Artigo de método

Detecção de Transferência Horizontal de Genes Mediada por Plasmídeos Conjugativos Naturais em E. coli

DOI:

10.3791/64523

⸱

24 de março de 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A conjugação medeia a transferência horizontal de genes mobilizando o DNA plasmídico através de duas células diferentes, facilitando a disseminação de genes benéficos. Este trabalho descreve um método amplamente utilizado para a detecção eficiente da transferência conjugativa de plasmídeos, baseado no uso de marcadores diferenciais no plasmídeo conjugativo, doador e receptor para detectar a transconjugação.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A conjugação representa um dos principais mecanismos que facilitam a transferência horizontal de genes em bactérias Gram-negativas. Este trabalho descreve métodos para o estudo da mobilização de plasmídeos conjugativos de ocorrência natural, utilizando como exemplo dois plasmídeos de ocorrência natural. Esses protocolos dependem da presença diferencial de marcadores selecionáveis no plasmídeo doador, receptor e conjugativo. Especificamente, os métodos descritos incluem 1) a identificação de plasmídeos conjugativos naturais, 2) a quantificação das taxas de conjugação em cultura sólida e 3) a detecção diagnóstica dos genes de resistência a antibióticos e tipos de replicões plasmídicos em receptores transconjugantes por reação em cadeia da polimerase (PCR). Os protocolos aqui descritos foram desenvolvidos no contexto do estudo da ecologia evolutiva da transferência horizontal de genes, para rastrear a presença de plasmídeos conjugativos portadores de genes de resistência a antibióticos em bactérias encontradas no ambiente. A transferência eficiente de plasmídeos conjugativos observada nesses experimentos em cultura destaca a relevância biológica da conjugação como um mecanismo que promove a transferência horizontal de genes em geral e a disseminação da resistência aos antibióticos em particular.

Introdução

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Em 1946, Lederberg e Tatum1 descreveram um processo sexual em Escherichia coli K-12 que agora é conhecido como conjugação. A conjugação bacteriana é o processo pelo qual uma célula bacteriana (o doador) transfere unidirecionalmente material genético para outra célula (o receptor) por contato direto célula-a-célula. A conjugação é amplamente distribuída em bactérias2,3, embora a fração de células doadoras que expressam a maquinaria de conjugação seja tipicamente muito pequena4.

Os plasmídeos são elementos de DNA extracromossômico que se replicam de forma autônoma. Além dos genes envolvidos na replicação e manutenção dos plasmídeos, os plasmídeos frequentemente carregam uma carga de genes envolvidos na adaptação a desafios ambientais, como metais pesados ou exposição a antibióticos5. Os plasmídeos conjugativos são uma classe de plasmídeos com um conjunto de genes especializados que permitem sua transferência para as células receptoras e sustentam sua persistência após a transferência6. Os plasmídeos conjugativos variam em tamanho de 21,8 kb a 1,35 Mb em bactérias do filo Pseudomonadota (sinônimo de Proteobacteria), com mediana em torno de 100 kb 5,7. Eles também geralmente têm um baixo número de cópias, possivelmente para manter a carga metabólica sobre o hospedeiro baixa 8,9.

O aparelho conjugativo típico é composto por quatro componentes: uma origem de transferência (oriT), uma relaxase, uma proteína de acoplamento tipo IV e um sistema de secreção tipo IV (uma estrutura em forma de tubo chamada pilus que permite que os doadores entrem em contato com os receptores)6. Apenas uma fração muito pequena de células portadoras de plasmídeos conjugativos expressa a maquinaria de conjugação4, mas se os plasmídeos fornecerem uma vantagem de aptidão, os transconjugantes podem se expandir rapidamente na população. Entre 35% e mais de 80% dos isolados de E. coli coletados de diferentes habitats apresentam plasmídeos conjugativos com genes que conferem resistência a pelo menos um antibiótico10,11; portanto, a transferência horizontal de genes mediada por plasmídeos conjugativos é um dos principais mecanismos que impulsionam a disseminação global de genes de resistência a antibióticos12.

Experimentos de acasalamento realizados em cultura laboratorial mostraram que a frequência de conjugação é afetada por múltiplos fatores, incluindo a natureza das células receptoras, a fase de crescimento, a densidade celular, a relação doador-receptor, se a conjugação é conduzida em meios líquidos ou sólidos, carbono, oxigênio, sais biliares, concentrações de metais, presença de células de mamíferos, temperatura, pH e tempo de acasalamento13,14, 15.

Este trabalho descreve protocolos para detectar a presença de plasmídeos conjugativos em uma determinada cepa hospedeira, quantificar as taxas de conjugação em cultura sólida e verificar novamente sua transferência para células receptoras. Esses protocolos podem ser utilizados como um primeiro passo para a identificação de plasmídeos conjugativos naturais adequados para pesquisa. Eles usam um número mínimo de etapas simplificadas porque são projetados para rastrear a presença de plasmídeos conjugativos em bactérias obtidas de múltiplas fontes (ambientais, mensais e patogênicas) em escala (dezenas a centenas de doadores).

Além disso, são mostrados testes para detectar se a mobilização de um determinado plasmídeo conjugativo é independente do antibiótico usado para detecção (ou seja, a relevância do gene de resistência a antibióticos sob seleção) e para comparar as taxas de conjugação de dois plasmídeos conjugativos encontrados em diferentes isolados ambientais.

Com base na composição genética dos plasmídeos conjugativos relevantes (replicão plasmídico e composição gênica de resistência a antibióticos), cada etapa do protocolo pode ser modificada para estudar o impacto de uma variedade de fatores que provavelmente afetarão a taxa de conjugação.

Delineamento experimental geral:
Os componentes essenciais necessários para estabelecer um experimento de acasalamento são células doadoras, uma cepa receptora e meios sólidos para selecionar doadores (antibiótico A), receptores (antibiótico B) e transconjugantes (antibióticos A e B). Os transconjugantes são células receptoras que mantêm de forma estável o plasmídeo conjugativo do doador.

As células doadoras são resistentes a um antibiótico (antibiótico A) e são suscetíveis ao marcador ou marcadores usados para selecionar as células receptoras (antibiótico B). A localização genômica do gene de resistência a antibióticos (ou seja, se ele está localizado no cromossomo ou em um plasmídeo da célula doadora) não precisa ser conhecida a priori, porque a mobilização de marcadores de resistência a antibióticos para o receptor (após um contato direto doador-receptor) implica que os marcadores fornecidos pelo doador estavam em um plasmídeo.

Uma cepa receptora (conhecida por tomar plasmídeos conjugativos) precisa ter um marcador selecionável estável não presente no doador; este marcador selecionável é geralmente resistente a um antibiótico ou biocida localizado no cromossomo. A seleção do receptor a ser utilizado em experimentos de acasalamento é fundamental, pois algumas cepas de E. coli variam em sua capacidade de tomar plasmídeos conjugativos16.

Uma vez estabelecidos esses componentes, qualquer colônia que cresça em meio com antibióticos (A e B) após um contato do par doador-receptor é um suposto transconjugante (Figura 1). Isso está assumindo que os doadores podem crescer em meios com o antibiótico A, mas não podem crescer em meios com o antibiótico B, e que os receptores são capazes de crescer em meios com o antibiótico B, mas não podem crescer com o antibiótico A. A transconjugação pode ser confirmada usando dois testes diagnósticos. O primeiro teste consiste na detecção (por amplificação de genes por reação em cadeia da polimerase [PCR], ou outros métodos) de genes encontrados no plasmídeo conjugativo em colônias transconjugantes. O segundo teste envolve o uso de marcadores diferenciais de cor da colônia com base no metabolismo da lactose. A cor diferencial da colônia é revelada pelo uso do ágar MacConkey; a lactose no ágar pode ser usada como fonte de fermentação por microrganismos fermentadores de lactose (lac+). Esses microrganismos produzem ácidos orgânicos, particularmente o ácido lático, que diminuem o pH. O vermelho neutro é um indicador de pH incluído no meio que passa de esbranquiçado para vermelho/rosa brilhante à medida que o pH cai abaixo de 6,817. Assim, cepas positivas para lactose de E. coli produzem colônias rosa maiores no ágar MacConkey, enquanto as cepas negativas para lactose produzem colônias amarelas pálidas e menores no ágar MacConkey.

Diagrama de transferência de plasmídeo conjugativo; doador para receptor via conjugação; resistência a antibióticos, análise de PCR.
Figura 1: Delineamento experimental utilizado para detectar a presença de plasmídeos conjugativos em cepas doadoras. Neste exemplo, o doador carrega um plasmídeo conjugativo com um gene de resistência a antibióticos que confere resistência ao antibiótico A, mas eles são suscetíveis ao antibiótico B. Por outro lado, o receptor tem um determinante de resistência cromossômica que confere proteção contra o antibiótico B, mas é suscetível ao antibiótico A. Os transconjugantes são resistentes a ambos os antibióticos (A e B), porque eles têm o plasmídeo conjugativo do doador que confere resistência ao antibiótico A e o cromossomo do receptor que confere proteção contra o antibiótico B. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A taxa de conjugação de um par dador-receptor (em determinadas condições experimentais) pode ser calculada dividindo o número de transconjugantes pelo número de dadores ou pelo número de receptores; a primeira taxa indica a fração de células doadoras que exibem expressão funcional da maquinaria de conjugação pelo doador16,18, enquanto a segunda taxa indica a capacidade do receptor de tomar plasmídeos conjugativos 19,20. Neste estudo, salvo indicação em contrário, a taxa de conjugação representa a fração de células receptoras que se tornam transconjugantes (ou seja, taxa por receptor).

Aqui, dois experimentos independentes de acasalamento são relatados, envolvendo um receptor de E. coli e dois doadores de E. coli. Além disso, diferentes antibióticos foram usados para selecionar transconjugantes para um dos doadores para confirmar que um único plasmídeo multirresistente pode ser selecionado com qualquer um dos genes de resistência a antibióticos encontrados no plasmídeo conjugativo.

As cepas doadoras e receptoras utilizadas neste trabalho foram totalmente sequenciadas para entender todos os componentes deste sistema experimental; no entanto, esses protocolos foram projetados para rastrear a presença de plasmídeos conjugativos em hospedeiros de sequência desconhecida, podendo ser utilizados também nesse contexto experimental; no entanto, neste caso, os genes relevantes são sequenciados primeiro.

As estirpes dadoras e receptoras utilizadas no protocolo são as seguintes:

Doador 1. E. coli SW4955 foi coletado em um lago em Baton Rouge (LA, EUA). Possui um plasmídeo conjugativo de 134.797 pb (p134797) com emendas IncFIC(FII) e IncFIB (AP001918). Este plasmídeo conjugativo possui genes que conferem resistência a cefalosporinas de terceira geração (blaCTX-M-55), aminoglicosídeos (aac(3)-IIa e aadA1), fenicolares (catA2), tetraciclinas (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) e sulfonamidas (sul3). Para obter um mapa completo da p134797, consulte a Figura 2A. E. coli SW4955 é lactose-positivo, produzindo colônias rosa em ágar MacConkey.

Doador 2. E. coli SW7037 foi coletado no Lago Erie (Condado de Ottawa, OH, EUA). Ele carrega um plasmídeo conjugativo de 101.718 pb (p101718) com uma emenda IncI1-I(Alpha). Este plasmídeo conjugativo tem um gene que confere resistência aos beta-lactâmicos (blaCMY-2). Para obter um mapa completo da p101718, consulte a Figura 2B. E. coli SW7037 também é positivo para lactose, produzindo colônias cor-de-rosa no ágar MacConkey.

Mapas circulares do genoma dos plasmídeos de E. coli p134797 e p101718, destacando genes de resistência.
Figura 2: Mapa genético dos plasmídeos conjugativos utilizados neste estudo . (A) Plasmídeo p134797, o plasmídeo conjugativo encontrado na cepa SW4955 de E. coli. (B) Plasmídeo p101718, o plasmídeo conjugativo encontrado na estirpe SW7037 de E. coli. Os genes de resistência a antibióticos são destacados em azul e os genes pertencentes ao aparelho conjugativo são destacados em vermelho. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Destinatário. E. coli LMB100 é usado como destinatário. Esta é uma estirpe sem plasmídeos que é resistente à rifampicina (100 mg/L) e à estreptomicina (100 mg/L). Ter resistência a dois antibióticos reduz a possibilidade de surgirem mutações de resistência no doador que interfeririam na interpretação dos resultados. Além disso, a E. coli LMB100 é negativa à lactose e pode ser distinguida das duas cepas doadoras porque produz colônias amarelas pálidas e pequenas (em oposição às colônias maiores e rosas) no ágar MacConkey.

Quando o doador é lactose-negativo, recomendamos o uso de um receptor positivo para lactose (por exemplo, E. coli J53). As cepas LMB100 e J53 estão disponíveis para outros laboratórios para uso. Por favor, envie um pedido ao Dr. Gerardo Cortés-Cortés juntamente com um endereço e número FedEx.

O meio sólido necessário para selecionar e contar doadores, receptores e transconjugantes é o ágar MacConkey em placas de Petri de 100 mm de diâmetro. É necessária a adição dos seguintes antibióticos: (i) Média A: carbenicilina (100 mg/L) para contar os dadores e garantir que os recetores não podem crescer com este antibiótico. ii) Meios B: rifampicina (100 mg/L) + estreptomicina (100 mg/L) para contar os recetores e garantir que os dadores não podem crescer nestes dois antibióticos. iii) Meios AB: carbenicilina (100 mg/L) + rifampicina (100 mg/L) + estreptomicina (100 mg/L) para obtenção e contagem de transconjugantes. iv) Meios C: ausência de antibióticos para riscar todos os isolados estudados.

As taxas de conjugação de plasmídeos conjugativos de E. coli SW4955 e E. coli SW7037 a E. coli LMB100 são comparadas. Além disso, no caso do plasmídeo conjugativo p134797 (cepa SW4955), o antibiótico carbenicilina (100 mg/L) é substituído por gentamicina (2 mg/L), cloranfenicol (25 mg/L), tetraciclina (10 mg/L), trimetoprim (20 mg/L) ou sulfametoxazol (100 mg/L) em experimentos subsequentes para estabelecer se o marcador de resistência a antibióticos usado para seleção tem algum impacto nos resultados.

Protocolo

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1. Método 1: Conjugação

  1. Dia 1: Estrie os doadores e receptores. Estrie separadamente dos estoques de glicerol no meio C (ágar MacConkey sem antibióticos) e incube durante a noite a 37 °C.
    NOTA: Esta etapa é necessária para garantir que o experimento seja conduzido com isolados puros e para confirmar o fenótipo da lactose pela cor das colônias.
  2. Dia 2: Rotule um tubo de cultura de 14,0 mL para cada doador e receptor. Selecione uma única colônia de cada doador e receptor e cultive-os durante a noite (18 h) em tubos de cultura separados de 14,0 mL contendo 2 mL de caldo Mueller Hinton a 37 °C e agitando a 200 rpm.
    NOTA: Nas cepas utilizadas, a fase estacionária é atingida após a cultura noturna de 18 h.
  3. Dia 3: Medir a densidade óptica a 600 nm (OD600) da cultura noturna de cada doador e receptor (sem vórtice) usando uma diluição de 1:10 de 900 μL de solução salina e 100 μL da cultura noturna.
  4. Ajustar a densidade óptica de cada doador e receptor para 2,0 (OD600 = 2,0) com solução salina esterilizada (NaCl a 0,85% em água).
    NOTA: Uma cultura noturna de E. coli com uma OD600 = 2,0 tem 1,6 x 109 UFC/mL.
  5. Rotule um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL de "tubo de acasalamento", indicando as cepas doadora e receptora. Transfira 500 μL da suspensão ajustada (OD600 = 2,0) de cada doador e receptor, e coloque-os no tubo de acasalamento (este tubo de acasalamento teria 0,8 x 109 UFC/mL de cada doador e receptor). Misture suavemente o tubo de acasalamento por inversão.
  6. Centrifugar o tubo de acasalamento durante 10 min a 500 x g à temperatura ambiente.
  7. Sem perturbar o pellet, pipetar 800 μL do tubo de conjugação. Deve haver 200 μL restantes no tubo de conjugação.
    NOTA: Descarte o sobrenadante para um recipiente de 10% de água sanitária para desativar as bactérias na suspensão.
  8. Incubar o tubo de acasalamento durante 18 h (durante a noite) a 37 °C numa incubadora. O acasalamento ocorre durante o tempo de incubação.
    NOTA: Este passo deve ser feito sem agitação para não quebrar o pili conjugativo.
  9. Como controle negativo, faça a cultura noturna de doadores no meio B e receptores no meio A. Incubar as placas durante a noite a 37 °C
  10. Dia 4: Adicionar 800 μL de solução salina ao tubo de acasalamento e vórtice para ressuspensão (isso reconstitui a mistura de acasalamento para 1 mL).
    NOTA: O vórtice separa as bactérias do acasalamento e homogeneiza a cultura para quantificar a UFC/mL.
  11. Preparar diluições 1:10 (de 1 x 100 a 1 x 10-7) da mistura de acasalamento. Placa 100 μL de diluições 10-5 a 10-7 nos meios A e B e todas as diluições nos meios AB.
    NOTA: A deluição 100 refere-se ao tubo puro.
  12. Deixe as placas secarem antes de colocá-las na incubadora de cabeça para baixo. Incubar as placas durante 18 h (durante a noite) a 37 °C.
  13. Dia 5: Inspecione os controles negativos para garantir que as listras de culturas puras durante a noite de doadores não crescessem na mídia B, e a cultura pura da noite para o dia dos receptores não crescesse na mídia A.
  14. Registre o número de colônias e diluições que podem ser contadas:
    1. Contar as colônias na mídia A; estes são os doadores. As colônias devem ser cor-de-rosa (Figura 3A,B).
    2. Contar as colônias na mídia B; estes são os receptores e transconjugantes. As colônias devem ser amarelo-pálidas (Figura 3C).
    3. Contar as colônias na mídia AB; estes são os transconjugantes. As colônias devem ser amarelo pálido.
      NOTA: Selecione uma placa contável. Uma placa contável tem entre 30 e 300 colônias (mais de 300 colônias seriam difíceis de contar, e menos de 30 colônias são consideradas um tamanho de amostra muito pequeno para apresentar uma representação precisa da amostra original).
  15. Calcular a frequência de conjugação por dador ou por receptor
    Frequência de conjugação por doador = (UFC/mL do transconjugante [AB médio])/ (UFC/mL de doadores [meio A]) x 100
    Frequência de conjugação por receptor = (UFC/mL do transconjugante [AB médio])/ (UFC/mL de receptores e transconjugantes [meio B]) x 100
    NOTA: A frequência de conjugação para este protocolo foi calculada como transconjugantes divididos pelo número do receptor, multiplicado por 100. De acordo com a literatura, a quantidade resultante de conjugação poderia ser nomeada como frequência exconjugante, frequência de transferência de genes, frequência de conjugação, rendimento recombinante, eficiência de transferência de plasmídeos, frequência de conjugação com base na contagem bacteriana total, proporção de transconjugantes, fração de transconjugantes na população receptora, frequência transconjugante, frequência de conjugação, logaritmo da taxa de conjugação, taxa de transferência constante, taxa de conjugação por par de acasalamento, coeficiente de conjugação ou eficiência de conjugação20. Este protocolo refere-se ao termo eficiência de conjugação.
  16. Conservar os transconjugantes em reservas de glicerol a -80 °C. Siga os subpassos para preparar estoques de glicerol.
    1. Selecione uma única colônia de transconjugantes e cultive-os durante a noite (18 h) em tubos de cultura de 5,0 mL contendo 2 mL de caldo Mueller Hinton suplementado com carbenicilina (100 mg/L), a 37 °C e agitando a 200 rpm.
    2. Rotular frascos criogênicos, indicando o nome do transconjugante, da seguinte forma: Tc + nome do doador + antibiótico de seleção na mídia A (como são transconjugantes, sabe-se que seu fundo é a cepa receptora, que já é resistente à estreptomicina e rifampicina, mas também abriga o plasmídeo que carrega um gene de resistência a beta-lactâmicos); por exemplo, TcU1Carb. Adicione números contínuos caso mais de um transconjugante do mesmo doador precise ser armazenado (por exemplo, TcU1Carb1, TcU1Carb2, etc.).
    3. Transfira 1 mL da cultura noturna para 1 mL de glicerol a 50% (v/v; a concentração final de glicerol deve ser de 25%) e misture suavemente por inversão. Colocar os frascos criogénicos em gelo seco durante 15 min e armazenar os criovios a -80 °C para experiências futuras.
  17. Para a extracção de ADN, riscar os trasnconjugantes das reservas de glicerol em ágar Mueller Hinton suplementado com carbenicilina (100 mg/L) e incubar durante a noite a 37 °C; em seguida, siga as recomendações da etapa 2.1.

2. Método 2: Reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar genes de resistência a antibióticos e replicões plasmídicas em transconjugantes de E. coli

NOTA: A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi desenvolvida pelo Dr. Kary Mullis em 1983. A PCR depende de primers específicos (um pequeno pedaço de DNA complementar a uma determinada sequência de DNA que atua como um ponto no qual a replicação pode prosseguir, geralmente 20-40 nucleotídeos de comprimento e, idealmente, com um teor de guanina-citosina de 40%-60%), que são recozidos para cadeias opostas de um molde de DNA desnaturado e de fita dupla e estendidos através de uma DNA polimerase termoestável, gerando assim um modelo adicional para o próximo ciclo de reações, levando à amplificação exponencial do modelo original21. Neste protocolo, os replicões e genes de resistência presentes nos plasmídeos conjugativos foram amplificados para confirmar a transferência em células receptoras transconjugantes.

  1. Extração de DNA
    1. Para detectar a transferência de genes de resistência transportados por plasmídeos conjugativos, use o DNA transconjugante como modelo. Use extração simples de preparação de fervura para lisar as paredes celulares bacterianas.
      NOTA: A extração simples de preparação de fervura é uma abordagem simples para lisar as paredes celulares bacterianas. Esta extração contém DNA plasmidial misturado com DNA genômico, mas como os primers são projetados de acordo com sequências específicas de DNA de interesse, esse modelo também é útil para PCR. Os plasmídeos também podem ser especificamente purificados, embora os rendimentos tendam a cair com o aumento do tamanho do plasmídeo22. Este é um ponto de parada conveniente. O DNA pode ser armazenado por vários meses a -20 °C.
  2. PCR
    1. Dado que o experimento tem um controle negativo e positivo, é benéfico configurar um pool para todas as reações em um tubo de 1,5 mL. Rotule um tubo de 1,5 mL como "pool" e os tubos de PCR necessários com o nome do gene e da amostra (por exemplo, OXA-U1).
    2. Pipetar os reagentes de PCR pela seguinte ordem para um tubo de 1,5 ml: água estéril, 2x Master Mix, primers e polimerase (excepto o ADN modelo) (ver Tabela 1). Misture suavemente pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Mantenha-se no gelo o tempo todo.
      NOTA: Use luvas para evitar contaminar a mistura de reação ou reagentes. Tente evitar a abertura e mistura de reagentes e o manuseio de amostras na mesma área para evitar a contaminação por reagentes. Coloque os reagentes no balde de gelo para suprimir a atividade da nuclease e o priming inespecífico. Deixe-os descongelar completamente antes de estabelecer uma reação. Mantenha os reagentes no gelo durante todo o experimento. Taq Polimerase é adicionada no final porque é sensível a mudanças de pH; ele precisa ser tamponada para evitar degradação ou dobramento incorreto. A sequência dos primers está listada na Tabela 2 - genes de resistência a antibióticos - e na Tabela 3 - replicões 23,24,25,26,27,28.
    3. Adicione o DNA modelo ao tubo correspondente. Evite a introdução de bolhas e tampas seguras nos tubos de PCR.
    4. Coloque os tubos de PCR no termociclador.
    5. Inicie o programa. Consulte as configurações do programa listadas para cada gene na Tabela 2 (genes de resistência) e na Tabela 3 (replicões).
      NOTA: Defina programas de PCR para manter as amostras a 4 °C após a execução.
      1. Condições de PCR para os replicões: um ciclo de desnaturação a 94 °C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 1 min, recozimento a 60 °C durante 30 s, alongamento a 72 °C durante 1 min e uma extensão final de um ciclo a 72 °C durante 5 min.
        NOTA: Essas são as condições padronizadas por Carattoli et al.29.
    6. Quando o programa terminar, armazene os tubos de PCR a 4 °C.
      NOTA: Este é um ponto de parada conveniente. Os produtos de PCR podem ser armazenados por vários meses a -20 °C
    7. Preparar um gel de agarose a 1% pesando 0,6 g de agarose num balão de 250 ml e adicionando 60 ml de 1x tampão Tris-acetato-EDTA (TAE) (ajustar os reagentes se for necessário um tamanho de gel diferente). Derreter a agarose com cuidado e lentamente no micro-ondas para evitar que a agarose se derrame sobre o balão e deixe arrefecer até cerca de 55 °C (10-15 min).
      1. Preparar todos os reagentes utilizando água deionizada ultrapura e reagentes de grau analítico:
      2. Tampão TAE 50x (base Tris, ácido acético e EDTA) (1 L): Misture 121,1 g de base Tris + 372,24 g de EDTA e adicione 500 mL de água destilada. Dissolva-se com um agitador magnético. Adicione 57,1 mL de ácido acético e adicione água destilada a um volume total de 1.000 mL.
      3. Autoclave a 15 psi, 121 °C por 15 min e mantenha à temperatura ambiente até ficar pronto por até 6 meses.
      4. Tampão TAE 1x (1 L): Combine 20 mL de tampão TAE 50x com 980 mL de água destilada e misture.
    8. Sob um exaustor, adicione 6 μL de SYBR Green à acarose derretida, misture e despeje na bandeja (e pente), previamente selada com fita adesiva para evitar derramamento. Deixe o gel definido por 15-25 min até que a turbidez apareça.
      NOTA: Outros corantes alternativos também estão disponíveis30,31,32,33.
    9. Remova a fita adesiva e coloque o gel na câmara de eletroforese, adicionando 1x tampão TAE suficiente para cobrir o gel.
    10. Misture 5 μL de 6x corante de carregamento de gel de DNA com 25 μL de cada reação. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.
      NOTA: Nem todo o produto de PCR precisa ser carregado no gel para visualizar o produto esperado (ajuste a quantidade de corante conforme correspondente). A amostra de PCR restante pode ser salva e armazenada a -20 °C por vários meses.
    11. Carregue a mistura em poços (evite introduzir bolhas) e coloque a tampa da câmara para baixo.
      NOTA: Carregue a primeira amostra no segundo poço (reserve a primeira para a escada), começando com o controle negativo.
    12. Carregue 4 μL de 1 kb de escada de DNA no primeiro poço.
    13. Execute a eletroforese a 120 V, 400 mA e 60 min.
    14. Visualize o gel sob luz UV (com um iluminador UV) e grave a imagem.
      NOTA: Se um produto de PCR estiver presente, as bandas de DNA coradas podem ser detectadas usando um transiluminador UV padrão, um transiluminador de luz visível ou um scanner baseado em laser.
ReagenteSolução de EstoqueVolume adicionado à reação de 50 μL (1x)FinalExemplo: volumeExemplo: volumeExemplo: volume adicionado a cada tubo Final Vol. 50 μLVolume adicionado ao controle positivoVolume adicionado ao controle negativo
Concentraçãoadicionado a 1xadicionado a 3x (pool)
Água estéril-21,5 μL (q.s. a 50 μL)-21,5 μL64,5 μL49 μL/tubo49 μL/tubo49 μL/tubo
Master Mix2x25 μL1x25 μL75 μL
Cartilha para a frente25 μM1 μL0,5 μM1 μL3 μL
Primer reverso25 μM1 μL0,5 μM1 μL3 μL
DNA modeloVariável (100–200 ng/μL)Variável (1 μL)Variável0,5 μL1,5 μL
Polimerase5 Unidades/μL0,5 μL2.5 Unidades--1 μL (transconjugante)1 μL (doador)1 μL (receptor)
NOTA: q.s. é uma abreviatura latina para quantum satis que significa a quantidade que é necessária.

Tabela 1: Reagentes de PCR e pool para três reações (um exemplo). 

Primers (sequência listada na orientação 5' - 3')Programa de PCRTamanho esperado
bp) Ref.
blaCTX-M grupo 194 oC 7 min(864) 23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC94 oC 50 s (35 ciclos)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC50 oC 40 s
68 oC 1 min
68 oC 5 min
blaCMY-295 oC 3 min(1855) 24 anos
CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG95 oC 30 s (30 ciclos)
CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC53 oC 30 s
72 oC 30 s
72 oC 3 min
aac(3')-II94 oC 5 min(237) 25
aac(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC94 oC 30 s (32 ciclos)
aac(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA60 oC 45 s
72 oC 2 min
72 oC 8 min
aadA94 oC 5 min(283) 26
aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG94 oC 1 min (35 ciclos)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 8 min
sul-394 oC 5 min(799) 27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG94 oC 1 min (30 ciclos)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA51 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 5 min
tet(A)95 oC 5 min(957) 28 anos
-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC95 oC 30 s (23 ciclos)
-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT62 oC 30 s
72 oC 45 s
72 oC 7 min
dfr Um95 oC 5 min(302) Esta obra
dfrA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG95 oC 1 min (30 ciclos)
55 oC 1 min
DFRA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG72 oC 1 min
72 oC 7 min
catA295 oC 5 min
catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC95 oC 1 min (25 ciclos)(225) Este trabalho
catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 7 min

Tabela 2: Primers e programas de PCR utilizados para amplificar genes de resistência diagnóstica. 

RepliconPrimer (sequência listada na orientação 5' - 3')AlvoPrograma de PCRTamanho esperado (pb)
IncFIBF: TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCACrepA94 oC 5 min683
R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT94 oC 1 min (30 ciclos)
60 oC 30 s
IncFICF: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGGrepA272 oC 1 min262
R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT72 oC 5 min
IncI1F: CGAAAGCCGGACGGCAGAARNAI139
R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT

Tabela 3: Programa de primers e PCR utilizados para classificar plasmídeos p134797 e p101718 por digitação de replicões baseada em PCR29. 

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dado que os doadores SW4955 e SW7037 foram sequenciados, espera-se que essas duas cepas doadoras tenham os fenótipos de resistência correspondentes ao perfil genético de resistência identificado em sua sequência genômica. O plasmídeo p134797 (de SW4955) possui genes que conferem resistência a cefalosporinas de terceira geração (blaCTX-M-55) e resistência a aminoglicosídeos (aac(3)-IIa e aadA1), fenicol (catA2), tetraciclinas (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) e sulfonamidas (sul3); nenhum gene de resistência a antibióticos foi encontrado no cromossomo SW4955. O plasmídeo p101718 (de SW7037) possui apenas um gene de resistência a antibióticos (bla CMY-2), que se espera que confira resistência às cefalosporinas de terceira geração (blaCTX-M-55). Novamente, nenhum gene de resistência a antibióticos foi encontrado no cromossomo SW7037.

Após o acasalamento, esperava-se a detecção da transferência dos dois plasmídeos conjugativos com todos os genes de resistência mencionados acima. A detecção de conjugação positiva implica que os receptores identificados como transconjugantes devem ter adquirido os plasmídeos conjugativos. A presença dos genes de resistência diagnóstica para os plasmídeos conjugativos nos transconjugantes (conforme detectado pela PCR) também era esperada.

Para ilustrar os métodos aqui descritos, testou-se a capacidade de dois isolados ambientais de E. coli de transferir DNA plasmídico por conjugação. Uma representação esquemática do cenário experimental é mostrada na Figura 1. Dois doadores (E. coli SW4955 e SW7037) e um receptor (E. coli LMB100) foram acasalados de forma independente. O mapa genético dos plasmídeos conjugativos encontrados em E. coli SW4955 (p134797) e SW7037 (p101718) é mostrado na Figura 2.

Os plasmídeos conjugativos foram selecionados com carbenicilina e contra-selecionados com rifampicina e estreptomicina, cujos determinantes de resistência estão no cromossomo do receptor. O ágar MacConkey foi utilizado para distinguir os doadores lactose-positivos (que produzem grandes colônias rosas) do receptor e dos transconjugantes (que são lactose negativa e produzem colônias menores e amarelas pálidas) (Figura 3).

Resultados da conjugação bacteriana; culturas de placas de Petri com ampliação de colônias; estudo de transferência genética.
Figura 3: Ilustração dos marcadores de cor diferenciais para colônias de doadores e receptores no ágar MacConkey. As colônias correspondentes aos doadores são rosa em ágar MacConkey porque são positivas para lactose. Isso distingue as colônias doadoras das receptoras, que são amarelas pálidas e menores (lactose negativa). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A mobilização do plasmídeo conjugativo p134797 foi detectada, com cada um dos cinco antibióticos correspondendo às cinco diferentes classes de genes de resistência encontrados no plasmídeo.

Um exemplo de como calcular a eficiência de conjugação (CE) para a cepa SW4955 é apresentado. A partir do ensaio com a cepa SW4955, 172 UFC de transconjugantes foram contadas na placa a partir da diluição 10-2; a contagem do receptor a partir da diluição correspondente (10-2) foi de 10.300.000 UFC/mL (Tabela 4).

O CE é calculado da seguinte forma:

CE = (174 UFC/mL)/(10.300.000 UFC/mL)

EC= 1,67 x 10-5 transconjugantes/receptor

LMB100Transconjugantes da estirpe SW4955 seleccionados com CarbelicilinaEficiência de conjugação
DiluiçãoUFC (placa contável)Aprox. UFC/mLUFC (placa contável)
100Confluente1,03E+09
10-1Confluente1,03E+08
10-2Confluente103000001721,67 x 10-5 transconjugantes/receptor
10-3Confluente1030000
10-4Confluente103000
10-5Confluente10300
10-6Confluente1030
10-7103103
Os valores usados para calcular o CE são realçados em negrito.

Tabela 4: Um exemplo de como calcular a eficiência de conjugação (CE) para a cepa SW4955.

Os resultados são apresentados na Tabela 5, expressa em eficiência de conjugação por receptor. As cinco eficiências de conjugação obtidas usando a cepa SW4955 como doador estavam todas dentro da mesma ordem de magnitude. Esses resultados indicam que a mobilização do plasmídeo conjugativo pode ser detectada independentemente da seleção utilizada para a identificação do transconjugante.

Utilizando a cepa SW7037 como doadora, a eficiência de conjugação obtida foi três ordens de magnitude menor; esses resultados permitem a comparação das eficiências de conjugação de diferentes doadores e tipos de plasmídeos com os mesmos receptores.

Eficiência de conjugação
CoarCarbenicilina (100 mg/L)Gentamicina (2 mg/L)Cloranfenicol (25 mg/L)Tetraciclina (10 mg/L)Trimetoprim (20 mg/L)
SW49551,67 x 10-55,67 x 10-52,17 x 10-57,62 x 10-51,36 x 10-5
SW70372,14 x 10-6

Tabela 5: Eficiências de conjugação das cepas doadoras de E. coli SW4955 e SW7037, dependendo do antibiótico utilizado para seleção.

Nos transconjugantes, a presença de replicões e todos os genes de resistência codificados em dois plasmídeos conjugativos testados, e seus correspondentes replicons, foi verificada por PCR. As condições utilizadas para essas reações diagnósticas de PCR são mostradas na Tabela 3.

Os géis de diagnóstico são mostrados na Figura 4. Esses géis confirmam a presença dos replicões esperados em transconjugantes (IncFIC e IncFIB em p1347975 e IncI1 em p101718). Eles também confirmam a presença dos genes de resistência a antibióticos esperados, ou seja, o grupo bla CTX-M-55 (beta-lactama), aac(3)-II e aadA (aminoglicosídeo), catA2 (fenicol), tet(A) (tetraciclina), dfrA14 (trimetoprim) e sul3 (sulfonamida) para p1347975 e blaCMY-2 para o p101718 (Figura 4).

Eletroforese em gel de agarose mostrando padrões de escada e banda de DNA para análise de genes de resistência a antibióticos.
Figura 4: Géis de eletroforese diagnóstica. Eletroforese em gel de produtos de PCR de genes de resistência a antibióticos e replicões plasmídicos encontrados em plasmídeos conjugativos p134797 e p101718 nas células doadoras (cepas SW4955 e SW7037, respectivamente) e nos transconjugantes LMB100 correspondentes. A carbenicilina foi utilizada para a seleção de plasmídeos. Abreviaturas. -: controle negativo (DNA da cepa LMB100 foi utilizado como controle negativo); D: doador; T: transconjugante. Tamanhos esperados do amplicon: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 pb; aadA1: 283 pb; catA2 : 225 pb; tet(A): 957 pb; dfrA14: 302 pb; sul3: 799 pb; IncFIC(FII): 262 pb; IncFIB: 683 pb; blaCMY-2: 1.855 pb; IncI1-I: 139 pb. O gel tem 1% de agarose. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os plasmídeos conjugativos fornecem acesso a um conjunto comum de genes dentro de um ambiente particular através da recombinação e transferência horizontal de genes34. Assim, os plasmídeos conjugativos são entidades evolutivas capazes de adquirir e conferir funções que permitem que as bactérias se adaptem a múltiplas condições (incluindo resistência a antibióticos, resistência a metais, aquisição de metais, formação de biofilme e genes patogênicos, entre outros) dentro de uma escala temporal de horas.

Este trabalho apresenta um protocolo para a identificação de plasmídeos conjugativos em bactérias. Para que o protocolo funcione, os marcadores utilizados precisam diferenciar as cepas doadora e receptora, como mostram os controles nas mídias A e B. Eles também precisam selecionar efetivamente as células que carregam o plasmídeo. A reação de acasalamento é crítica. Nessa reação, doadores e receptores precisam fazer contato prolongado (através de pili) para que a conjugação ocorra. Qualquer coisa que possa interromper o contato célula-a-célula, como um tempo de incubação insuficiente ou agitação ou agitação da cultura, diminui assim a eficiência da conjugação. A escolha do receptor também é fundamental, pois algumas cepas receptoras são refratárias à conjugação35,36. LMB100 é proposto como o receptor de escolha, pois é capaz de tomar plasmídeos de vários tipos de incompatibilidade.

A taxa de conjugação é específica para cada par de cromossomos plasmídeo-doador, receptor e condição ambiental. A conjugação de plasmídeos específicos mostrou-se sensível a um grande número de variáveis, incluindo fase de crescimento, densidade celular, relação doador-receptor, se a conjugação é conduzida em meio líquido ou sólido, carbono, oxigênio, sais biliares, concentrações de metais, presença de células de mamíferos, temperatura, pH e tempo de acasalamento13,14,15 . O estudo dessas interações depende da detecção inicial de um plasmídeo conjugativo a ser estudado em profundidade. Assim, o protocolo aqui descrito também pode ser modificado para explorar o impacto de diferentes variáveis experimentais, embora isso venha ao custo de restringir o número de doadores triados. Também pode identificar plasmídeos mobilizáveis em hospedeiros que possuem plasmídeos auxiliares (ou seja, plasmídeos que permitem a conjugação, fornecendo funções ausentes dos plasmídeos mobilizáveis em trans6).

Conhecer a sequência do plasmídeo conjugativo é recomendado (mas não é necessário para detectar a conjugação, como discutido acima). Quando os doadores são lactose-negativos (produzindo colônias amarelas no ágar MacConkey), um receptor positivo para lactose (produzindo colônias rosa no ágar MacConkey) pode ser usado para distinguir transconjugantes verdadeiros de células doadoras que são capazes de crescer no meio para selecionar transconjugantes. O protocolo aqui descrito é projetado para detectar plasmídeos conjugativos de membros ambientais, comensais e patogênicos da família Enterobacteriaceae; no entanto, pode ser usado com qualquer espécie bacteriana com um doador, receptor, antibiótico(s) e marcadores de cor adequados. A identificação desses componentes críticos em outras bactérias requer estudos sistemáticos usando múltiplos doadores, receptores e marcadores (antibióticos e cores). Este protocolo não foi testado em bactérias Gram-positivas.

Diversas variantes do método aqui apresentado têm sido relatadas na literatura, recentemente revisadas20. O resultado qualitativo também pode ser referido de diferentes maneiras (por exemplo, frequência de exconjugantes e frequência de transferência de genes), e unidades adimensionais podem ser usadas para relatar a eficiência da conjugação (mL/UFC x h)20.

O protocolo aqui descrito resolve diversas limitações anteriormente não abordadas pelos métodos existentes16,18,19,20. Em primeiro lugar, foi identificado um destinatário adequado. Em segundo lugar, o uso de dois antibióticos (rifampicina e estreptomicina) para selecionar transconjugantes verdadeiros minimiza a possibilidade de que os doadores desenvolvam resistência a um dos antibióticos utilizados para selecionar transconjugantes através da mutagênese espontânea. Os falsos transconjugantes também podem resultar da proteção do espectador pela hidrólise do antibiótico usado para selecionar transconjugantes por enzimas (por exemplo, beta-lactamases) produzidas em grandes quantidades pelo doador. Em terceiro lugar, vários controles experimentais são incluídos para garantir que o produto do acasalamento seja um verdadeiro transconjugante (ou seja, uma célula receptora que incorporou de forma estável o plasmídeo conjugativo do doador). Aqui, apresentamos dois métodos independentes para testar a autenticidade dos transconjugantes, a saber, um marcador colorimétrico no ágar MacConkey e a detecção por PCR dos replicões e genes de resistência a antibióticos do plasmídeo conjugativo no receptor. Além disso, o protocolo descrito aqui é projetado para isolar e caracterizar plasmídeos conjugativos de membros ambientais, commentais e patogênicos da família Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella e outras espécies).

Para entender a mecânica da conjugação, observações experimentais foram modeladas usando simulações de computador. Esses modelos preditivos estimam a frequência de transferência de plasmídeos para determinadas densidades de crescimento de doadores, receptores e transconjugantes. Um modelo conhecido como modelo de desfecho encontrou limiares acima dos quais a taxa de transferência de plasmídeos em cultura líquida e concluiu que a taxa de transferência não é afetada pela densidade celular, razão doador:receptor e tempo de acasalamento19. A hibridização in situ por fluorescência (FISH) tem sido utilizada como método alternativo de detecção de plasmídeos transconjugantes. O FISH permite a visualização plasmídica usando microscopia de fluorescência através da hibridização de uma sonda de DNA e um DNA alvo. Assim, o FISH permite a detecção visual de fluxos plasmídicos em diferentes populações celulares37, embora não tenha o mesmo nível de sensibilidade que o método aqui apresentado se os transconjugantes forem detectados por triagem visual em oposição à seleção.

Há uma enorme necessidade de entender a biologia dos plasmídeos conjugativos que estão dispersando genes de resistência a antibióticos através de diferentes componentes do ecossistema (clínica, agricultura, esgoto, vida selvagem, animais domésticos, solos, rios e lagos). Em suma, as condições experimentais simplificadas apresentadas nos protocolos aqui descritos facilitam o rastreamento de doadores em escala e, portanto, representam uma ferramenta fundamental para o estudo da transferência horizontal de genes originados em plasmídeos conjugativos de uma variedade de fontes. Eles podem ser usados para investigar a prevalência de genes de resistência a antibióticos ou outros genes clinicamente relevantes em plasmídeos conjugativos de múltiplas fontes e bactérias. Eles também podem ser adaptados para o estudo da conjugação in vivo (por exemplo, no intestino de vertebrados) e para estudar as condições que modulam a eficiência da conjugação. Todos esses estudos contribuirão muito para a compreensão de como a mobilização de plasmídeos conjugativos multirresistentes contribui para a disseminação da resistência a múltiplas drogas.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LM-B, IMG, AT e IS foram apoiados pela subvenção do NIH GM055246 concedida à LM-B. O GC-C foi premiado com a Bolsa de Pós-Doutorado UC MEXUS-CONACYT por dois anos consecutivos: AY 2017-18 e 2018-19. Agradecemos imensamente aos alunos Sage Chavez e Pepper St. Clair, do programa de orientação da Rede de Inspiração Acadêmica (GAIN) patrocinado pela Genentech-Foundation por seu apoio técnico em experimentos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Racks de tubos de 1,5 mLThermo Fisher Scientific22-313630Pode ser substituído por outra marca
Frascos criogênicos de 2,0 mLCorning430659Pode ser substituído por outra marca
Tubos cônicos de 14 mLFALCON149597Pode ser substituído por outra marca
Racks de tubos de 14 mLThermo Fisher Scientific8850Pode ser substituído por outra marca
1 kb de escada de DNANew England BiolabsN0552G 
Frascos estéreis de 250 mL PYREX5320Pode ser substituído por outra marca de marcador permanente
Ácido acéticoFisher ScientificA38SI-212Pode ser substituído por outra marca
Agarose (grau de biologia molecular, multipropósito)Fisher ScientificBP160-500Pode ser substituído por outra marca
CarbenicillinGOLD BIOTECHNOLOGYC-103-50Pode ser substituído por outra marca
Alças de inoculação descartáveis: 1 µ LFisherbrand22-363-595Pode ser substituído por outra marca
DNA gel carregando corante 6x New England BiolabsB7024SPode ser substituído por outra marca
EDTAFisher ScientificBP119-500Pode ser substituído por outra marca
Balança digital eletrônicaDenver InstrumentAPX-2001Pode ser substituído por outra marca
Eppendorf tubos cônicos: 1,5 mLEppendorf14-282-302Pode ser substituído por outra marca
Equipamento para eletroforese em gel de agaroseFisher ScientificFP300Pode ser substituído por outra marca
Marcadores resistentes ao etanolSharpie37001; 37002; 37003Pode ser substituído por outra marca
Sistemas de documentação em gel (UVP GelSolo)AnalytakjenaSP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01Pode ser substituído por outra marca
LuvasX-GEN44-100MQualquer marca de luvas de nitrilo funciona
Balde de geloThermo Fisher Scientific432128Pode ser substituído por outra marca
Ágar MacConkey BD DIFCO212123
Master Mix BioLabsM0496S Pode ser substituído por outra marca
MetanolFisher ScientificA452-4Pode ser substituído por outra marca
Tubos de microcentrífuga: 2,0 mLFisherbrand05-408-138Pode ser substituído por outra marca
Ágar Mueller HintonBD DIFCODF0479-17-3
Caldo Mueller HintonBD DIFCO275730
NucleoSpin Plasmid, Mini kit para DNAde plasmídeoTakara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL740588. 250
Racks de Tubos PCRAXYGEN   R96PCRFSPPode ser substituído por tubos PCR de outra marca
(0,2 mL)AXYGEN PCR-02-CPode ser substituído por outra marca
RifampicinaFisher Scientific50-164-7517
Conjunto de micropipetas que dispensam entre 1 - 10 μ L (P10), 2– 20 μ L (P20), 20– 200 μ L (P200) e 200– 1000 μ L (P1000)RAININ17008648; 17008650; 17008652; 17008653Micropipetas devem ser calibradas; podem ser substituídas por outra marca
Cloreto de sódioFisher ScientificS671-3Pode ser substituído por outra marca
EspectrofotômetroThermo Scientific335905PPode ser substituído por outra marca
Pontas esterilizadas para 10 μ L, 200 μ L e 1000 μ L Eclipse1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9Pode ser substituído por outra marca
StreptomycinFisher ScientificBP910-50
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fisher ScientificS33102
Taq DNA PolimeraseBioLabsM0273S
Termociclador C1000 Touch Bio-Rad1851196Pode ser substituído por outra marca
Tris Fisher ScientificBP153-500Pode ser substituído por outra marca

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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