Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

Summary

Aqui, descrevemos um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas usando um conjunto de vetores compatíveis, seguido pelas técnicas convencionais de pulldown para estudar complexos proteicos que não podem se montar in vitro.

Abstract

Pulldown é um ensaio de interação proteína-proteína fácil e amplamente utilizado. No entanto, tem limitações no estudo de complexos proteicos que não se reúnem efetivamente in vitro. Tais complexos podem exigir montagem co-translacional e a presença de chaperonas moleculares; ou formam oligômeros estáveis que não podem dissociar e reassociar in vitro ou são instáveis sem um parceiro de ligação. Para superar esses problemas, é possível utilizar um método baseado na co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas utilizando um conjunto de vetores compatíveis seguidos pelas técnicas convencionais de pulldown. O fluxo de trabalho é mais eficiente em termos de tempo em comparação com o pulldown tradicional, porque não possui as etapas demoradas de purificação separada de proteínas que interagem e sua incubação seguinte. Outra vantagem é uma maior reprodutibilidade devido a um número significativamente menor de etapas e um menor período de tempo em que as proteínas que existem dentro do ambiente in vitro são expostas à proteólise e oxidação. O método foi aplicado com sucesso para estudar uma série de interações proteína-proteína quando outras técnicas in vitro foram consideradas inadequadas. O método pode ser usado para testar em lote as interações proteína-proteína. Resultados representativos são mostrados para estudos de interações entre o domínio BTB e proteínas intrinsecamente desordenadas, e de heterodímeros de domínios associados ao dedo de zinco.

Introduction

O pulldown convencional é amplamente utilizado para estudar as interações proteína-proteína¹. No entanto, as proteínas purificadas muitas vezes não interagem efetivamente in vitro^2,3, e algumas delas são insolúveis sem seu parceiro de ligação ^4,5. Tais proteínas podem necessitar de montagem co-translacional ou da presença de chaperonas moleculares 5,6,7,8,9. ....

Protocol

A representação esquemática do fluxo de trabalho do método é mostrada na Figura 1.

1. Co-transformação de E. coli

1. Preparar vetores de expressão para proteínas-alvo usando métodos de clonagem padrão.
   NOTA: Normalmente, um bom ponto de partida é usar vetores pGEX/pMAL convencionais com um gene de resistência à ampicilina e origem ColE1 para a expressão de proteínas marcadas com GST/MBP e um vetor compatível com origem p15A ou RSF e resistência à canamicina para expressar proteínas marcadas com 6xHis, em alguns casos combinadas com tioredoxina ou SUMO-tag para aumentar a solu....

Results

O método descrito foi utilizado rotineiramente com muitos alvos diferentes. Apresentamos aqui alguns resultados representativos que provavelmente não podem ser obtidos usando técnicas convencionais de pulldown. O primeiro é o estudo da dimerização específica do ZAD (domínio associado ao dedo do zinco)¹¹. As ZADs formam dímeros estáveis e específicos, com heterodímeros possíveis apenas entre domínios intimamente relacionados dentro de grupos parálogos. Os dímeros formados por esses domínios são est.......

Discussion

O método descrito permite o teste de interações proteína-proteína que não podem ser eficientemente montadas in vitro e requerem co-expressão. O método é uma das poucas abordagens adequadas para o estudo de proteínas heterodimerizantes, que também são capazes de homodimerização, uma vez que, quando purificadas separadamente, essas proteínas formam homodímeros estáveis que, na maioria das vezes, não conseguem dissociar e reassociar durante o experimento ^3,11

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sonda de 8 ELEMENTOS	Sonics	630-0586	As sondas sonicadoras de 8 elementos de alto rendimento Agar
	AppliChem	A0949
Resina de amilose	New England Biolabs	E8021	Resina para purificação de proteínas marcadas com MBP
Antibióticos	AppliChem	A4789 (canamicina); A0839 (ampicilina)
Beta-mercaptoetanol	AppliChem	A1108
BL21(DE3)	Novagen	69450-M
CaCl2	AppliChem	A4689
Centrífuga	Eppendorf	5415R (Z605212)
Glutationa	AppliChem	A9782
Glutationa agarose	Pierce	16100	Resina para purificação de proteínas marcadas com GST
Glycerol	AppliChem	A2926
HEPES	AppliChem	A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose	Thermo Scientific	25214	Resina para purificação de proteínas marcadas com 6xHis
Imidazol	AppliChem	A1378
IPTG	AppliChem	A4773
KCl	AppliChem	A2939
LB	AppliChem	414753
Maltose	AppliChem	A3891
MOPS	AppliChem	A2947
NaCl	AppliChem	A2942
NP40	Roche	11754599001
pACYCDuet-1	Sigma-Aldrich	71147	Vetor para co-expressão de proteínas com origem de replicação p15A
pCDFDuet-1	Sigma-Aldrich	71340	Vetor para co-expressão de proteínas com origem de replicação CloDF13
PMSF	AppliChem	A0999
Inibidor de Protease Coquetel VII	Calbiochem	539138	Inibidor de Protease Coquetel
pRSFDuet-1	Sigma-Aldrich	71341	Vetor para co-expressão de proteínas com origem de replicação RSF
SDS	AppliChem	A2263
Tris	Processador
	VC505