Name: Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a gerar organoides de retina a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando culturas aderentes e em suspensão. Este método eficiente permite estudar doenças retinianas degenerativas e desenvolver terapias celulares.

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Os autores agradecem o apoio científico e técnico do Dr. Chitra Kannabiran, Geneticista; Dra. Subhadra Jalali, Consultora de Retina; Dr. Milind Naik, Cirurgião Oculoplástico; e o Dr. Swathi Kaliki, oncologista ocular do LV Prasad Eye Institute, Hyderabad, para a geração de linhas iPSC normais e específicas do paciente. Os autores agradecem as bolsas de P&&D do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia, Departamento de Ciência e Tecnologia (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Departamento de Biotecnologia (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) e Bolsas de Pesquisa Sênior do ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) e CSIR (V.K.P.), Governo da Índia.

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<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95(2019).</li>
<li>Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+development+of+rod+photoreceptors+in+retinal+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+by+supplementation+with+9-cis+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100033(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
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<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
</ol>

Todos os autores não têm conflitos de interesse ou divulgações financeiras.

hiPSCs são uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento de órgãos e tecidos in vitro. Recapitular o fenótipo da doença diferenciando hiPSCs saudáveis versus doença-específicas em direção à linhagem retiniana pode ajudar a obter novos conhecimentos sobre a fisiopatologia de diferentes formas de distrofias hereditárias da retina. Vários protocolos têm sido descritos e adotados para a diferenciação in vitro de CTPs em tipos celulares da retina. A maioria deles envolve o uso de meio de cultura con...

A retina é um tecido sensível à luz presente na parte de trás do olho do vertebrado que converte sinais luminosos em impulsos nervosos por um fenômeno bioquímico conhecido como via de fototransdução. Os impulsos nervosos iniciais gerados nas células fotorreceptoras da retina são transduzidos para outros interneurônios da retina e células ganglionares da retina (RGCs) e atingem o córtex visual do cérebro, o que ajuda na percepção da imagem e na resposta visual.
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que 1,5 milhão de crianças sejam cegas, das quais 1 milhão estão na Ásia. A distrofia hereditária da retina (DIR) é uma importante doença cegante que afeta 1 em cada 4.000 indivíduos em todo o mundo 1,2,3, enquanto a prevalência de cegueira associada à degeneração macular relacionada à idade (DMRI) varia de 0,6%-1,1% em países emdesenvolvimento4. Os IRDs são causados por defeitos genéticos hereditários em mais de 300 genes diferentes envolvidos no desenvolvimento e função da retina5. Tais alterações genéticas resultam na interrupção das funções normais da retina e na degeneração gradual das células da retina, nomeadamente as células fotorreceptoras e o epitélio pigmentado da retina (EPR), levando assim a uma grave perda de visão e cegueira. Enormes progressos foram feitos em outras condições de cegamento envolvendo a córnea, lente, etc. No entanto, distrofias retinianas e atrofias do nervo óptico não têm nenhuma terapia comprovada até o momento. Uma vez que a retina humana adulta não possui células-tronco6, fontes alternativas como células-tronco embrionárias (CTEs) e células-tronco pluripotentes induzidas derivadas do paciente (iPSCs) podem fornecer um suprimento ilimitado de tipos celulares desejados e ser uma grande promessa para o desenvolvimento de organoides teciduais complexos necessários para estudos de modelagem de doenças in vitro e para o desenvolvimento de terapias regenerativas7, 8,9,10.
Vários anos de pesquisa na retina levaram a uma melhor compreensão dos eventos moleculares que orquestram o desenvolvimento inicial da retina. A maioria dos protocolos para gerar células da retina e organoides 3D a partir de PSCs visa recapitular esses eventos de desenvolvimento in vitro, cultivando as células em um complexo coquetel de fatores de crescimento e pequenas moléculas para modular os processos biológicos conhecidos de forma escalonada. Os organoides da retina assim gerados são constituídos pelas principais células da retina: células ganglionares da retina (CGRs), interneurônios, fotorreceptores e epitélio pigmentado da retina (EPR)11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Apesar das tentativas bem-sucedidas de modelar IRDs usando organoides da retina, a exigência do complexo coquetel de fatores de crescimento e pequenas moléculas durante a diferenciação e a eficiência relativamente baixa da geração de organoides da retina representam um grande desafio com a maioria dos protocolos. Incluem principalmente a formação de corpos embrionários, seguida de sua diferenciação gradual em linhagens retinianas utilizando condições complexas de cultura em diferentes estágios de desenvolvimento in vitro 20,21,22.
Aqui, um método simplificado e robusto de desenvolvimento de organoides neuro-retinianos 3D complexos a partir de controle saudável e hiPSCs específicas da doença da retina é relatado. O protocolo aqui descrito utiliza a diferenciação direta de culturas de hiPSC quase confluentes sem a necessidade de formação de corpo embrionário. Além disso, a complexidade do meio de cultura é simplificada, tornando-o uma técnica custo-efetiva e reprodutível que pode ser facilmente adotada por novos pesquisadores. Envolve um sistema híbrido de cultura que consiste em culturas aderentes de monocamadas durante as primeiras 4 semanas de diferenciação retiniana até o surgimento de grupos primordiais de campos oculares (PFEs) distintos e auto-organizados. Além disso, as ilhas neuro-retinianas circulares dentro de cada EFP são colhidas manualmente e cultivadas em culturas de suspensão por 1-2 semanas para preparar copos de retina 3D multicamadas ou organoides consistindo de precursores neuro-retinais de proliferação PAX6+ e CHX10+. A cultura prolongada de organoides da retina em meio contendo taurina 100 μM por mais 4 semanas resultou no surgimento de precursores fotorreceptores RCVRN+ e CRX+ e células maduras com extensões rudimentares semelhantes a segmentos internos.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m Filtros de seringa</td><td>TPP</td><td>99722&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Chx10; Anticorpo monoclonal</td><td>Santa Cruz</td><td>SC365519</td><td>1:50 de camundongo</td></tr><tr><td>anti-CRX de diluição; Abcam monoclonal de coelho</td><td>ab140603</td><td>diluição 1:300</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MiTF, Abcam monoclonal de camundongo</td><td>ab3201</td><td>diluição 1:250</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-recoverina; Coelho policlonal&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td>diluição 1:300</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x), sem soro</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Basic Fator de crescimento de fibroblastos (bFGF)</td><td>Centrífuga Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar (50 mL)</td><td>Tarson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC-Qualified</td><td>Matrix Corning</td><td></td><td></td>354277</tr><tr><td>CryoTubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>V7884</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX (meio basal)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA polimerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0709</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s Kit de Fosfato Tampolado Salino</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>Sigma Placa de</td> Petri Tratada com TC <td>Aldrich E5134</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, 60 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Fetal&nbsp; Bovinos&nbsp; Sérum, qualificado, Estados Unidos&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>GelDocXR+ com software de laboratório de imagem</td><td>Sistema de documentação de gel de</td><td>agarose BIO-RAD</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td> IgG anti-rato de cabra com <td>diluição 1:300</td></tr><tr><td>(H+L), Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td> IgG anti-coelho de cabra com <td>diluição 1:300</td></tr><tr><td>(H+L), Alexa Fluo 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td> IgG anti-coelho de cabra com <td>diluição 1:300</td></tr><tr><td>(H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>diluição 1:300</td></tr><tr><td>HistoCore MULTICUT</td><td>Leica</td><td></td><td>Para seccionamento</td></tr><tr><td>KnockOut Substituição de Soro</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Acsorbic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Para quantificar RNA</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Qualigens</td><td>23995</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur, 9 polegadas, Não Estéril, Desconectadas</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina&nbsp;</td>Anticorpo recombinante Anti-Otx2 de <td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr>, anticorpo <tr><td>recombinante monoclonal do</td> Anti-PAX6 da diluição <td>de Abcam</td><td>ab183951</td> do coelho 1<td>:300</td></tr><tr><td>; Abcam monoclonal de coelho</td><td></td><td>ab195045</td><td>diluição 1:300</td></tr><tr><td>anticorpo anti-RPE65 recombinante, Abcam monoclonal de coelho</td><td></td><td>ab231782</td><td>diluição 1:300</td></tr> proteína <tr><td>de cabeça humana recombinante R</td><td>& D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas 10 mL</td><td>TPP</td><td>94010</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas 5 mL</td><td>TPP</td><td>94005</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio tribásico di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Starfrost ( revestido com silano) lâminas microscópicas</td><td>Knittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp; Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montagem Média com DAPI&nbsp;</td><td>Laboratórios de vetores</td><td>H-1200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Thermo Fisher</td><td>A27940</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato (inibidor da Rho-quinase)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Microscópio confocal</td> <td>Zeiss</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de organoides da retina a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos saudáveis e específicas de doenças da retina

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Células-tronco pluripotentes podem gerar organoides teciduais complexos que são úteis para estudos de modelagem de doenças in vitro e para o desenvolvimento de terapias regenerativas. Este protocolo descreve um método mais simples, robusto e gradual de geração de organoides da retina em um sistema híbrido de cultura consistindo de culturas aderentes de monocamadas durante as primeiras 4 semanas de diferenciação retiniana até o surgimento de grupos primordiais de campo ocular (PFEs) distintos e auto-organizados. Além disso, as ilhas neurorretinianas em forma de rosca, circulares e translúcidas dentro de cada EFP são manualmente colhidas e cultivadas sob suspensão usando placas de cultura não aderentes em um meio de diferenciação retiniana por 1-2 semanas para gerar copos ópticos 3D multicamadas (OC-1M). Estes organoides imaturos da retina contêm precursores multipotentes da retina com proliferação de PAX6+ e ChX10+. As células precursoras são linearmente auto-organizadas dentro dos organoides e aparecem como estrias radiais distintas. Após 4 semanas da cultura de suspensão, os progenitores da retina sofrem parada pós-mitótica e diferenciação de linhagens para formar organoides retinianos maduros (OC-2M). Os precursores comprometidos da linhagem fotorreceptora desenvolvem-se dentro das camadas mais externas dos organoides da retina. Essas células fotorreceptoras CRX+ e RCVRN+ amadurecem morfologicamente para exibir extensões segmentares internas. Este método pode ser adotado para a geração de organoides da retina usando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Todas as etapas e procedimentos são claramente explicados e demonstrados para garantir a replicabilidade e para aplicações mais amplas em ciência básica e pesquisa translacional.

A diferenciação das hiPSCs em linhagens oculares é obtida pela cultura das células em diferentes coquetéis de meio de cultura contendo suplementos e fatores de crescimento em etapas sequenciais em diferentes momentos, conforme descrito na Figura 1. As culturas de hiPSC são mantidas em meio Essential 8, o meio de manutenção de células-tronco pluripotentes. Uma vez que atinjam 70%-80% de confluência (Figura 2A), o meio é substituído por Meio de Indução de Diferenc...

Este protocolo descreve um método eficiente de diferenciar hiPSCs em clusters de campos oculares e gerar organoides neuro-retinianos usando condições de cultura simplificadas envolvendo sistemas de cultura aderentes e de suspensão. Outros tipos de células oculares, como o EPR e o epitélio corneano, também podem ser isolados de campos oculares maduros em culturas de retina.

Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

Este protocolo descreve um método simples e eficiente de diferenciar CPIs humanas em organoides neurorretinianos tridimensionais complexos para pesquisa e aplicações regenerativas. Essa técnica envolve culturas aderentes e de suspensão, o que permite a coleta seletiva e o enriquecimento tanto dos organoides da retina quanto das células do FR. Ele pode oferecer um suprimento viável e regular de fontes celulares para o desenvolvimento de terapias baseadas em células para doenças degenerativas da retina.Tais organoides da retina derivados de células-tronco e células RPE são úteis como modelos in vitro para estudar o desenvolvimento ocular e doenças hereditárias da retina. Este método pode ser facilmente replicado por laboratórios de pesquisa que já estão familiarizados com o manuseio de culturas humanas de IPSC. A demonstração visual apoia grandemente a identificação de campos oculares e o isolamento de copos neurorretinários com base em seu posicionamento espacial e características morfológicas.Para começar, aspirar o meio gasto de 70 a 80% de culturas humanas de IPSC confluentes em placas de seis poços. Adicione PBS aos poços, gire-os e aspirar o tampão de lavagem. Em seguida, adicione um mililitro de solução de dissociação celular ou CDS a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por cinco a sete minutos até que as células se arredondam.Aspirar o CDS e coletar a suspensão celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Gire o tubo a 1.000 RPM por quatro minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1,2 mililitros do meio Essential 8.Distribuir 200 microlitros da suspensão celular em cada poço de uma placa de seis poços revestida com matriz contendo 1,5 mililitros de meio de cultura IPSC e 10 micromolares Y27632. Após 12 a 24 horas, retirar o meio gasto e adicionar meio de ascensão completo pré-aquecido sem Y27632 para manter as culturas. Troque o meio de cultura a cada 24 horas até que as culturas atinjam 70 a 80% de confluência.No dia zero, aspirar o meio de manutenção IPSC humano e adicionar um nanograma por mililitro BFGF e um nanograma por mililitro Noggin à placa de seis poços. Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%. No primeiro dia, aspirar o meio gasto e adicionar um meio de indução de diferenciação contendo um nanograma por mililitro BFGF e 10 nanogramas por mililitro Noggin.Incube as células novamente a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%. Nos dias dois e três, retire o meio gasto e adicione o meio de indução de diferenciação contendo 10 nanogramas por mililitro de Noggin. Depois de adicionar dois mililitros por meio de poço a uma placa de seis poços, incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% e troque o meio a cada 24 horas.No quarto dia, remova o meio gasto e adicione o meio de diferenciação retiniana ou RDM. Siga o mesmo procedimento para adicionar dois mililitros por poço médio a uma placa de seis poços e incubar as culturas. Mude o meio todos os dias.Por volta dos dias 14 e 18, observar as culturas ao microscópio com aumento de 10X para o surgimento de domínios neurais semelhantes a rosetas constituídos por progenitores precoces do campo ocular. Por volta dos dias 21 e 28, observar as culturas ao microscópio em aumentos de 4X e 10X para observar a emergência de PFEs distintas auto-organizadas com uma ilha central de estruturas neurorretinianas circulares 3D cercadas por crescimentos contíguos de neuroepitélio e epitélio da superfície ocular. Pegue uma pipeta Pasteur estéril e segure a base em uma mão e a ponta capilar na outra.Esterilizar a chama e aquecer a região próxima ao meio da ponta capilar com movimentos rotacionais até que o vidro fique maleável. Em seguida, afaste-se da chama e puxe rapidamente a ponta capilar para fora para criar uma ponta capilar fina com um lúmen fechado. Segure a ponta fina horizontalmente na frente da chama e passe-a rapidamente através da chama em um movimento para fora para criar um gancho liso ou uma ponta capilar em forma de L.Sob um microscópio estéreo, escolha manualmente os copos neurorretinários bem formados dos EFPs individuais usando a zona de curvatura externa lisa do gancho capilar como uma colher fina. Nos dias 25 e 30, adicionar quatro mililitros de meio de diferenciação retiniana pré-aquecido em uma placa de baixa fixação de 60 milímetros para cultura e manter copos de retina para gerar organoides retinianos 3D. Isso deve ser feito antes de colher os copos neurorretinianos.Coloque uma micropipeta de um milímetro para aspirar 100 microlitros e use micropontas de um mililitro com aberturas de furo largo para aspirar e transferir os copos de retina flutuantes para os pratos frescos de cultura de baixa aderência preparados anteriormente. Manter os copos da retina em RDM como culturas de suspensão não aderentes e incubá-los a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%. Nos dias 30 e 45, seguindo um método de alimentação parcial, retire metade do volume do meio gasto e substitua-o por um volume igual de meio fresco.Nos dias 45 e 60, cultivar os organoides da retina por mais duas semanas em RDM contendo 100 taurina micromolar para apoiar melhor sobrevivência e diferenciação de linhagem de progenitores neurorretinários e o desenvolvimento de tipos de células retinianas maduras. Os organoides da retina são caracterizados em diferentes estágios de maturação para a expressão de vários marcadores progenitores da retina usando RT-PCR e imunohistoquímica. Os resultados da RT-PCR confirmaram a indução e expressão de marcadores neurorretinários em organoides retinianos com um mês de idade e organoides retinianos com dois meses de idade.As imagens confocais de cortes imunomarcados de organoides imaturos da retina usando anticorpos contra os marcadores progenitores neurorretinários Chx10, PAX6 e Otx2, e organoides da retina madura usando anticorpos contra os marcadores precursores de fotorreceptores recuperamina e CRX são mostradas aqui. A camada mais externa marcada dos organoides da retina com células fotorreceptoras diferenciadoras é ampliada e mostrada nessas imagens. As extensões rudimentares em forma de segmento interno são marcadas por setas brancas.Os agrupamentos de EFP com a taça neurorretiniana no centro e as excrescências migratórias de EPR mostram pigmentação ao longo das bordas dianteiras. Crescimentos epiteliais pigmentados bem diferenciados de múltiplas EFPs ao redor da ilha neurorretiniana são mostrados aqui. A maior magnificação de um PFE mostra a zona migratória dos progenitores do EPR e o epitélio da superfície ocular ao redor de uma taça neurorretiniana.Culturas aderentes estendidas que desenvolveram monocamadas de células imaturas de EPR contendo células pigmentadas e não pigmentadas são mostradas aqui. Culturas de monocamadas de células RPE totalmente maduras e pigmentadas mostram morfologia de paralelepípedos aos 60 dias. As células RPE que expressam PAX6, MITF e RPE65 são mostradas nesta figura.Essas imagens representam PFE com agregados anormais de progenitores da retina com laminação distorcida e ausência de estrias. O PFE com a taça neurorretiniana em miniatura, mas sem a zona circundante de EPR e o epitélio da superfície ocular são mostrados nesta figura. A imagem representativa mostra agregados neurorretinários irregulares formados na cultura em suspensão.É muito crítico iniciar o processo de diferenciação usando culturas de crescimento quase confluente de IPCs para obter indução eficiente de campos oculares dentro de três a quatro semanas. Organoides da retina e células do EPR geradas a partir de IPCs normais e específicas do paciente podem ser usados como modelos de doenças retinianas e para testar novas drogas terapêuticas.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina

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