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Bioengineering

इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री और आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस का उपयोग करके माइक्रोन्यूक्लियस परख का स्वचालन

Published: January 27, 2023 doi: 10.3791/64549
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Amnis Flow Cytometry, Luminex Corporation

Summary

माइक्रोन्यूक्लियस (एमएन) परख डीएनए क्षति को मापने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित परीक्षण है। हालांकि, मैनुअल माइक्रोस्कोपी या फीचर-आधारित छवि विश्लेषण जैसी पारंपरिक तकनीकों का उपयोग करके परख स्कोर करना श्रमसाध्य और चुनौतीपूर्ण है। यह पेपर इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री डेटा का उपयोग करके एमएन परख को स्कोर करने के लिए एक कृत्रिम बुद्धि मॉडल विकसित करने के लिए पद्धति का वर्णन करता है।

Abstract

माइक्रोन्यूक्लियस (एमएन) परख का उपयोग दुनिया भर में नियामक निकायों द्वारा आनुवंशिक विषाक्तता के लिए रसायनों का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। परख को दो तरीकों से किया जा सकता है: एक बार विभाजित, साइटोकिनेसिस-अवरुद्ध द्वि-नाभिक कोशिकाओं या पूरी तरह से विभाजित मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं में एमएन स्कोर करके। ऐतिहासिक रूप से, प्रकाश माइक्रोस्कोपी परख को स्कोर करने के लिए स्वर्ण मानक विधि रही है, लेकिन यह श्रमसाध्य और व्यक्तिपरक है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग हाल के वर्षों में परख को स्कोर करने के लिए किया गया है, लेकिन सेलुलर इमेजरी के प्रमुख पहलुओं की नेत्रहीन पुष्टि करने में असमर्थता से सीमित है। इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री (आईएफसी) उच्च-थ्रूपुट छवि कैप्चर और स्वचालित छवि विश्लेषण को जोड़ती है, और एमएन परख में सभी प्रमुख घटनाओं की इमेजरी को तेजी से प्राप्त करने और स्कोर करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गया है कि संक्रामक तंत्रिका नेटवर्क पर आधारित कृत्रिम बुद्धि (एआई) विधियों का उपयोग आईएफसी द्वारा अधिग्रहित एमएन परख डेटा को स्कोर करने के लिए किया जा सकता है। यह पेपर सभी प्रमुख घटनाओं को स्कोर करने के लिए एक गहरी शिक्षा मॉडल बनाने के लिए एआई सॉफ्टवेयर का उपयोग करने और इस मॉडल को स्वचालित रूप से अतिरिक्त डेटा स्कोर करने के लिए लागू करने के लिए सभी चरणों का वर्णन करता है। एआई डीप लर्निंग मॉडल के परिणाम मैनुअल माइक्रोस्कोपी की तुलना में अच्छी तरह से तुलना करते हैं, इसलिए आईएफसी और एआई के संयोजन से एमएन परख के पूरी तरह से स्वचालित स्कोरिंग को सक्षम करते हैं।

Introduction

माइक्रोन्यूक्लियस (एमएन) परख मानव उपयोगके लिए सौंदर्य प्रसाधन, फार्मास्यूटिकल्स और रसायनों के विकास में डीएनए क्षति का मूल्यांकन करने के लिए आनुवंशिक विष विज्ञान में मौलिक है। माइक्रोन्यूक्लियस पूरे गुणसूत्रों या गुणसूत्र टुकड़ों से बनते हैं जो विभाजन के बाद नाभिक में शामिल नहीं होते हैं और नाभिक से अलग छोटे, गोलाकार निकायों में संघनित होते हैं। इस प्रकार, एमएन का उपयोग जीनोटॉक्सिसिटी परीक्षण 1 में डीएनए क्षति को मापने के लिए एक समापन बिंदुके रूप में किया जा सकता है।

एमएन की मात्रा निर्धारित करने का पसंदीदा तरीका साइटोचलासिन-बी (साइट-बी) का उपयोग करके विभाजन को अवरुद्ध करके एक बार विभाजित द्विराष्ट्रीय कोशिकाओं (बीएनसी) के भीतर है। परख के इस संस्करण में, साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन मोनोन्यूक्लिएटेड (मोनो) और पॉलीन्यूक्लिएटेड (पॉली) कोशिकाओं को स्कोर करके भी किया जाता है। परख को अनब्लॉक्ड मोनो कोशिकाओं में एमएन स्कोर करके भी किया जा सकता है, जो स्कोर करने में तेज और आसान है, प्रसार 5,6 का आकलन करने के लिए प्री-और पोस्ट-एक्सपोज़र सेल काउंट का उपयोग करके साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन किया जा रहा है।

परख का भौतिक स्कोरिंग ऐतिहासिक रूप से मैनुअल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से किया गया है, क्योंकि यह सभी प्रमुख घटनाओं की दृश्य पुष्टि की अनुमति देता है। हालांकि, मैनुअल माइक्रोस्कोपी चुनौतीपूर्ण और व्यक्तिपरक है। इस प्रकार, माइक्रोस्कोप स्लाइड स्कैनिंग और फ्लो साइटोमेट्री सहित स्वचालित तकनीकों को विकसित किया गया है, जिनमें से प्रत्येक के अपने फायदे और सीमाएं हैं। जबकि स्लाइड-स्कैनिंग विधियां प्रमुख घटनाओं को देखने की अनुमति देती हैं, स्लाइड्स को इष्टतम सेल घनत्व पर बनाया जाना चाहिए, जिसे प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। इसके अतिरिक्त, इस तकनीक में अक्सर साइटोप्लाज्मिक विज़ुअलाइज़ेशन का अभाव होता है, जो मोनो और पॉली कोशिकाओं7,8 के स्कोरिंग से समझौता कर सकता है। जबकि फ्लो साइटोमेट्री उच्च-थ्रूपुट डेटा कैप्चर प्रदान करता है, कोशिकाओं को लाइस किया जाना चाहिए, इस प्रकार परख के साइट-बी रूप के उपयोग की अनुमति नहीं है। इसके अतिरिक्त, एक गैर-इमेजिंग तकनीक के रूप में, पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री प्रमुख घटनाओं 9,10 का दृश्य सत्यापन प्रदान नहीं करता है।

इसलिए, एमएन परख करने के लिए इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री (आईएफसी) की जांच की गई है। इमेजस्ट्रीमएक्स एमके II एक एकल प्रणाली11 में माइक्रोस्कोपी की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग क्षमताओं के साथ पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री की गति और सांख्यिकीय मजबूती को जोड़ती है। यह दिखाया गया है कि आईएफसी का उपयोग करके, सभी प्रमुख घटनाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजरी को फीचर-आधारित12,13 या कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) तकनीक14,15 का उपयोग करके कैप्चर और स्वचालित रूप से स्कोर किया जा सकता है। एमएन परख करने के लिए आईएफसी का उपयोग करके, कम समय में माइक्रोस्कोपी की तुलना में कई और कोशिकाओं का स्वचालित स्कोरिंग प्राप्त करने योग्य है।

यह काम पहले वर्णित छवि विश्लेषण वर्कफ़्लो16 से विचलित होता है और एमनिस एआई सॉफ्टवेयर (अब से "एआई सॉफ्टवेयर" के रूप में संदर्भित) का उपयोग करके रैंडम फॉरेस्ट (आरएफ) और / या कन्वोल्यूशनल न्यूरल नेटवर्क (सीएनएन) मॉडल को विकसित करने और प्रशिक्षित करने के लिए आवश्यक सभी चरणों पर चर्चा करता है। सभी आवश्यक चरणों का वर्णन किया गया है, जिसमें एआई-असिस्टेड टैगिंग टूल का उपयोग करके जमीनी सच्चाई डेटा को पॉप्युलेट करना, मॉडल प्रशिक्षण परिणामों की व्याख्या, और अतिरिक्त डेटा को वर्गीकृत करने के लिए मॉडल का अनुप्रयोग, जीनोटॉक्सिसिटी और साइटोटॉक्सिसिटी15 की गणना की अनुमति देना शामिल है।

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Protocol

1. इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करडेटा अधिग्रहण

नोट: निम्नलिखित संशोधनों के साथ रॉड्रिग्स एट अल .16 का संदर्भ लें, यह देखते हुए कि आईएफसी का उपयोग करने वाले अधिग्रहण क्षेत्रों को इष्टतम छवि कैप्चर के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है:

  1. गैर-साइट-बी विधि के लिए, संस्कृति से ठीक पहले और पुनर्प्राप्ति अवधि के तुरंत बाद प्रत्येक संस्कृति पर निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका देखें) का पालन करते हुए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल काउंटर का उपयोग करके एक सेल गिनती करें।
  2. यदि एकल कैमरा इमेजिंग फ्लो साइटोमीटर पर नमूने चल रहे हैं, तो चैनल 4 में ब्राइटफील्ड (बीएफ) रखें। M01 को M04 से प्रतिस्थापित करें, और M07 को M01 से बदलें।
    नोट: "एम" आईएफसी पर कैमरा चैनल को संदर्भित करता है।
  3. अधिग्रहण के दौरान 40x आवर्धन का उपयोग करें।
  4. अधिग्रहण के दौरान बीएफ क्षेत्र बनाम बीएफ पहलू अनुपात प्लॉट पर, निम्नलिखित क्षेत्र निर्देशांक का उपयोग करें:
    एक्स-निर्देशांक: 100 और 900; Y-निर्देशांक: 0.7 और 1 (साइट-B विधि)
    एक्स-निर्देशांक: 100 और 600; Y-निर्देशांक: 0.7 और 1
  5. होचस्ट तीव्रता प्लॉट पर, निम्न क्षेत्र निर्देशांक का उपयोग करें:
    एक्स-निर्देशांक: 55 और 75; वाई-निर्देशांक: 9.5 और 15 (साइट-बी विधि)
    एक्स-निर्देशांक: 55 और 75; वाई-निर्देशांक: 13 और 21 (गैर-साइट-बी विधि)
  6. डेटा से एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक ऑब्जेक्ट्स की छवियों को हटाने के लिए, आईडीईएएस 6.3 सॉफ्टवेयर पैकेज लॉन्च करें (अब से "छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर" के रूप में जाना जाता है; सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: एआई सॉफ्टवेयर को .daf फ़ाइलों के साथ काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जिन्हें छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के नवीनतम संस्करण का उपयोग करके संसाधित किया गया है। सुनिश्चित करें कि छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर अद्यतित है।
  7. इस कार्य को टेम्पलेट (.ast) फ़ाइल के रूप में सहेजें.

2. सभी .rif फ़ाइलों के लिए .daf फ़ाइलें बनाना

  1. AI सॉफ़्टवेयर केवल .daf फ़ाइलों को आयात करने की अनुमति देता है। बैच प्रोसेसिंग के माध्यम से प्रयोग में सभी .rif फ़ाइलों के लिए .daf फ़ाइलें बनाएँ.
  2. उपकरण मेनू के अंतर्गत, बैच डेटा फ़ाइलें क्लिक करें और फिर बैच जोड़ें पर क्लिक करें.
  3. नई विंडो में, फ़ाइलें जोड़ें का चयन करें और बैच में जोड़ी जाने वाली .rif फ़ाइलों का चयन करें. टेम्पलेट या डेटा विश्लेषण फ़ाइल (.ast, .daf) का चयन करें विकल्प के अंतर्गत, पहले बनाई गई .ast फ़ाइल का चयन करें.
  4. यदि आवश्यक हो तो बैच नाम असाइन करें और सभी भरी हुई .rif फ़ाइलों के लिए .daf फ़ाइलें बनाने के लिए OK पर क्लिक करें.

3. एआई सॉफ्टवेयर में एक प्रयोग बनाना

  1. चित्रा 1 में प्रवाह चार्ट देखें जो एआई सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक गहरी सीखने के मॉडल बनाने की प्रक्रिया का वर्णन करता है।
  2. एआई सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और सुनिश्चित करें कि विंडो के निचले बाएं कोने में अबाउट पर क्लिक करके सबसे हालिया संस्करण स्थापित किया गया है। यदि नवीनतम संस्करण स्थापित नहीं है, तो इसे प्राप्त करने के लिए support@luminexcorp.com से संपर्क करें।
  3. सॉफ़्टवेयर में डिफ़ॉल्ट स्क्रीन नया प्रयोग स्क्रीन है। प्रयोग को कहाँ सहेजना है, यह चुनने के लिए फ़ोल्डर चिह्न का उपयोग करें, और प्रयोग के लिए एक नाम लिखें (उदाहरण के लिए, "MN मॉडल").
  4. प्रयोग प्रकार के तहत, सीएनएन मॉडल का निर्माण शुरू करने के लिए प्रशिक्षण प्रयोग शुरू करने के लिए ट्रेन के बगल में रेडियो बटन पर क्लिक करें। Next पर क्लिक करें।
    1. वैकल्पिक: यदि किसी मॉडल को पहले प्रशिक्षित किया गया है, तो इसे एक नए एआई मॉडल के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है, और इसे टेम्पलेट मॉडल स्क्रीन से एक नए मॉडल के निर्माण के लिए टेम्पलेट के रूप में चुना जा सकता है । यदि कोई टेम्पलेट मॉडल मौजूद नहीं है, तो बस अगला क्लिक करके इस चरण को छोड़ दें।
  5. अगली स्क्रीन डिफाइन न्यू मॉडल स्क्रीन है। मॉडल के तहत, चरण 3.3 में मॉडल को जो नाम दिया गया था, वह स्वचालित रूप से आबाद हो जाएगा।
    1. वर्णन के अंतर्गत, मॉडल (वैकल्पिक) के लिए वर्णन लिखें और अधिकतम छवि आकार 150 पिक्सेल पर छोड़ दें।
    2. चैनल के अंतर्गत, सूची में ब्राइटफील्ड चैनल जोड़ने के लिए बीएफ जोड़ें पर क्लिक करें। नाम के तहत, Brightfield पर डबल-क्लिक करें और इस चैनल का नाम बदलकर BF करें। सूची में फ्लोरोसेंट चैनल जोड़ने के लिए एफएल जोड़ें पर क्लिक करें। नाम के तहत, फ्लोरोसेंट पर डबल-क्लिक करें और इस चैनल का नाम बदलकर डीएनए करें।
    3. कक्षा नाम के तहत, जोड़ें पर क्लिक करें। पॉप-अप विंडो में, मोनोन्यूक्लिएटेड टाइप करें और ओके पर क्लिक करें। यह कक्षा के नामों की सूची में मोनोन्यूक्लिएटेड वर्ग को जोड़ता है। सूची में निम्नलिखित छह वर्गों को परिभाषित करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ:
      मोनोन्यूक्लियेटेड
      MN के साथ मोनोन्यूक्लियेटेड
      द्विकेन्द्रीकृत
      MN के साथ द्विराष्ट्रीय
      पॉलीन्यूक्लियेटेड
      अनियमित आकृति विज्ञान
      Next पर क्लिक करें।
      नोट: ये छह ग्राउंड ट्रुथ मॉडल कक्षाएं स्कोर की जाने वाली प्रमुख घटनाओं का प्रतिनिधित्व करेंगी, साथ ही आकृति विज्ञान के साथ छवियां जो स्वीकृत स्कोरिंग मानदंड5 से भिन्न हैं।
      1. वैकल्पिक: यदि वांछित हो, तो छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से सुविधाओं का उपयोग करने के लिए 1.7 से विश्लेषण टेम्पलेट शामिल किया जा सकता है। यदि आप एआई मॉडल में इन सुविधाओं को शामिल करना चाहते हैं, तो .ast फ़ाइल के लिए ब्राउज़ करें, फिर चैनल विशिष्ट ड्रॉपडाउन से, उन सुविधा उपसमुच्चय का चयन करें जिन्हें आप शामिल करना चाहते हैं।
    4. फ़ाइलों का चयन करें के तहत, फ़ाइलें जोड़ें पर क्लिक करें और ग्राउंड ट्रूथ डेटा बनाने के लिए एआई सॉफ्टवेयर में जोड़े जाने वाले वांछित फ़ाइलों के लिए ब्राउज़ करें। Next पर क्लिक करें।
      नोट: एकाधिक डेटा फ़ाइलों (जैसे, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण डेटा) को जोड़ना महत्वपूर्ण है जिसमें सभी प्रमुख घटनाओं की पर्याप्त संख्या होती है।
  6. इसके बाद, सेलेक्ट बेस पॉपुलेशन स्क्रीन पर, जनसंख्या पदानुक्रम से गैर-एपोप्टोटिक आबादी का पता लगाएं। गैर-एपोप्टोटिक आबादी पर राइट-क्लिक करें और सभी मिलान आबादी का चयन करें। Next पर क्लिक करें।
    नोट: किसी भी आबादी को बाहर करना महत्वपूर्ण है जिसे वर्गीकृत नहीं किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, मोती, मलबे, डबल्स, आदि)।
  7. यह स्क्रीन सेलेक्ट ट्रूथ पॉपुलेशन स्क्रीन है ।
    1. यदि छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में प्रमुख घटनाओं की टैग की गई सच्चाई आबादी नहीं बनाई गई है, तो अगला पर क्लिक करें।
    2. यदि छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में टैग की गई सच्चाई आबादी बनाई गई है, तो उन्हें उपयुक्त मॉडल वर्ग में असाइन करें।
    3. एमएन के साथ मोनो कोशिकाओं की टैग की गई सत्य आबादी को असाइन करने के लिए, बाईं ओर मॉडल क्लासेस के तहत एमएन वर्ग के साथ मोनोन्यूक्लिएटेड पर क्लिक करें। फिर दाईं ओर उपयुक्त टैग की गई सत्य आबादी पर क्लिक करें जिसमें ये घटनाएं शामिल हैं।
    4. यदि टैग की गई सत्य आबादी एक से अधिक डेटा फ़ाइलों में बनाई गई है, तो सत्य आबादी में से एक पर राइट-क्लिक करें और कई फ़ाइलों से टैग की गई आबादी को उपयुक्त वर्ग में जोड़ने के लिए सभी मिलान आबादी का चयन करें ।
    5. एक बार जब सभी उपयुक्त सत्य आबादी को सौंपा गया है, तो अगला पर क्लिक करें।
  8. चैनल ों का चयन करें स्क्रीन पर, प्रयोग के लिए उपयुक्त चैनल चुनें। यहां, बीएफ को चैनल 1 और होचस्ट को चैनल 7 पर सेट करें। किसी चैनल पर राइट-क्लिक करें और सभी पर लागू करें का चयन करें. Next पर क्लिक करें।
  9. अंत में, पुष्टिकरण स्क्रीन पर, प्रयोग बनाएँ पर क्लिक करें।
  10. एआई सॉफ्टवेयर डेटा फ़ाइलों से छवियों को लोड करता है और चरण 3.5.3 में परिभाषित मॉडल वर्गों को ग्राउंड ट्रुथ इमेजरी के साथ बनाता है जिसे चरण 3.7 में सौंपा गया था। फिनिश पर क्लिक करें।
  11. एक बार प्रयोग बनाने के बाद, पांच विकल्प प्रस्तुत किए जाते हैं:
    प्रयोग: प्रयोग का विवरण प्रदान करता है, जिसमें लोड की गई डेटा फाइलें, चुने गए चैनल और परिभाषित जमीनी सत्य मॉडल कक्षाएं शामिल हैं।
    टैगिंग: टैगिंग टूल लॉन्च करता है जिसके माध्यम से उपयोगकर्ता जमीनी सच्चाई डेटा को पॉप्युलेट कर सकते हैं।
    प्रशिक्षण: जमीनी सच्चाई डेटा के आधार पर एक मॉडल को प्रशिक्षित करता है।
    वर्गीकृत करें: डेटा को वर्गीकृत करने के लिए प्रशिक्षित मॉडल का उपयोग करता है।
    परिणाम: एक प्रशिक्षण प्रयोग और एक वर्गीकृत प्रयोग दोनों से परिणाम प्रदान करता है।

4. एआई-असिस्टेड टैगिंग टूल का उपयोग करके जमीनी सच्चाई डेटा को पॉप्युलेट करना

  1. टैगिंग टूल इंटरफ़ेस लॉन्च करने के लिए टैगिंग पर क्लिक करें।
    1. आसानी से देखने के लिए छवियों को क्रॉप करने के लिए ज़ूम टूल (मैग्निफाइंग ग्लास आइकन) पर क्लिक करें।
    2. गैलरी में दिखाए गए चित्रों को बदलने के लिए छवि आकार समायोजित करने के लिए स्लाइडर बार पर क्लिक करें।
    3. प्रदर्शन सेटिंग विकल्प पर क्लिक करें, और Min-Max चुनें, जो सभी प्रमुख घटनाओं की पहचान करने के लिए सबसे अच्छी कंट्रास्ट छवि प्रदान करता है।
    4. डीएनए छवि के रंग को पीले या सफेद में बदलने के लिए सेटअप गैलरी डिस्प्ले पर क्लिक करें, जो छोटी वस्तुओं (जैसे, एमएन) के विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार करेगा।
  2. समान आकृति विज्ञान के साथ वस्तुओं को एक साथ समूहीकृत करने के लिए एल्गोरिथ्म चलाने के लिए क्लस्टर पर क्लिक करें। एक बार क्लस्टरिंग पूरा हो जाने के बाद, प्रति क्लस्टर वस्तुओं की संख्या वाले व्यक्तिगत समूहों को अज्ञात आबादी के तहत एक सूची में दिखाया जाता है। क्लस्टर के भीतर ऑब्जेक्ट्स को देखने के लिए अलग-अलग क्लस्टर का चयन करें और इन ऑब्जेक्ट्स को उनके उपयुक्त मॉडल वर्गों में असाइन करें।
  3. प्रत्येक मॉडल वर्ग को न्यूनतम 25 ऑब्जेक्ट असाइन किए जाने के बाद, प्रेडिक्ट एल्गोरिदम उपलब्ध हो जाता है। Predict पर क्लिक करें।
    नोट: जो वस्तुएं किसी भी आबादी में अच्छी तरह से फिट नहीं होती हैं, उन्हें अज्ञात के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। जैसे-जैसे सत्य आबादी में अधिक वस्तुओं को जोड़ा जाता है, भविष्यवाणी सटीकता में सुधार होता है।
  4. उचित इमेजरी के साथ जमीनी सच्चाई मॉडल कक्षाओं को आबाद करना जारी रखें जब तक कि प्रत्येक वर्ग में वस्तुओं की पर्याप्त संख्या तक नहीं पहुंच जाता है।
  5. एक बार प्रत्येक मॉडल वर्ग को न्यूनतम 100 ऑब्जेक्ट असाइन किए जाने के बाद, स्क्रीन के शीर्ष पर प्रशिक्षण टैब पर क्लिक करें। रैंडम फ़ॉरेस्ट और सीएनएन एल्गोरिदम का उपयोग करके एक मॉडल बनाने के लिए ट्रेन बटन पर क्लिक करें।
    नोट: एआई सॉफ्टवेयर रैंडम फॉरेस्ट और सीएनएन एल्गोरिदम दोनों का उपयोग करके मॉडल बनाता है, चेकबॉक्स केवल सीएनएन एल्गोरिदम के रैंडम फॉरेस्ट का उपयोग करके मॉडल बनाने की अनुमति देते हैं।

5. मॉडल सटीकता का आकलन

  1. एक बार मॉडल प्रशिक्षण पूरा हो जाने के बाद, दृश्य परिणाम पर क्लिक करें।
  2. मॉडल सटीकता का आकलन करने के लिए परिणाम स्क्रीन का उपयोग करें। रैंडम फ़ॉरेस्ट और सीएनएन के बीच स्विच करने के लिए पुलडाउन मेनू का उपयोग करें।
    नोट: सत्य आबादी को अपडेट किया जा सकता है, और मॉडल को फिर से प्रशिक्षित किया जा सकता है या अतिरिक्त डेटा को वर्गीकृत करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
    1. सच्चाई आबादी को अपडेट करने के लिए, शीर्ष पर टैगिंग पर क्लिक करें और अनुभाग 4 का पालन करें।

6. मॉडल का उपयोग करके डेटा को वर्गीकृत करना

  1. एआई सॉफ्टवेयर लॉन्च करें। डिफ़ॉल्ट स्क्रीन नया प्रयोग स्क्रीन है। प्रयोग को कहाँ सहेजना है, यह चुनने के लिए फ़ोल्डर चिह्न का उपयोग करें और प्रयोग के लिए कोई नाम लिखें.
  2. प्रयोग प्रकार के अंतर्गत, वर्गीकरण प्रयोग प्रारंभ करने के लिए वर्गीकृत के बगल में रेडियो बटन क्लिक करें. Next पर क्लिक करें।
  3. वर्गीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले मॉडल पर क्लिक करें, फिर अगला पर क्लिक करें।
  4. फ़ाइलें चुनें स्क्रीन पर, फ़ाइलें जोड़ें पर क्लिक करें और CNN मॉडल द्वारा वर्गीकृत की जाने वाली फ़ाइलों के लिए ब्राउज़ करें। Next पर क्लिक करें।
  5. इसके बाद, सेलेक्ट बेस पॉपुलेशन स्क्रीन पर, लोड की गई फ़ाइलों में से एक में गैर-एपोप्टोटिक आबादी के बगल में चेकबॉक्स पर क्लिक करें। गैर-एपोप्टोटिक आबादी पर राइट-क्लिक करें और सभी भरी हुई फ़ाइलों से इस आबादी का चयन करने के लिए सभी मिलान आबादी का चयन करें पर क्लिक करें। Next पर क्लिक करें।
  6. वैकल्पिक: यदि वर्गीकृत किए जाने वाले डेटा में सत्य आबादी होती है, तो उन्हें सेलेक्ट ट्रूथ पॉपुलेशन स्क्रीन पर उपयुक्त मॉडल वर्गों को सौंपा जा सकता है। अन्यथा, इस चरण को छोड़ने के लिए अगला क्लिक करें.
  7. सेलेक्ट चैनल स्क्रीन पर, ब्राइटफील्ड के लिए चैनल 1 और डीएनए दाग के लिए चैनल 7 चुनें। एक चैनल पर राइट-क्लिक करें और सभी पर लागू करें पर क्लिक करें। फिर Next पर क्लिक करें।
  8. अंत में, पुष्टिकरण स्क्रीन पर, प्रयोग बनाएँ पर क्लिक करें। एआई सॉफ्टवेयर चयनित मॉडल और चुने हुए डेटा फ़ाइलों से सभी छवियों को लोड करता है। फिनिश पर क्लिक करें।
  9. वर्गीकरण स्क्रीन लॉन्च करने के लिए वर्गीकृत पर क्लिक करें। वर्गीकृत बटन पर क्लिक करें। यह अतिरिक्त डेटा को वर्गीकृत करने और निर्दिष्ट मॉडल वर्गों में संबंधित सभी वस्तुओं की पहचान करने के लिए आरएफ और सीएनएन मॉडल का उपयोग करने की प्रक्रिया शुरू करता है।
    नोट: चेकबॉक्स का उपयोग आरएफ मॉडल और / या सीएनएन मॉडल का चयन करने के लिए किया जा सकता है।
  10. वर्गीकरण पूरा होने के बाद, परिणाम देखें पर क्लिक करें।
  11. वर्गीकरण परिणाम विंडो के साथ अद्यतन DAFs लाने के लिए अद्यतन DAFs बटन क्लिक करें। .daf फ़ाइलों को अद्यतन करने के लिए OK पर क्लिक करें.

7. वर्गीकरण परिणामों की एक रिपोर्ट तैयार करना

  1. परिणाम स्क्रीन पर, रिपोर्ट जनरेट करें पर क्लिक करें। यदि प्रत्येक इनपुट डीएएफ के लिए एक व्यक्तिगत रिपोर्ट की आवश्यकता है, तो प्रत्येक इनपुट डीएएफ के लिए रिपोर्ट बनाएँ के बगल में चेकबॉक्स का चयन करें। OK पर क्लिक करें।
  2. पूरा हो जाने के बाद, वह फ़ोल्डर खोलें जहाँ रिपोर्ट फ़ाइलें सहेजी गई हैं. फ़ोल्डर के भीतर, रिपोर्ट और संसाधन फ़ोल्डर .pdf एक प्रयोग है।
  3. रिपोर्ट देखने के लिए .pdf खोलें. रिपोर्ट में मॉडल और प्रयोग जानकारी, इनपुट .daf फ़ाइलों की सूची, सारणीबद्ध और हिस्टोग्राम प्रारूप में वर्ग गणना और वर्ग प्रतिशत, और सभी इनपुट .daf फ़ाइलों में औसत पूर्वानुमान संभावना को सारांशित करने वाला एक भ्रम मैट्रिक्स शामिल है।
  4. संसाधन फ़ोल्डर खोलें और उसके बाद CNN फ़ोल्डर। इस फ़ोल्डर के भीतर वर्ग गणना और प्रतिशत बार ग्राफ़ की .png फाइलें हैं, साथ ही भ्रम मैट्रिक्स भी हैं। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक इनपुट फ़ाइल के लिए वर्ग गणना और प्रतिशत वाली .csv फाइलें हैं।

8. एमएन आवृत्ति और साइटोटॉक्सिसिटी का निर्धारण

  1. एमएन आवृत्ति की गणना
    1. Non Cyt-B विधि: MN आवृत्ति निर्धारित करने के लिए, चरण 7.4 से class_count.csv फ़ाइल खोलें। प्रत्येक इनपुट फ़ाइल के लिए, "मोनोन्यूक्लिएटेड विथ एमएन" आबादी में गणना को "मोनोन्यूक्लिएटेड" आबादी में गणना से विभाजित करें और 100 से गुणा करें:
      Equation 1
    2. साइट-बी विधि: MN आवृत्ति निर्धारित करने के लिए, चरण 7.4 से class_count.csv फ़ाइल खोलें। प्रत्येक इनपुट फ़ाइल के लिए, "एमएन के साथ द्विसंयोजक" आबादी में गणना को "द्विराष्ट्रीय" आबादी में गणना से विभाजित करें और 100 से गुणा करें:
      Equation 2
  2. साइटोटॉक्सिसिटी की गणना
    1. गैर साइट-बी विधि:
      1. प्रारंभिक सेल गणना और उपचार के बाद सेल गिनती का उपयोग करके, पहले प्रत्येक नमूने के लिए जनसंख्या दोगुनी (पीडी) की गणना करें2:
        Equation 3
      2. इसके बाद, सापेक्ष जनसंख्या दोगुनी होने की गणनाकरें 2:
        Equation 4
      3. अंत में, प्रत्येक नमूने के लिए साइटोटॉक्सिसिटी2 की गणना करें:
        Equation 5
    2. साइट-बी विधि:
      1. साइटोकिनेसिस-ब्लॉक प्रसार सूचकांक (सीबीपीआई) 2 की गणना करने के लिए, class_count.csv फ़ाइल से प्रत्येक नमूने के लिए मोनोन्यूक्लिएटेड, बाइन्यूक्लिएटेड और पॉलीन्यूक्लिएटेड वर्गों में गणना का उपयोग करें:
        Equation 6
      2. साइटोटॉक्सिसिटी2 की गणना करने के लिए, नियंत्रण संस्कृतियों (सी) और उजागर संस्कृतियों (टी) से सीबीपीआई का उपयोग करें:
        Equation 7

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Representative Results

चित्रा 1 एमएन परख के लिए एक मॉडल बनाने के लिए एआई सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए वर्कफ़्लो दिखाता है। उपयोगकर्ता एआई सॉफ्टवेयर में वांछित .daf फ़ाइलों को लोड करता है, फिर एआई-असिस्टेड क्लस्टर (चित्रा 2) का उपयोग करके ग्राउंड ट्रुथ मॉडल कक्षाओं में ऑब्जेक्ट्स असाइन करता है और भविष्यवाणी (चित्रा 3) टैगिंग एल्गोरिदम का उपयोग करता है। एक बार जब सभी जमीनी सत्य मॉडल कक्षाएं पर्याप्त वस्तुओं से आबाद हो जाती हैं, तो मॉडल को आरएफ या सीएनएन एल्गोरिदम का उपयोग करके प्रशिक्षित किया जा सकता है। प्रशिक्षण के बाद, मॉडल के प्रदर्शन का मूल्यांकन वर्ग वितरण हिस्टोग्राम, सटीकता सांख्यिकी और एक इंटरैक्टिव भ्रम मैट्रिक्स (चित्रा 4) सहित उपकरणों का उपयोग करके किया जा सकता है। एआई सॉफ्टवेयर में परिणाम स्क्रीन से, उपयोगकर्ता या तो ग्राउंड ट्रूथ डेटा को बढ़ाने के लिए वर्कफ़्लो के प्रशिक्षण भाग पर लौट सकता है या, यदि पर्याप्त सटीकता हासिल की गई है, तो उपयोगकर्ता अतिरिक्त डेटा को वर्गीकृत करने के लिए मॉडल का उपयोग कर सकता है।

क्लस्टर और भविष्यवाणी एल्गोरिदम दोनों का उपयोग करते हुए, कुल 285,000 वस्तुओं के साथ 190 खंडों को उचित जमीनी सत्य वर्गों को सौंपा गया था जब तक कि सभी वर्गों को 1,500 और 10,000 छवियों के बीच आबाद नहीं किया गया था। कुल मिलाकर, इस मॉडल के प्रशिक्षण में 31,500 वस्तुओं (लोड की गई प्रारंभिक वस्तुओं का केवल 10.5%) का उपयोग किया गया था। मॉडल सटीकता को मापने के लिए डीप लर्निंग सॉफ्टवेयर पैकेज में परिशुद्धता (झूठी सकारात्मकता का प्रतिशत), रिकॉल (झूठे नकारात्मक का प्रतिशत), और एफ 1 स्कोर (परिशुद्धता और रिकॉल के बीच संतुलन) उपलब्ध हैं। यहां, ये आंकड़े 86.0% से 99.4% तक थे, जो उच्च मॉडल सटीकता (चित्रा 4) का संकेत देते हैं।

साइट-बी का उपयोग करते हुए, सभी नियंत्रण नमूनों के लिए पृष्ठभूमि एमएन आवृत्तियों 0.43% और 1.69% के बीच थीं, जो साहित्य17 की तुलना में अच्छी तरह से तुलना करती थीं। एमएन आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि, (मिटोमाइसिन सी) एमएमसी के लिए 2.09% से 9.50% और एटोपोसाइड के लिए 2.99% से 7.98% तक, विलायक नियंत्रण की तुलना में और मैनुअल माइक्रोस्कोपी स्कोरिंग की तुलना में अच्छी तरह से देखी गई। नकारात्मक नियंत्रण मैनिटोल की जांच करते समय, एमएन आवृत्ति में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं देखी गई। इसके अतिरिक्त, खुराक के साथ साइटोटॉक्सिसिटी में वृद्धि एटोपोसाइड और एमएमसी दोनों के लिए देखी गई थी, जिसमें माइक्रोस्कोपी और एआई दोनों खुराक सीमा में समान रुझान दिखा रहे थे। मैनिटोल के लिए, साइटोटॉक्सिसिटी में कोई अवलोकन योग्य वृद्धि नहीं देखी गई (चित्रा 5)।

साइट-बी का उपयोग नहीं करते समय, सभी नियंत्रण नमूनों के लिए पृष्ठभूमि एमएन आवृत्तियों 0.38% और 1.0% के बीच थीं, जो साहित्य17 में प्रकाशित परिणामों के अनुरूप थीं। एमएन आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि, एमएमसी के लिए 2.55% से 7.89% और एटोपोसाइड के लिए 2.37% से 5.13% तक, विलायक नियंत्रण की तुलना में देखी गई और मैनुअल माइक्रोस्कोपी स्कोरिंग की तुलना में अच्छी तरह से तुलना की गई। नकारात्मक नियंत्रण मैनिटोल की जांच करते समय, एमएन आवृत्ति में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं देखी गई। इसके अलावा, खुराक के साथ साइटोटॉक्सिसिटी में वृद्धि एटोपोसाइड और एमएमसी दोनों के लिए देखी गई, जिसमें माइक्रोस्कोपी और एआई दोनों खुराक सीमा में समान रुझान दिखाते हैं। मैनिटोल के लिए, साइटोटॉक्सिसिटी में कोई अवलोकन योग्य वृद्धि नहीं देखी गई (चित्रा 5)।

माइक्रोस्कोपी द्वारा स्कोर करते समय, प्रत्येक संस्कृति से, एमएन आवृत्ति का आकलन करने के लिए 1,000 द्वि-नाभिक कोशिकाओं को स्कोर किया गया था और परख के साइट-बी संस्करण में साइटोटॉक्सिसिटी निर्धारित करने के लिए एक और 500 मोनोन्यूक्लिएटेड, द्वि-नाभिकीय या पॉलीन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं को स्कोर किया गया था। परख के गैर-साइट-बी संस्करण में, एमएन आवृत्ति का आकलन करने के लिए 1,000 मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं को स्कोर किया गया था। आईएफसी द्वारा, साइटोटॉक्सिसिटी निर्धारित करने के लिए प्रति संस्कृति औसतन 7,733 द्विराष्ट्रीय कोशिकाओं, 6,493 मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं और 2,649 पॉलीन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं को स्कोर किया गया था। एमएन आवृत्ति परख के साइट-बी संस्करण के लिए द्वि-नाभिकीय सेल आबादी के भीतर से निर्धारित की गई थी। परख के गैर-साइट-बी संस्करण के लिए, एमएन (चित्रा 5) की उपस्थिति के लिए औसतन 27,866 मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: एआई सॉफ्टवेयर वर्कफ़्लो। उपयोगकर्ता एआई सॉफ्टवेयर में लोड की जाने वाली .daf फ़ाइलों का चयन करके शुरू करता है। एक बार डेटा लोड हो जाने के बाद, उपयोगकर्ता उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के माध्यम से वस्तुओं को जमीनी सत्य मॉडल कक्षाओं में असाइन करना शुरू कर देता है। जमीनी सच्चाई आबादी में सहायता के लिए, क्लस्टर और भविष्यवाणी एल्गोरिदम का उपयोग समान आकृति विज्ञान के साथ इमेजरी की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। एक बार प्रत्येक मॉडल वर्ग में पर्याप्त वस्तुओं को जोड़ दिया गया है, तो मॉडल को प्रशिक्षित किया जा सकता है। प्रशिक्षण के बाद, उपयोगकर्ता प्रदान किए गए उपकरणों का उपयोग करके मॉडल के प्रदर्शन का आकलन कर सकता है, जिसमें एक इंटरैक्टिव भ्रम मैट्रिक्स भी शामिल है। अंत में, उपयोगकर्ता या तो ग्राउंड ट्रुथ डेटा को बढ़ाने के लिए वर्कफ़्लो के प्रशिक्षण भाग पर लौट सकता है या, यदि पर्याप्त सटीकता हासिल की गई है, तो उपयोगकर्ता प्रशिक्षण / टैगिंग वर्कफ़्लो लूप से बाहर निकल सकता है और अतिरिक्त डेटा को वर्गीकृत करने के लिए मॉडल का उपयोग कर सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: क्लस्टर एल्गोरिथ्म। क्लस्टर एल्गोरिथ्म को इनपुट डेटा से यादृच्छिक रूप से चुने गए 1,500 ऑब्जेक्ट्स के सेगमेंट पर किसी भी समय चलाया जा सकता है। यह एल्गोरिथ्म अवर्गीकृत वस्तुओं और वस्तुओं दोनों की आकृति विज्ञान के अनुसार एक खंड के भीतर समान वस्तुओं को एक साथ समूहित करता है जिन्हें जमीनी सत्य मॉडल वर्गों को सौंपा गया है। उदाहरण इमेजरी द्विराष्ट्रीय, मोनोन्यूक्लिएटेड और बहुराष्ट्रीय कोशिकाओं और अनियमित आकृति विज्ञान वाली कोशिकाओं को दिखाती है। मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं वाले क्लस्टर ऑब्जेक्ट मैप के एक तरफ आते हैं, जबकि मल्टीन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं वाले क्लस्टर ऑब्जेक्ट मैप के विपरीत तरफ होते हैं। द्वि-नाभिकीय कोशिका समूह मोनो- और बहुराष्ट्रीय कोशिका समूहों के बीच कहीं आते हैं। अंत में, अनियमित आकृति विज्ञान वाले क्लस्टर ऑब्जेक्ट मैप के एक अलग क्षेत्र में पूरी तरह से आते हैं। उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस पूरे क्लस्टर को जोड़ने, या क्लस्टर के भीतर वस्तुओं का चयन करने की अनुमति देता है, ग्राउंड ट्रुथ मॉडल कक्षाओं में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एल्गोरिदम की भविष्यवाणी करें। पूर्वानुमान एल्गोरिथ्म को प्रत्येक ग्राउंड ट्रुथ मॉडल क्लास में न्यूनतम 25 ऑब्जेक्ट्स की आवश्यकता होती है और एक सेगमेंट के भीतर अवर्गीकृत वस्तुओं को असाइन करने के लिए सबसे उपयुक्त मॉडल क्लास की भविष्यवाणी करने का प्रयास करता है। छवियों में सूक्ष्म आकृति विज्ञान की पहचान के संबंध में क्लस्टर एल्गोरिदम की तुलना में पूर्वानुमान एल्गोरिथ्म अधिक मजबूत है (यानी, एमएन [पीले] के साथ मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाएं बनाम एमएन [लाल] के बिना मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाएं)। इन समानताओं वाली वस्तुओं को ऑब्जेक्ट मैप पर निकटता में रखा जाता है; हालाँकि, उपयोगकर्ता आसानी से प्रत्येक अनुमानित वर्ग में छवियों का निरीक्षण करने और वस्तुओं को उपयुक्त मॉडल वर्ग में असाइन करने में सक्षम है। जिन ऑब्जेक्ट्स के लिए एल्गोरिदम एक वर्ग की भविष्यवाणी करने में असमर्थ है, वे 'अज्ञात' के रूप में बने रहेंगे। भविष्यवाणी एल्गोरिथ्म उपयोगकर्ताओं को जमीनी सत्य मॉडल वर्गों को तेजी से आबाद करने की अनुमति देता है, विशेष रूप से उन घटनाओं के मामले में जिन्हें इनपुट डेटा के भीतर खोजने के लिए दुर्लभ और चुनौतीपूर्ण माना जाता है, जैसे कि माइक्रोन्यूक्लिएटेड कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: मॉडल परिणामों के साथ भ्रम मैट्रिक्स। एआई सॉफ्टवेयर की परिणाम स्क्रीन मॉडल सटीकता का आकलन करने के लिए उपयोगकर्ता को तीन अलग-अलग उपकरणों के साथ प्रस्तुत करती है। (ए) वर्ग वितरण हिस्टोग्राम उपयोगकर्ता को हिस्टोग्राम के डिब्बे पर क्लिक करने की अनुमति देता है ताकि सत्य आबादी में वस्तुओं और उन वस्तुओं के बीच संबंधों का आकलन किया जा सके जिन्हें उस मॉडल वर्ग से संबंधित होने की भविष्यवाणी की गई थी। सामान्य तौर पर, किसी दिए गए मॉडल वर्ग के लिए सच्चाई और अनुमानित आबादी के बीच प्रतिशत मान एक दूसरे के जितने करीब होते हैं, मॉडल उतना ही सटीक होता है। (बी) सटीकता सांख्यिकी तालिका उपयोगकर्ता को मॉडल सटीकता का आकलन करने के लिए तीन सामान्य मशीन लर्निंग मैट्रिक्स का आकलन करने की अनुमति देती है: परिशुद्धता, याद और एफ 1। सामान्य तौर पर, ये मैट्रिक्स 100% के करीब होते हैं, मॉडल कक्षाओं में घटनाओं की पहचान करने में मॉडल उतना ही सटीक होता है। अंत में, (सी) इंटरैक्टिव भ्रम मैट्रिक्स एक संकेत प्रदान करता है कि मॉडल घटनाओं को गलत तरीके से वर्गीकृत कर रहा है। ऑन-एक्सिस प्रविष्टियां (हरा) जमीनी सच्चाई डेटा से वस्तुओं को इंगित करती हैं जिन्हें प्रशिक्षण के दौरान सही ढंग से वर्गीकृत किया गया था। ऑफ-अक्ष प्रविष्टियां (छायांकित नारंगी) जमीनी सच्चाई डेटा से वस्तुओं को इंगित करती हैं जिन्हें गलत तरीके से वर्गीकृत किया गया था। गलत वर्गीकृत वस्तुओं के विभिन्न उदाहरण दिखाए गए हैं, जिनमें (i) एमएन के साथ एक मोनोन्यूक्लिएटेड सेल के रूप में वर्गीकृत एक मोनोन्यूक्लिएटेड सेल, (ii) एमएन के साथ द्वि-न्यूक्लियेटेड सेल के रूप में वर्गीकृत एक द्विराष्ट्रीय कोशिका, (iii) अनियमित आकृति विज्ञान वाले सेल के रूप में वर्गीकृत एक मोनोन्यूक्लिएटेड सेल, (iv) एमएन के साथ एक द्विराष्ट्रीय कोशिका को अनियमित आकृति विज्ञान वाले सेल के रूप में वर्गीकृत किया गया है, और (v) एमएन के साथ एक द्विराष्ट्रीय कोशिका को द्वि-नाभिकीय कोशिका के रूप में वर्गीकृत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: जीनोटॉक्सिसिटी और साइटोटॉक्सिसिटी परिणाम। (ए-सी) साइट-बी और (डी-एफ) गैर-साइट-बी दोनों विधियों का उपयोग करके मैनिटोल, एटोपोसाइड और एमएमसी के लिए 3 घंटे के एक्सपोजर और 24 घंटे की वसूली के बाद माइक्रोस्कोपी (स्पष्ट सलाखों) और एआई (डॉटेड बार्स) द्वारा एमएन के प्रतिशत द्वारा जीनोटॉक्सिसिटी को मापा जाता है। नियंत्रण की तुलना में एमएन आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि तारांकन (* पी < 0.001, फिशर के सटीक परीक्षण) द्वारा इंगित की जाती है। त्रुटि पट्टियाँ माइक्रोस्कोपी द्वारा एमएमसी को छोड़कर प्रत्येक खुराक बिंदु पर तीन प्रतिकृति संस्कृतियों से माध्य के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं, जहां केवल डुप्लिकेट संस्कृतियों को स्कोर किया गया था। इस आंकड़े को रॉड्रिग्स एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां प्रस्तुत कार्य एमएन परख के स्कोरिंग को स्वचालित करने के लिए गहन शिक्षण एल्गोरिदम के उपयोग का वर्णन करता है। हाल के कई प्रकाशनों से पता चला है कि सहज ज्ञान युक्त, इंटरैक्टिव उपकरण गहन कम्प्यूटेशनल ज्ञान18,19 की आवश्यकता के बिना छवि डेटा का विश्लेषण करने के लिए गहन शिक्षण मॉडल के निर्माण की अनुमति देते हैं। उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस-संचालित सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग करके इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल को बहुत बड़ी डेटा फ़ाइलों के साथ अच्छी तरह से काम करने और आसानी से गहन शिक्षण मॉडल के निर्माण की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एआई सॉफ्टवेयर पैकेज में आरएफ और सीएनएन मॉडल बनाने और प्रशिक्षित करने के लिए सभी आवश्यक कदमों पर चर्चा की जाती है, जिससे परख के साइट-बी और गैर-साइट-बी संस्करणों दोनों में सभी प्रमुख घटनाओं की अत्यधिक सटीक पहचान और परिमाणीकरण की अनुमति मिलती है। अंत में, अतिरिक्त डेटा को वर्गीकृत करने और रासायनिक साइटोटॉक्सिसिटी और एमएन आवृत्ति का मूल्यांकन करने के लिए इन गहन शिक्षण मॉडल का उपयोग करने के चरणों का वर्णन किया गया है।

इस काम में उपयोग किए जाने वाले एआई सॉफ्टवेयर को एक सुविधाजनक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के साथ बनाया गया है और आईएफसी सिस्टम से उत्पन्न बड़े डेटासेट के साथ आसानी से काम करने के लिए बनाया गया है। गहन शिक्षण मॉडल का प्रशिक्षण, मूल्यांकन और वृद्धि एक सरल पुनरावृत्ति दृष्टिकोण (चित्रा 1) का पालन करते हैं, और अतिरिक्त डेटा को वर्गीकृत करने के लिए प्रशिक्षित मॉडल का आवेदन कुछ ही चरणों में पूरा किया जा सकता है। सॉफ्टवेयर में विशिष्ट क्लस्टर (चित्रा 2) और भविष्यवाणी (चित्रा 3) एल्गोरिदम शामिल हैं जो उचित जमीनी सत्य मॉडल वर्गों में वस्तुओं के तेजी से असाइनमेंट की अनुमति देते हैं। इस पेपर में प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एआई सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्मित और प्रशिक्षित सीएनएन मॉडल, एमएन परख में सभी प्रमुख घटनाओं की मजबूती से पहचान करने में सक्षम है; यह ऐसे परिणाम देता है जो पारंपरिक माइक्रोस्कोपी की तुलना में अच्छी तरह से तुलना करते हैं, इस प्रकार छवि विश्लेषण और कंप्यूटर कोडिंग अनुभव की आवश्यकता को दूर करते हैं। इसके अलावा, इंटरैक्टिव मॉडल परिणाम (चित्रा 4) विशिष्ट घटनाओं की जांच की अनुमति देते हैं जिन्हें मॉडल गलत वर्गीकृत कर रहा है। पुनरावृत्ति प्रक्रिया इन गलत वर्गीकृत घटनाओं को उपयुक्त मॉडल कक्षाओं में असाइन करने की अनुमति देती है ताकि मॉडल को सटीकता बढ़ाने के लिए फिर से प्रशिक्षित किया जा सके।

यहां प्रस्तुत परिणाम (चित्रा 5) माइक्रोस्कोपी और एआई सॉफ्टवेयर में बनाए गए सीएनएन मॉडल का उपयोग करके मैनिटोल, एटोपोसाइड और एमएमसी के मूल्यांकन को दर्शाते हैं। एमएन परख के दोनों संस्करणों का उपयोग करते हुए, एकल एआई मॉडल के साथ मूल्यांकन किया गया, साइटोटॉक्सिसिटी में वृद्धि एमएमसी और एटोपोसाइड दोनों के लिए बढ़ती खुराक के अनुरूप है, जबकि मैनिटोल के संपर्क में आने से साइटोटॉक्सिसिटी में कोई वृद्धि नहीं होती है, जैसा कि अपेक्षित है। जीनोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए, एमएन आवृत्ति में महत्वपूर्ण (फिशर का सटीक परीक्षण, एकतरफा) वृद्धि एमएमसी और एटोपोसाइड का उपयोग करके प्रदर्शित की गई थी, लेकिन मैनिटोल का उपयोग नहीं किया गया था। माइक्रोस्कोपी और एआई मॉडल दोनों के परिणामों की तुलना प्रत्येक रसायन परीक्षण के लिए खुराक सीमाओं में अच्छी तरह से की जाती है।

पिछले कई प्रकाशनों में, यह दिखाया गया है कि एक आईएफसी-आधारित एमएन परख को मास्क (एक छवि में पिक्सेल को उजागर करने वाले रुचि के क्षेत्र) का उपयोग करके छवि-आधारित विश्लेषण के साथ सरल और सरल नमूना तैयारी चरणों के साथ किया जा सकता है और इन मास्क का उपयोग करके गणना की गई विशेषताएं स्वचालित रूप से सभी प्रमुख घटनाओंको स्कोर करने के लिए 12,13,16 . यह आईएफसी-आधारित परख आईएफसी की ताकत का लाभ उठाती है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट छवि कैप्चर, सरल डीएनए रंजक के साथ सरलीकृत नमूना प्रसंस्करण, और आकृति विज्ञान के साथ सेलुलर इमेजरी का स्वचालित भेदभाव शामिल है जो प्रकाशित एमएन परख स्कोरिंग मानदंडों के साथ संरेखित होता है। हालांकि, इस वर्कफ़्लो में नुकसान भी शामिल थे, जैसे कि सुविधा-आधारित विश्लेषण तकनीकों की जटिलता जो अक्सर कठोर होती हैं और छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पैकेज12 के उन्नत ज्ञान की आवश्यकता होती है। आईएफसी द्वारा प्राप्त एमएन डेटा का विश्लेषण करने के लिए गहन शिक्षा का उपयोग दर्शाता है कि सीएनएन का उपयोग फीचर-आधारित विश्लेषणों के प्रतिबंधों और कठिनाइयों से दूर होने के लिए किया जा सकता है, जिससे ऐसे परिणाम मिलते हैं जो अत्यधिक सटीक होते हैं और माइक्रोस्कोपी स्कोरिंग14,15 की तुलना में अच्छी तरह से तुलना करते हैं। जबकि यह एआई-आधारित दृष्टिकोण आशाजनक है, अच्छी तरह से वर्णित रसायनों के विस्तारित चयन के साथ आगे के अध्ययन तकनीक की मजबूती का परीक्षण और सत्यापन करने के लिए किए जाने चाहिए। यह काम चुनौतीपूर्ण आकृति विज्ञान और कड़े स्कोरिंग आवश्यकताओं के साथ परख के प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए माइक्रोस्कोपी और पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री जैसे अधिक पारंपरिक तरीकों पर आईएफसी के फायदों को प्रदर्शित करता है।

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Disclosures

लेखकों को ल्यूमिनेक्स कॉर्पोरेशन, एक डायसोरिन कंपनी द्वारा नियोजित किया जाता है, जो इमेजस्ट्रीम इमेजिंग फ्लो साइटोमीटर और इस काम में उपयोग किए जाने वाले एमनिस एआई सॉफ्टवेयर के निर्माता हैं।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/
1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 µm filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler - 70% Isopropanol MilliporeSigma 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Guava Muse Cell Analyzer Luminex 0500-3115 A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II Luminex, a DiaSorin company 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.
MIFC analysis software - IDEAS Luminex, a DiaSorin company 100220 "Image analysis sofware"
The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software - INSPIRE Luminex, a DiaSorin company 100220 "Image acquisition software"
This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Amnis AI software Luminex, a DiaSorin company 100221 "AI software"
This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100x Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA Use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1x HyClone SH30027.01
Sheath - PBS MilliporeSigma BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x  Ca++MG++ free.  Fill container with 900 mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer - 0.4%–0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 191 माइक्रोन्यूक्लियस परख जीनोटॉक्सिसिटी साइटोटॉक्सिसिटी इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री छवि विश्लेषण मशीन लर्निंग कृत्रिम बुद्धिमत्ता
इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री और आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस का उपयोग करके माइक्रोन्यूक्लियस परख का स्वचालन
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Rodrigues, M. A., Gracia García … More

Rodrigues, M. A., Gracia García Mendoza, M., Kong, R., Sutton, A., Pugsley, H. R., Li, Y., Hall, B. E., Fogg, D., Ohl, L., Venkatachalam, V. Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence. J. Vis. Exp. (191), e64549, doi:10.3791/64549 (2023).

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