Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

O pulldown convencional é amplamente utilizado para estudar as interações proteína-proteína¹. No entanto, as proteínas purificadas muitas vezes não interagem efetivamente in vitro^2,3, e algumas delas são insolúveis sem seu parceiro de ligação ^4,5. Tais proteínas podem necessitar de montagem co-translacional ou da presença de chaperonas moleculares 5,6,7,8,9. Outra limitação do pulldown convencional é o teste de possível atividade de heteromultimerização entre domínios que podem existir como homooligômeros estáveis montados co-translacionalmente ^8,10, pois muitos deles não conseguem dissociar e reassociar in vitro durante o tempo de incubação. A co-expressão mostrou-se útil na superação de tais problemas ^3,11. A co-expressão usando vetores compatíveis em bactérias foi utilizada com sucesso para purificar grandes complexos macromoleculares multi-subunidades, incluindo o complexo repressivo policomb PRC2¹², o módulo de cabeça mediador da RNA polimerase II¹³, a placa de base do bacteriófago T4 14, o módulo 15,16 da desubiquitinilase do complexo SAGA 15,16 e a ferritina ¹⁷. As origens de replicação comumente usadas para coexpressão são ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ e RSF²⁰. No sistema de expressão Duet comercialmente disponível, essas origens são combinadas com diferentes genes de resistência a antibióticos e convenientes múltiplos locais de clonagem para produzir vetores policistrônicos, permitindo a expressão de até oito proteínas. Essas origens têm diferentes números de cópia e podem ser usadas em combinações variadas para alcançar níveis de expressão equilibrados de proteínas-alvo²¹. Para testar as interações proteína-proteína, várias tags de afinidade são usadas; os mais comuns são 6xHistidina, glutationa-S-transferase (GST) e proteína ligadora de maltose (MBP), cada uma das quais tem uma afinidade específica com a resina correspondente. GST e MBP também aumentam a solubilidade e a estabilidade das proteínas marcadas²².

Vários métodos envolvendo a co-expressão de proteínas em células eucarióticas também foram desenvolvidos, o mais proeminente dos quais é o ensaio híbrido de levedura dupla (Y2H)²³. O ensaio Y2H é barato, fácil e permite o teste de múltiplas interações; no entanto, seu fluxo de trabalho leva mais de 1 semana para ser concluído. Há também alguns ensaios baseados em células de mamíferos menos utilizados, por exemplo, ensaio fluorescente de dois híbridos (F2H)²⁴ e ensaio de interação proteína-proteína de matriz celular (CAPPIA)²⁵. O ensaio F2H é relativamente rápido, permitindo observar interações proteicas em seu ambiente celular nativo, mas envolve o uso de equipamentos de imagem caros. Todos esses métodos têm uma vantagem sobre a expressão procariótica, proporcionando a tradução eucariótica nativa e o ambiente de dobramento; no entanto, eles detectam a interação indiretamente, seja por ativação transcricional ou por transferência de energia fluorescente, que muitas vezes produz artefatos. Além disso, as células eucarióticas podem conter outros parceiros de interação de proteínas de interesse, o que pode interferir no teste de interações binárias entre proteínas de eucariotas superiores.

O presente estudo descreve um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas seguido de técnicas convencionais de pulldown. O método permite estudar as interações entre proteínas-alvo que requerem co-expressão. É mais eficiente em termos de tempo em comparação com o pulldown tradicional, permitindo o teste em lote de vários alvos, o que o torna vantajoso na maioria dos casos. A co-expressão usando vetores compatíveis é mais conveniente do que a co-expressão policistrônica, uma vez que não requer uma etapa de clonagem trabalhosa.

A representação esquemática do fluxo de trabalho do método é mostrada na Figura 1.

1. Co-transformação de E. coli

1. Preparar vetores de expressão para proteínas-alvo usando métodos de clonagem padrão.
   NOTA: Normalmente, um bom ponto de partida é usar vetores pGEX/pMAL convencionais com um gene de resistência à ampicilina e origem ColE1 para a expressão de proteínas marcadas com GST/MBP e um vetor compatível com origem p15A ou RSF e resistência à canamicina para expressar proteínas marcadas com 6xHis, em alguns casos combinadas com tioredoxina ou SUMO-tag para aumentar a solubilidade. Normalmente, várias combinações de tags precisam ser testadas antes do experimento. O método descrito em si é conveniente para testar em lote as condições de expressão das proteínas-alvo. É importante notar que a maioria das cepas Rosetta já contém o plasmídeo com origem p15A para expressar os tRNAs para códons raros; portanto, se o uso de tais cepas é uma opção possível, os plasmídeos p15A devem ser evitados. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes.
   1. Cultivar bactérias de uma estirpe apropriada em meio de Luria-Bertani (LB) a 37 °C para uma densidade óptica (OD) de 0,1-0,2. A cepa BL21(DE3) foi utilizada como exemplo neste estudo.
      NOTA: Recomenda-se o uso de células competentes recém-preparadas para alcançar uma cotransformação eficiente com dois vetores. Se mais de dois vetores precisarem ser cotransformados, é melhor transformá-los sequencialmente para alcançar uma boa eficiência de transformação. A eletroporação é uma boa alternativa.
   2. Centrifugar 1,0 ml da suspensão bacteriana durante 1 min a 9.000 x g a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
   3. Adicione 0,5 mL de tampão de transformação de tampão gelado (TB) (MOPS de 10 mM [pH 6,7], KCl de 250 mM, MnCl₂ de 55 mM e CaCl₂ de 15 mM) e incube por 10 min no gelo.
   4. Centrifugar durante 30 s a 8.000 x g a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
   5. Adicione 100 μL de tampão TB, adicione 100 ng de cada vetor e incube por 30 minutos no gelo. Transforme separadamente vetores únicos para estudar o comportamento das proteínas sem co-expressão. Além disso, co-transformam vetores de expressão em pares com vetores de co-expressão vazios para controles de vinculação não específicos.
      NOTA: Nos exemplos fornecidos neste estudo, vetores pGEX/pMAL com cDNAs correspondentes fundidos a cDNAs GST/MBP foram usados em combinação com vetores derivados de pACYC compatíveis com domínios de proteína parceira codificadores de cDNA fundidos ao cDNA com cDNA de tioredoxina cDNA.
   6. Aqueça a 42 °C durante 150 s e, em seguida, arrepie durante 1 min no gelo.
   7. Adicionar 1 ml de meio LB líquido sem antibióticos e incubar a 37 °C durante 90 min. Placa em placas de ágar LB contendo 0,5% de glicose e antibióticos correspondentes (as concentrações comuns são: 50 mg/L de ampicilina; 20 mg/L de canamicina; 50 mg/L de estreptomicina; 35 mg/L de cloranfenicol). Incubar as placas durante a noite a 37 °C.

2. Expressão

1. Lavar as células da placa com 2 mL de meio LB líquido em 50 mL de LB media com antibióticos correspondentes (as concentrações comuns são: 50mg/L de ampicilina; 20 mg/L de canamicina; 50 mg/L de estreptomicina; 35 mg/L de cloranfenicol). Adicione íons metálicos ou outros cofatores conhecidos (nos exemplos fornecidos neste estudo, 0,2 mM ZnCl₂ foi adicionado ao meio). Conservar uma alíquota com 20% de glicerol a -70 °C para uma repetição subsequente da experiência.
   NOTA: Recomenda-se lavar várias colônias diretamente da placa para excluir a possibilidade de má expressão em um único clone isolado devido a eventos ocasionais de recombinação entre dois plasmídeos.
2. Cultivar as células com uma rotação constante de 220 rpm a 37 °C a uma OD de 0,5-0,7, arrefecer até à temperatura ambiente (RT) e adicionar isopropilo β-D-1-thiogalactopiranóside (IPTG) a 1 mM. Armazenar uma alíquota de 20 μL de suspensão celular como controlo da amostra não induzida.
3. Incubar as células com uma rotação constante de 220 rpm a 18 °C durante a noite.
   NOTA: O tempo e a temperatura ideais de incubação podem variar; 18 °C durante a noite funciona melhor para a maioria das proteínas e é aconselhável ser tentado por padrão. Reduza o tempo de incubação para 2-3 h se for observada uma forte ligação não específica.
4. Divida a suspensão bacteriana em duas partes (ou mais se mais de duas etiquetas diferentes foram usadas) e armazene uma alíquota de 20 μL da suspensão celular para confirmar a expressão da proteína. Centrífuga a 4.000 x g por 15 min.
   NOTA: Ponto de pausa: os pellets bacterianos podem ser armazenados a -70 °C durante pelo menos 6 meses.

3. Ensaio suspenso

NOTA: Os procedimentos detalhados são descritos para proteínas marcadas com 6xHis ou MBP/GST. Todos os procedimentos são realizados a 4°C.

1. Ressussuscite os pellets bacterianos em 1 mL de tampão de lise gelada com inibidores de protease e agentes redutores (ver abaixo) adicionados imediatamente antes do experimento. Evite o ditiotreitol (TDT) ao usar resinas quelantes de metal, uma vez que retira os íons metálicos. Ajustar a composição tampão para as proteínas testadas. As receitas comuns de tampões de lise encontradas adequadas para a maioria das proteínas são:
   1. 6xHis-pulldown: Misture 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol, 5 mM de beta-mercaptoetanol, 1 mM de fenilmetilsfulfonilfluoreto (PMSF) e uma diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease (ver Tabela de Materiais).
   2. Pulldown GST ou MBP: Misture 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol, 5 mM de TDT, 1 mM PMSF e uma diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease (ver Tabela de Materiais).
2. Perturbe as células por sonicação no gelo. Armazenar uma alíquota de 20 μl para eletroforese.
   NOTA: Normalmente, são necessários 20-25 pulsos de 5 s com intervalos de 15 s com potência de saída de 20 W por amostra. O poder de sonicação apropriado deve ser ajustado para cada instrumento para evitar o superaquecimento e garantir a interrupção total da célula. Para obter um melhor desempenho, é altamente recomendável usar sondas sonicatoras de várias pontas de alto rendimento.
3. Centrífuga a 20.000 x g por 30 min. Coletar 20 μL do lisado clarificado para posterior análise SDS-PAGE.
4. Equilibrar a resina (50 μL para cada amostra) com 1 mL de tampão de lise gelada por 10 min, centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descartar o sobrenadante.
5. Adicionar lisados celulares (concentração de proteína total: 20-50 mg/mL) à resina, incubar por 10 min a uma rotação constante de 15 rpm, centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descartar o sobrenadante. Coletar 20 μL da fração não ligada para análise SDS-PAGE subsequente.
6. Adicione 1 mL de tampão de lavagem gelada e incube por 1 min. Centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descartar o sobrenadante. As receitas comuns para amortecedores de lavagem são:
   1. 6xHis-pulldown: Misture 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol e 5 mM de beta-mercaptoetanol.
   2. Pulldown GST ou MBP: Misture 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol e 5 mM de TDT.
7. Realize duas lavagens longas: adicione 1 mL de tampão de lavagem gelado, incube por 10-30 min com uma rotação constante de 15 rpm, centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descarte o sobrenadante.
8. Adicione 1 mL de tampão de lavagem gelada, incube por 1 min, centrifuga a 2.000 x g por 30 s e descarte o sobrenadante.
9. Eluir as proteínas ligadas com 50 μL do tampão de eluição em um agitador a 1.200 rpm por 10 min. As receitas comuns de buffers de eluição são:
   1. 6xHis-pulldown: Misture 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM imidazol e 5 mM beta-mercaptoetanol.
   2. GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutationa (ajustado para pH 7,5 com Tris básico) e 5 mM TDT.
   3. MBP-pulldown: Misture 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM de maltose e 5 mM de TDT.
10. Analise as proteínas eluídas com SDS-PAGE.
    NOTA: A percentagem de acrilamida deve ser ajustada ao tamanho das proteínas. Nos exemplos fornecidos neste estudo, foram utilizados géis de acrilamida a 12%, funcionando em tampão tris-glicina-SDS (2 mM Tris, 250 mM de glicina, 0,1% SDS) em tensão constante de 180 V. Os géis foram corados por ebulição em azul de Coomassie a 0,2% R250, ácido acético a 10% e isopropanol a 30%, e descorados por ebulição em ácido acético a 10%. A quantidade de proteína carregada não deve ser igual, uma vez que várias quantidades de proteínas que interagem podem ser puxadas para baixo em diferentes experimentos.

O método descrito foi utilizado rotineiramente com muitos alvos diferentes. Apresentamos aqui alguns resultados representativos que provavelmente não podem ser obtidos usando técnicas convencionais de pulldown. O primeiro é o estudo da dimerização específica do ZAD (domínio associado ao dedo do zinco)11. As ZADs formam dímeros estáveis e específicos, com heterodímeros possíveis apenas entre domínios intimamente relacionados dentro de grupos parálogos. Os dímeros formados por esses domínios são estáveis e não se dissociam por pelo menos alguns dias; assim, a mistura de ZADs purificadas não produz nenhuma ligação detectável. Ao mesmo tempo, a co-expressão de ZADs fundidos com MBP e tiorredoxina-6xHis mostra boa e reprodutível atividade de homodimerização (Figura 2A), aparecendo como uma banda adicional nos resultados do SDS-PAGE do ensaio MBP-pulldown. Uma pequena porção de heterodímeros pode ser observada com M1BP co-expressa com outro domínio; essa interação não foi confirmada com Y2A e, muito provavelmente, é resultado de associação inespecífica devido à alta concentração de proteínas, uma vez que esses domínios são ricos em cisteína e extremamente propensos à agregação. Notavelmente, neste caso, 6xHis-pulldown é inadequado, pois os ZADs são domínios de coordenação de metais que não se ligam especificamente à resina quelante de metais. Tal atividade deve ser cuidadosamente examinada em um experimento paralelo.

Outro exemplo é o ensaio de competição entre a proteína ENY2 e seus parceiros de ligação Sgf11 (1-83aa) e o domínio zinco-dedo (460-631 aa) da proteína CTCF26. Quando expressa isoladamente, a proteína ENY2 forma dímeros que a impedem de interagir com seus parceiros de ligação nativos. Presumivelmente, as proteínas Sgf11 e CTCF ligam-se à mesma superfície molecular do ENY2, tornando a sua interação mutuamente exclusiva. No ensaio de co-expressão, o ENY2 com marcação 6xHis interagiu tanto com o Sgf11 marcado com GST quanto com o MBP-CTCF, mas nenhum GST-Sgf11 estava presente nos pulldowns MBP e vice-versa, (Figura 2B). Esses resultados sugerem que nenhum complexo triplo pode ser formado, e as interações são mutuamente exclusivas. Esses dados foram confirmados de forma independente com outros ensaios e suportam os diferentes papéis funcionais do ENY2 nesses complexos. Deve-se chamar a atenção para o fato de que grandes marcas de afinidade podem impor obstáculos estéricos por si só, impedindo a formação complexa; por conseguinte, a conclusão não deve basear-se apenas em dados de co-expressão.

Uma comparação passo a passo dos fluxos de trabalho de pulldowns de coexpressão convencionais e acoplados é mostrada na Figura 3A. O pulldown acoplado à coexpressão é pelo menos duas vezes mais eficiente em termos de tempo, mesmo com um pequeno número de amostras, e permite uma boa escalabilidade. Os resultados da utilização de ambas as técnicas para estudar a mesma interação entre o domínio BTB da proteína CP190 (1-126aa) e o domínio C-terminal marcado com GST (610-818aa) da proteína Drosophila CTCF (dCTCF) são mostrados na Figura 3B. Ambos os métodos apresentam boa eficiência e reprodutibilidade (ensaios foram realizados em três repetições); para este caso, o pulldown acoplado à coexpressão apresentou menor ligação não específica, como pode ser observado nas amostras controle apenas com proteína GST.

Figura 1: A representação esquemática do protocolo. O esquema mostra o método de fluxo de trabalho empregado neste estudo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados representativos . (A) Estudo da homodimerização do domínio associado ao dedo de zinco (ZAD) nos ensaios de MBP e 6xHis-pulldown. ZADs fundidos com MBP (40 kDa) ou com 6xHis-Tioredoxina (20 kDa) foram co-expressos em células bacterianas e afinidade purificada com resina de amilose (liga proteínas marcadas com MBP) ou com resina Ni-NTA (liga proteínas marcadas com 6xHis). Proteínas copurificadas foram visualizadas com SDS-PAGE seguida de coloração Coomassie. Os resultados do MBP-pulldown são mostrados nos painéis superiores, os resultados do 6xHis-pulldown são nos painéis inferiores (usados apenas como controle de expressão de proteínas, uma vez que muitos ZADs se ligam não especificamente ao Ni-NTA). (B) Estudo de interações mutuamente exclusivas entre as proteínas ENY2 e Sgf11/CTCF. Sgf11 (1-81aa), CTCF com marcação GST (460-631aa) e 6xHis, proteínas ENY2 marcadas com MBP foram coexpressas em várias combinações e afinidade purificadas com resina de amilose, resina de glutationa (liga proteínas marcadas com GST) ou com resina Ni-NTA. Proteínas copurificadas foram visualizadas com SDS-PAGE seguida de coloração Coomassie. A figura nos painéis A e B foi modificada com permissão de Bonchuk et al.11 e Bonchuk et al.26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Comparação de fluxos de trabalho de ensaios pulldown de co-expressão convencionais e acoplados. (A) Comparação passo a passo dos intervalos de tempo necessários no fluxo de trabalho do ensaio pulldown convencional em comparação com o pulldown acoplado à co-expressão. (B) Comparação de duas técnicas diferentes de pulldown no estudo da interação entre o domínio C-terminal dCTCF (610-818aa) e o domínio BTB da proteína CP190 (1-126aa) em ensaios GST-pulldown. dCTCF (610-818aa) fundidos com GST (25kDa) ou GST sozinhos foram co-expressos em células bacterianas ou incubados in vitro com Thioredoxin-6xHis-tagged CP190 BTB e afinidade purificada com resina de glutationa. Três réplicas independentes de cada ensaio são mostradas. Proteínas copurificadas foram visualizadas com SDS-PAGE seguida de coloração Coomassie. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.