellule della cresta neurale23. - Utilizzare i ganci per pipette Pasture tirati a fiamma per spingere delicatamente e raccogliere l'isola neuro-retinica centrale all'interno dei singoli EFP.
- Impostare una micropipetta da 1 mL per aspirare 100 μL e utilizzare 1 mL di micropunte con ampie aperture per aspirare e trasferire le coppette retiniche galleggianti nelle piastre di coltura fresche e poco aderenti preparate al punto 4.2.1.
NOTA: L'uso di punte con una dimensione del foro più piccola e una pressione di aspirazione più elevata può causare il taglio e influire sull'integrità delle coppette retiniche. Le dimensioni approssimative delle coppe retiniche hanno un diametro di circa 1-2 mm. - Mantenere le coppe retiniche in RDM come colture di sospensione non aderenti e incubarle a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
- Giorno 30-45: Cambiare il mezzo ogni giorno inclinando delicatamente il piatto e lasciando che le coppette retiniche si depositino per circa 30 secondi. Seguire un metodo di alimentazione parziale, rimuovendo metà volumi di mezzo esaurito e sostituendo con volumi uguali di mezzo fresco.
NOTA: Evitare ripetute aspirazioni e trasferimenti per evitare danni alle coppe retiniche. Dopo 1-2 settimane di coltura in sospensione, le coppe retiniche crescono leggermente di dimensioni (1-3 mm) e si sviluppano in organoidi retinici 3D auto-organizzati (OC-1M) costituiti da progenitori neuro-retinici precoci disposti linearmente che esprimono PAX6 e CHX10 (Figura 3Bi). - Giorno 45-60: Coltura degli organoidi retinici per ulteriori 4 settimane in RDM contenente 100 μM di Taurina (vedi Tabella dei Materiali) per supportare una migliore sopravvivenza e differenziazione del lignaggio dei progenitori neuro-retinici e lo sviluppo di cellule retiniche mature (OC-2M).
NOTA: Circa il 70%-80% delle coppette retiniche o ottiche prelevate dalle EFP rimangono intatte, mantengono la loro laminazione e si sviluppano in organoidi retinici maturi dopo 4 settimane di coltura in sospensione (OC-2M). - Verificare che gli organoidi retinici maturi a 4 settimane di coltura in sospensione mostrino l'emergere di precursori dei fotorecettori RCVRN+ e CRX+ e cellule mature con un'estensione rudimentale simile a un segmento interno negli strati cellulari più esterni, ricapitolando così il normale processo di sviluppo e maturazione retinica in vitro (Figura 3Bii).
NOTA: Dopo aver rimosso le coppette neuro-retiniche, le colture di differenziazione possono essere mantenute continuamente in RDM. Le escrescenze epiteliali prossimali che circondano la neuro-retina contengono precursori delle cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE), che si espandono ulteriormente e maturano per formare monostrati RPE pigmentati con tipica morfologia di ciottoli (Figura 4). Le escrescenze distali sono costituite prevalentemente da epitelio di superficie oculare che contribuisce al cristallino eall'epitelio corneale. I tipi di cellule desiderati possono essere raccolti da diverse zone di escrescenze EFP e arricchiti ulteriormente per stabilire colture pure.
5. Caratterizzazione degli organoidi retinici
- Caratterizzazione morfologica e molecolare
- Osservare le EFP aderenti e gli organoidi retinici galleggianti al microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 4x e 10x e documentarne la morfologia e le dimensioni.
- Raccogliere circa 20 organoidi retinici in diversi stadi di maturazione (fasi 4.2.3-4.2.6) in provette da microcentrifuga da 1,5 ml utilizzando punte larghe da 1.000 μL. Lasciare che gli organoidi si depositino sul fondo e aspirare il mezzo. Lavare le tazze con 1x PBS.
- Rimuovere il PBS in eccesso e aggiungere 1,0 mL di reagente TRIzol (vedere Tabella dei materiali). Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Omogeneizzare il tessuto usando un pestello a tubo e triturare usando una pipetta da 1,0 ml.
- Preparare l'RNA totale seguendo il metodo standard del reagente di isolamento e purificazione dell'RNA, secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Controllare la qualità dell'RNA sul gel di agarosio e quantificarla utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop (vedi Tabella dei materiali).
- Convertire 1-2 μg di RNA totale in cDNA utilizzando l'enzima trascrittasi inversa secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Vedere la Tabella 1 per un elenco di primer gene-specifici.
- Preparare brevemente la miscela master RNA-primer in 10 μL di volume totale come indicato nella Tabella 2 e incubare la provetta a 65 °C per 5 minuti in un termociclatore. Trasferire il tubo dal termociclatore al ghiaccio per 2 minuti.
- Nel frattempo, preparare la master mix 2 con i reagenti menzionati nella tabella 3. Aggiungere questa miscela master al tubo di miscela RNA-primer preparato al punto 5.1.7. Mescolare delicatamente.
- Incubare il campione a 50 °C per 50 minuti, quindi a 85 °C per 5 minuti, quindi tenere premuto a 4 °C per interrompere la reazione.
- Utilizzare il cDNA sintetizzato come modello nelle reazioni PCR per verificare l'espressione del progenitore neuro-retinico e dei marcatori delle cellule retiniche mature.
- Normalizzare i modelli totali di cDNA di ciascun campione, vale a dire F2-UD (hiPSC-F2-3F1; cellule indifferenziate), OC-1M (coppa ottica di 1 settimana in coltura in sospensione) e OC-2M (coppa ottica di 4 settimane in coltura di sospensione) mediante PCR semi-quantitativa utilizzando i geni housekeeping come hE1fα o GAPDH.
- Preparare la miscela master per la PCR semiquantitativa, come menzionato nella Tabella 4, e posizionare le provette per l'amplificazione in un termociclatore. Le condizioni di amplificazione della PCR sono menzionate nella Tabella 5.
- Istologia e immunoistochimica
- Raccogliere i bicchieri ottici in una provetta da microcentrifuga da 2,0 mL e aspirare il mezzo in eccesso (punti 4.2.3-4.2.6). Risciacquare gli organoidi con 1x PBS e poi lavarli e sospenderli in 500 μL di Paraformaldeide al 4% per fissarli durante la notte a temperatura ambiente.
- Il giorno dopo, lavare le tazze in acqua deionizzata. Lasciare riposare le tazze in alcool al 95% (tre cambi, 15-20 minuti ciascuno), seguiti da alcol al 100% (tre cambi, 15-20 minuti ciascuno), un mix 1: 1 di alcol assoluto e xilene per 15 minuti, xilene (due cambi, 15 minuti ciascuno) e paraffina (tre cambi, 15 minuti ciascuno). Incorporare questo tessuto per preparare un blocco di paraffina seguendo le procedure standard. Lasciare raffreddare e solidificare.
- Preparare sezioni sottili (~4-5 μm di spessore) utilizzando un microtomo e posizionarle su vetrini microscopici rivestiti di silano (vedi Tabella dei materiali) seguendo le procedure istologiche standard.
- Per la deparaffinizzazione, riscaldare i vetrini a 70 °C su un blocco riscaldante per 15-20 minuti. Una volta che la cera si scioglie, lavare i vetrini con xilene (tre cambi, 3-4 min ciascuno), che rimuoverà completamente la paraffina.
NOTA: La rimozione incompleta della paraffina provoca una colorazione scadente / irregolare delle sezioni con un'enorme quantità di rumore di fondo. - Reidratare i vetrini utilizzando diverse percentuali di etanolo (100%, 90% e 80%) per 3 minuti ciascuno. Risciacquare i vetrini con acqua distillata e procedere con il recupero dell'antigene.
- Prima di iniziare il recupero dell'antigene, preriscaldare il tampone citrato (pH 6,0) in un barattolo Coplin (vedi Tabella dei materiali) utilizzando un forno a microonde fino a raggiungere 95-100 °C.
- Immergere i vetrini in un tampone citrato preriscaldato e riscaldare il barattolo per 15 minuti in un forno a microonde. Togliere il barattolo Coplin dal forno e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
- Bloccare le sezioni per la perossidasi endogena aggiungendo una miscela 1:1 di metanolo e perossido di idrogeno per 5 minuti, quindi lavare le sezioni tre volte con 1x PBS.
- Permeabilizzare le sezioni utilizzando Triton-X 100 allo 0,5% per 15 minuti. Lavare le diapositive tre volte con 1x PBS.
- Bloccare il legame aspecifico dell'anticorpo primario incubando le sezioni con siero bovino fetale (FBS) al 10% in 1x PBS per 1 ora.
- Incubare le sezioni con anticorpo primario per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C. Lavare i vetrini tre volte con 1x PBS per 3-5 minuti ciascuno per rimuovere l'anticorpo non legato.
- Aggiungere un anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente adatto e incubare per 45 minuti. Lavare i vetrini tre volte con 1x PBS per 3-5 minuti ciascuno.
NOTA: Gli anticorpi e le rispettive diluizioni sono menzionati nella Tabella dei Materiali. Le sezioni organoidi retiniche sono state immunomarcate utilizzando PAX6 e CHX10 per rilevare le prime cellule precursori della neuro-retina e utilizzando Recoverin e CRX per rilevare cellule precursori della retina e dei fotorecettori impegnate. Allo stesso modo, anti-PAX6 e anti-MITF sono stati utilizzati per rilevare i precursori RPE e anti-CRALBP e anti-RPE65 sono stati utilizzati per rilevare cellule RPE mature pigmentate mediante immunocitochimica di colture monostrato 2D. - Controcolorare le sezioni con DAPI o PI e montarle su un vetrino utilizzando il supporto di montaggio antidissolvenza (vedere Tabella dei materiali).
- Immagine e documentazione delle sezioni immunomarcate di organoidi retinici e colture RPE utilizzando un microscopio a fluorescenza o a scansione laser confocale per esaminare diversi strati cellulari che esprimono diversi marcatori retinici.
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Representative Results
La differenziazione delle hiPSCs in linee oculari si ottiene coltivando le cellule in diversi cocktail di terreno di coltura contenenti integratori e fattori di crescita in fasi sequenziali in diversi punti temporali, come descritto nella Figura 1. Le colture hiPSC sono mantenute nel mezzo Essential 8, il mezzo di mantenimento delle cellule staminali pluripotenti. Una volta raggiunta la confluenza del 70%-80% (Figura 2A), il mezzo viene sostituito con il mezzo di induzione differenziata (DIM) il giorno 0 (fare riferimento al punto 3.2) contenente 1 ng/mL bFGF, 1 ng/mL Noggin, e 1% N2 supplemento. Insieme al supplemento N2 che induce neuralmente, Noggin, l'inibitore della segnalazione BMP, svolge un ruolo cruciale nel dirigere le cellule verso la linea neuroectodermica bloccando l'impegno mesodermico ed endodermico. Il 1 °, 2° e 3° giorno, la concentrazione di Noggin è aumentata a 10 ng/mL (fare riferimento ai punti 3.3 e 3.4). Dal 4° giorno, il DIM viene sostituito con Retinal Differentiation Medium (RDM) (fase 3.5) e le colture vengono mantenute continuamente per un massimo di 30 giorni. La B27 nel cocktail RDM contiene integratori aggiuntivi come antiossidanti multipli e D-galattosio, che promuove il metabolismo aerobico e aiuta a ridurre lo stress ossidativo, migliorando la vitalità delle cellule progenitrici differenzianti. Inoltre, la presenza di retinolo acetato (vitamina A) e ormoni della crescita come il triiodo-I-tironina (T3) favorisce la differenziazione della linea neurale e retinica.
Dal 14 ° al 18° giorno, si osserva la formazione di rosette neurali, che segna l'inizio dell'impegno del campo oculare (Figura 2B). I precursori del campo oculare all'interno delle rosette neurali proliferano ulteriormente e si auto-organizzano in distinti cluster primordiali del campo oculare (EFP) con strutture neuroretiniche circolari al centro. Altri tipi di cellule come l'epitelio pigmentato retinico (RPE), l'epitelio della cresta neurale e quelli che contribuiscono alla superficie oculare emergono e migrano come epitelio contiguo con margini ben definiti. Campi oculari ben formati, come descritto sopra, possono essere osservati tra il 21° e il 28° giorno di differenziazione (Figura 2C,D). L'isola centrale delle coppette neuro-retiniche viene raccolta tra il giorno 25-30 utilizzando una pipetta Pasteur in vetro tirato a fiamma (Figura 2E) e viene mantenuta come colture di sospensione non aderenti in RDM per ulteriori 1-2 settimane, fino al giorno 45. I progenitori retinici proliferanti si auto-organizzano ulteriormente per formare organoidi retinici 3D multistrato di circa 2-3 mm di diametro (Figura 2F,G). Dal giorno 46, l'RDM viene integrato con 100 μM di taurina per promuovere la neurogenesi e migliorare la sopravvivenza cellulare in colture organoidi a lungo termine in vitro (Figura 2H).
Gli organoidi retinici sono caratterizzati in diversi stadi di maturazione per l'espressione di diversi marcatori progenitori retinici utilizzando la PCR A TRASCRIZIONE INVERSA (RT-PCR) e l'immunoistochimica (IHC). Per questo, gli organoidi vengono raccolti per l'isolamento totale dell'RNA il 30 ° e il 60° giorno di differenziazione. I risultati della RT-PCR hanno confermato l'induzione e l'espressione di marcatori neuro-retinici come NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 e PDE6C in organoidi retinici di 1 settimana (4-5 settimane dopo la differenziazione, OC-1M) e organoidi retinici di 4 settimane 8,12 (7-8 settimane dopo la differenziazione, OC-2M) (Figura 3A). L'immunoistochimica e l'imaging a fluorescenza hanno confermato l'espressione dei marcatori progenitori retinici PAX6, CHX10 e OTX2 in OC-1M e dei marcatori retinici maturi RCVRN e CRX in OC-2M 8,12 (Figura 3Bi,ii).
Oltre alle coppe neuroretiniche centrali, gli altri tipi di cellule oculari, come l'epitelio pigmentato retinico (RPE), l'epitelio della cresta neurale e le cellule epiteliali della superficie oculare, emergono e migrano fuori dalle EFP. I progenitori RPE derivati dal neuroectoderma appaiono come cellule epiteliali disposte in modo compatto che circondano le EFP, che gradualmente maturano e si pigmentano lungo i margini migratori dal giorno 30-45 (Figura 4A-C). Queste colture di differenziazione aderente, dopo la rimozione delle coppe retiniche, possono quindi essere estese fino al giorno 45, per raccogliere precursori proliferanti di RPE (Figura 4D), che possono essere ulteriormente arricchiti per preparare colture monostrato di cellule RPE pigmentate completamente mature. Gli RPE pigmentati maturi possono essere visti come monostrati con la tipica morfologia del ciottolo (Figura 4E). L'identità cellulare RPE è ulteriormente confermata dall'immunocitochimica che utilizza anticorpi contro marcatori specifici RPE come MITF (marcatore progenitore RPE), PAX6 (marcatore progenitore e RPE maturo) e RPE65 (marcatore RPE maturo)10,12 (Figura 4F-H).
Gli organoidi retinici derivati da cellule staminali pluripotenti possono quindi servire come modelli in vitro per lo studio di varie malattie retiniche ereditarie 7,8,9. I modelli di cellule staminali specifiche per malattia sono sviluppati generando linee iPSC specifiche per il paziente o introducendo mutazioni specifiche della malattia in linee iPSC di controllo sane utilizzando l'approccio di editing genico basato su CRISPR 7,8. Le iPSC mutanti possono o meno differenziarsi in modo efficiente in tipi di cellule retiniche a seconda delle mutazioni genetiche coinvolte. Mentre la maggior parte delle linee cellulari di controllo sane ha seguito la linea temporale sopra descritta, ci possono essere deviazioni nel caso di iPSC specifiche della malattia in termini di tempistiche di differenziazione, morfologia EFP, dimensioni della coppa retinica, laminazione e maturazione. È stato esaminato il potenziale di differenziazione retinica di una linea RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3) che porta una delezione biallelica di 10 bp all'interno dell'esone 18 del gene umano RB1, che si traduce in un frameshift e nella completa perdita dell'espressione della proteina RB1. È stato osservato che la perdita dell'espressione di RB1 non ha influenzato l'occhio e la differenziazione precoce della linea retinica della linea hiPSC mutante. Tuttavia, sono stati osservati un marcato ritardo nelle tempistiche e una riduzione dell'efficienza di formatura dell'EFP. Le EFP atipiche emerse avevano aggregati anormali di progenitori retinici che non riuscivano a laminarsi e ad auto-organizzarsi in coppe retiniche appropriate (Figura 5A,B) o mancavano della zona circostante di RPE ed epitelio di superficie oculare (OSE) (Figura 5C). Quando sono stati scelti e mantenuti come colture in sospensione, questi cluster progenitori retinici hanno formato aggregati neuro-retinici irregolari (Figura 5D).
Figura 1: Timeline che rappresenta la differenziazione delle iPSC in organoidi retinici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Generazione di organoidi retinici 3D auto-organizzati. (A) Coltivazione di colture hiPSCs in condizioni prive di alimentatore. (B) Sviluppo di rosette neuronali al giorno 14 della differenziazione (asterisco). (C,D) Cluster primordiali del campo oculare (EFP) contenenti una struttura centrale a coppa neuro-retinica (frecce nere) circondata dalla zona migrante dell'epitelio (frecce bianche) al giorno 21-28 di differenziazione. (E) Pipetta Pasteur in vetro tirato a fiamma con punta uncinata. La curva liscia nella regione della cerniera viene utilizzata per spingere e sollevare le coppe retiniche (freccia). (F,G) Coppette retiniche raccolte al giorno 25 e coltivate sotto sospensione per generare organoidi retinici 3D auto-organizzati. (H) Organoidi retinici maturi in coltura in sospensione al giorno 45. Barre scala: 100 μm (A,B,D,G); 200 μm (C,F,H). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Caratterizzazione degli organoidi retinici. (A) Profilo di espressione genica retinica mediante RT-PCR della normale indifferenziata hiPSC linea 23 (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) e delle coppette ottiche normali differenziate raccolte a 3-4 settimane di differenziazione e maturate ulteriormente in coltura in sospensione rispettivamente per 1 settimana (OC-1M) e 4 settimane (OC-2M). I cDNA di tutti i campioni di prova sono stati normalizzati utilizzando eEF1a come controllo di carico. (B) Immagini confocali di sezioni immunomarcate di (i) organoidi retinici immaturi (OC-1M) utilizzando anticorpi contro i marcatori progenitori neuro-retinici CHX10, PAX6 e OTX2 (in rosso) e (ii) organoidi retinici maturi (OC-2M) utilizzando anticorpi contro i marcatori precursori dei fotorecettori Recoverin e CRX (in rosso). Lo strato più esterno marcato degli organoidi retinici con cellule fotorecettrici differenzianti (box) nei pannelli di sinistra viene ingrandito e mostrato nei pannelli di destra. DAPI è stato usato come controcolorante (in blu). Le rudimentali estensioni interne simili a segmenti sono contrassegnate da frecce bianche. Barra scala: 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Comparsa di diversi tipi di cellule oculari. (A) Cluster EFP con la coppa neuro-retinica al centro e escrescenze RPE migratorie che mostrano pigmentazione lungo i bordi anteriori (freccia bianca). (B) Escrescenze epiteliali pigmentate ben differenziate da più EFP in tutta l'isola neuro-retinica. (C) Un maggiore ingrandimento di un EFP mostra la zona migratoria dei progenitori RPE (freccia bianca) e dell'epitelio della superficie oculare (asterisco) che circonda una coppa neuro-retinica. (D) Colture aderenti estese che hanno sviluppato monostrati di cellule RPE immature contenenti cellule pigmentate e non pigmentate. (E) Colture monostrato di cellule RPE completamente mature e pigmentate che mostrano morfologia di ciottoli al giorno 60. (F-H) Celle RPE che esprimono PAX6, MITF e RPE65 in verde. Barra scala: 200 μm (A,B); 100 μm (C-E); 20 μm (F-H). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Formazione anomala della coppa retinica nelle iPSC mutanti RB1-/-. (A,B) EFP con aggregati anomali di progenitori retinici con laminazione distorta e mancanza di striature. (C) EFP con la coppa neuro-retinica in miniatura ma priva della zona circostante di RPE e dell'epitelio della superficie oculare (freccia). (D) Aggregati neuro-retinici irregolari formati in coltura in sospensione. Barra scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Nome del primer | Sequenza principale (5'-3') | Dimensione della banda (bp) | ID riferimento | |||
| 1 | heEF1α | F: GAAGTCTGGTGATGCTGCCATTGT | 198 | NM_001402 | ||
| R: TTCTGAGCTTTCTGGGCAGACTTG | ||||||
| 2 | hNeuroD1 | F: CGCGCTTAGCATCACTAACT | 349 | NM_002500 | ||
| R: GCGTCTCTTGGGCTTTTGAT | ||||||
| 3 | hCHX10 | F: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA | 382 | NM_182894 | ||
| R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT | ||||||
| 4 | hCRX | F: TCAACGCCTTGGCCCTAAGT | 357 | NM_000554 | ||
| R: ACACATCTGTGGAGGGTCTT | ||||||
| 5 | hPKC-β1 | F: AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT | 376 | NM_212535 | ||
| R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT | ||||||
| 6 | RLBP1 | F: TGCACCATTGAAGCTGGCTA | 361 | NM_000326 | ||
| R: AGAAGGGCTTGACCACATTG | ||||||
| 7 | RHOK | F: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA | 360 | NM_002929 | ||
| R: ATCCGGACATTGCCGTCATT | ||||||
| 8 | hOPN1SW | F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC | 373 | NM_001708 | ||
| R: AGCTGCATGTGTCGGATTCA | ||||||
| 9 | RCVRN | F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGT | 367 | NM_002903 | ||
| R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA | ||||||
| 10 | hABCA4 | F: CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT | 271 | NG_009073 | ||
| R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA | ||||||
| 11 | hRD3 | F: ATGGTGCTGGAGACGCTTAT | 328 | NM_183059 | ||
| R: CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA | ||||||
| 12 | hPDE6C | F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC | 351 | NM_006204 | ||
| R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT | ||||||
Tabella 1: Elenco dei primer gene-specifici per RT-PCR.
| Componenti per la miscela RNA-Primer | Volume (in μL) |
| RNA (1-2 μg) | n |
| 10 mM dNTP | 1 |
| 10 mM Oligo dT | 1 |
| Acqua trattata con DEPC | fino a 10 |
| Volume totale di reazione | 10 |
Tabella 2: Master mix RNA-primer per la conversione del cDNA.
| Componenti per Mastermix 2 | Volume (in μL) |
| Buffer RT 10x | 2 |
| 25 mM MgCl2 | 4 |
| 0,1 M DTT | 2 |
| SuperScript III Trascrittasi Inversa | 1 |
| RNaseOUT | 1 |
| Volume totale di reazione | 10 |
Tabella 3: Master mix 2 per la conversione del cDNA.
| Componenti della PCR | Volume (in μL)/reazione |
| Tampone PCR 10x | 2 |
| 2 mM dNTP | 2 |
| Primer anteriore (5 μM) | 1 |
| Primer inverso (5 μM) | 1 |
| Taq Polimerasi | 0.2 |
| Modello di cDNA (50-100 ng) | 1 |
| Acqua sterile Milli-Q | 12.8 |
| Volume totale di reazione | 20 |
Tabella 4: Master mix per PCR semi-quantitativa.
| Temperatura | Ore | N. di cicli | |
| Denaturazione | 95 °C | 5 minuti | x 1 |
| Denaturazione | 95 °C | 30 secondi | x 35 |
| Ricottura | 50-60 °C | 30 secondi | |
| Estensione | 72 °C | 30 secondi | |
| Estensione finale | 72 °C | 10 minuti | x 1 |
Tabella 5: Condizioni di amplificazione della PCR.
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Discussion
Le hiPSC sono un potente strumento per studiare lo sviluppo di organi e tessuti in vitro. Ricapitolare il fenotipo della malattia differenziando le hiPSC sane rispetto a quelle specifiche della malattia verso la linea retinica può aiutare a ottenere nuove conoscenze sulla fisiopatologia di diverse forme di distrofie retiniche ereditarie. Diversi protocolli sono stati descritti e adottati per la differenziazione in vitro delle PSC in tipi di cellule retiniche. La maggior parte di essi prevede l'uso di terreni di coltura contenenti cocktail complessi di fattori di crescita ricombinanti, integratori, piccole molecole e reagenti, come: integratori N1, N2 e B27; Bloccanti di segnalazione BMP e TGFβ come Noggin, SB431542, LDN193189 e Follistatin, o induttori come Activin A, Lefty e IDE1; bloccanti di segnalazione Wnt canonici come DKK1, SFRP, IWP-2 e IWR-1-endo, o induttori come CHIR99021, SB216763 e CKI-7; Bloccanti di segnalazione del recettore FGF come PD0325901 e PD173074 o induttori come bFGF; inibitori di segnalazione notch come DAPT; altre molecole di segnalazione come il fattore di crescita insulino-simile (IGF-1); acido retinoico; ormoni della crescita come triiodotironina (T3) e idrocortisone; e antiossidanti e altri fattori pro-sopravvivenza come acido ascorbico, nicotinamide, taurina, acido docosaesaenoico, 1-tioglicerolo, ecc. Questi componenti sono inclusi nel terreno di coltura in diversi stadi della differenziazione delle cellule staminali per stimolare o modulare varie cascate di segnalazione per indurre l'impegno della linea oculare e retinica 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.
Qui viene descritto un metodo più semplice, robusto ed efficiente per generare organoidi retinici direttamente da colture quasi confluenti e aderenti di hiPSCs. Il protocollo semplificato prevede l'utilizzo di meno integratori, fattori di crescita e piccole molecole che innescano principalmente la differenziazione iniziale delle PSC nella linea neuroectodermica. Le successive fasi di differenziazione si basano sulla capacità intrinseca delle PSC di differenziarsi in modo sincrono nel tipo cellulare di linee correlate, che quindi si auto-organizzano e regolano reciprocamente lo sviluppo e l'organizzazione spaziale di più tipi cellulari che contribuiscono alla formazione di tessuti complessi. La graduale sospensione di bFGF e l'aggiunta di Noggin aiutano a indurre con successo l'impegno precoce del destino neuro-ectodermico entro 3 giorni dalla differenziazione. Il mantenimento continuo delle colture di differenziazione in RDM induttori neurali, senza aggiungere fattori di crescita o piccole molecole, si traduce nell'induzione di strutture primordiali del campo oculare (EFP) con margini chiari, entro 3-4 settimane dalla differenziazione. Le EFP contengono cellule progenitrici multipotenti, che dopo un mantenimento indisturbato e continuo, provocano la differenziazione multi-lineage e l'auto-assemblaggio per formare EFP complesse costituite da coppe neuroretiniche posizionate centralmente o coppe ottiche (OC), circondate da altri tipi di cellule oculari correlate come l'epitelio pigmentato retinico (RPE), l'epitelio della cresta neurale e l'epitelio della superficie oculare. In alternativa, le PSC possono essere coltivate come colture in sospensione dal giorno 1-3 per formare EB in condizioni di coltura identiche. Gli EB possono essere ulteriormente placcati il giorno 4 e coltivati come colture aderenti su superfici rivestite di matrice in RDM per avviare la differenziazione della linea retinica, come descritto sopra. Le colture differenzianti sane danno abitualmente origine a circa 20-30 EFP per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Gli OC possono essere prelevati dalle EFP a 3-4 settimane di differenziazione retinica e vengono mantenuti in colture in sospensione per ulteriori 30-60 giorni, per consentire la differenziazione dei progenitori neuro-retinici e generare organoidi retinici maturi. Dopo 4 settimane di coltura in sospensione, circa il 70% -80% delle coppette ottiche prelevate dalle EFP rimangono intatte, mantengono la loro laminazione e si sviluppano in organoidi retinici maturi (OC-2M), con cellule fotorecettrici impegnate RCVRN + e CRX + ed estensioni simili a segmenti interni all'interno degli strati più esterni.
La confluenza delle colture iPSC in crescita è fondamentale al momento dell'inizio della differenziazione e dello spostamento delle colture a DIM. Le colture con colonie più piccole e confluenza inferiore al 60% e quelle che si differenziano precocemente, si traducono in numeri EFP significativamente ridotti. Quando emergono i cluster del campo oculare, l'isola centrale delle coppe neuroretiniche dovrebbe essere raccolta entro 1 settimana. Questo può essere fatto spingendo delicatamente e sollevando le tazze intatte usando l'angolo o la regione curva della punta capillare di vetro tirata a fiamma, come descritto nella sezione protocollo. Bisogna fare attenzione a non danneggiare le tazze. Ulteriori ritardi nella raccolta comporterebbero un appiattimento e una perdita di organizzazione 3D a causa della proliferazione e della migrazione delle cellule progenitrici neuroretiniche, che rendono difficile la raccolta e si traducono in organoidi retinici atipici.
L'efficienza dell'induzione del campo oculare e della maturazione delle coppe retiniche varia tra le diverse linee hiPSC specifiche della malattia o del paziente, a seconda dei difetti genetici sottostanti. Ad esempio, l'impegno della linea retinica e l'efficienza di formazione dell'EFP di una linea specifica della malattia RP erano identici a quelli delle cellule di controllo sane, mentre una linea nulla RB1 non è riuscita a formare EFP (dati non mostrati). Alcune linee portatrici di mutazioni legate all'amaurosi congenita di Leber hanno formato EFP atipiche con difetti nelle loro dimensioni, autoassemblaggio, laminazione e maturazione dei progenitori retinici (dati non mostrati). Ulteriori validazioni molecolari e profili di espressione genica di organoidi retinici paziente-specifici rispetto a tessuti di controllo sani sarebbero necessari per comprendere la fisiopatologia di una condizione patologica. Considerando la variabilità nei genomi dei pazienti e il coinvolgimento di reti multigeniche nelle manifestazioni della malattia, può anche essere importante studiare organoidi retinici derivati da linee iPSC isogeniche per stabilire una correlazione assoluta genotipo-fenotipo negli studi di modellizzazione della malattia. Tali linee isogeniche possono essere create sia mediante knockout genici mirati in linee di controllo sane sia correggendo le mutazioni patogene nelle iPSC paziente-specifiche, utilizzando tecniche avanzate di editing del genoma 8,9.
Tali organoidi retinici intatti derivati da linee iPSC normali o specifiche della malattia possono essere utilizzati nello screening e nei test di nuovi farmaci. I precursori dei fotorecettori all'interno degli organoidi retinici e di altri tipi di cellule oculari, come l'RPE e l'epitelio corneale all'interno delle escrescenze EFP, possono essere ulteriormente isolati e arricchiti per le loro applicazioni nella ricerca di base e nella medicina rigenerativa. Il protocollo qui descritto può essere facilmente adottato per i processi conformi alle GMP per la preparazione di cellule di grado clinico destinate a valutazioni precliniche e di studi clinici.
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Disclosures
Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse o divulgazioni finanziarie.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il supporto scientifico e tecnico del Dr. Chitra Kannabiran, genetista; Dr. Subhadra Jalali, consulente della retina; Dr. Milind Naik, chirurgo oculoplastico; e il Dr. Swathi Kaliki, oncologo oculare presso il LV Prasad Eye Institute, Hyderabad verso la generazione di linee iPSC normali e specifiche per il paziente. Gli autori riconoscono le sovvenzioni di ricerca e sviluppo del Science and Engineering Research Board, Department of Science and Technology (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Department of Biotechnology (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) e Senior Research Fellowships di ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) e CSIR (V.K.P.), Government of India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
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