Este artigo detalha os métodos diagnósticos de cardiopatia congênita murina (DCC) usando ecocardiografia fetal, necropsia e captura de imagem de fluorescência episcópica (EFIC) usando microscopia confocal episcópica (ECM) seguida de reconstrução tridimensional (3D).
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Um Pipeline para Caracterizar Defeitos Cardíacos Estruturais em Rato Fetal
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As cardiopatias congênitas (DCC) são as principais causas de morte infantil nos Estados Unidos. Na década de 1980 e anteriores, a maioria dos pacientes com DCC moderada ou grave morreu antes da idade adulta, com a mortalidade máxima durante a primeira semana de vida. Avanços notáveis em técnicas cirúrgicas, abordagens diagnósticas e manejo médico levaram a melhorias marcantes nos resultados. Para atender às necessidades críticas de pesquisa da compreensão de defeitos cardíacos congênitos, os modelos murinos forneceram uma plataforma de pesquisa ideal, pois têm anatomia cardíaca muito semelhante à dos seres humanos e taxas de gestação curtas. A combinação de engenharia genética com ferramentas de fenotipagem de alto rendimento permitiu a replicação e o diagnóstico de defeitos cardíacos estruturais para elucidar ainda mais as vias moleculares por trás das DCC. O uso da ecocardiografia fetal não invasiva para rastrear os fenótipos cardíacos em modelos de camundongos, juntamente com a alta fidelidade da captura de imagem de fluorescência episcópica (EFIC) usando a histopatologia da microscopia confocal episcopada (ECM) com reconstruções tridimensionais (3D), permite uma visão detalhada da anatomia de vários defeitos cardíacos congênitos. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho completo desses métodos para obter um diagnóstico preciso de defeitos cardíacos congênitos murinos. A aplicação deste protocolo de fenotipagem a organismos modelo permitirá um diagnóstico preciso de DCC, produzindo insights sobre os mecanismos da DCC. Identificar os mecanismos subjacentes da DCC oferece oportunidades para potenciais terapias e intervenções.
Introdução
As cardiopatias congênitas (DCC) são o defeito congênito neonatal mais comum 1,2, acometendo cerca de 0,8%-1,7% dos neonatos e resultando em mortalidade e morbidade neonatais significativas3. A etiologia genética é fortemente indicada com DCC 4,5. Modelos de camundongos geneticamente modificados têm sido amplamente utilizados para entender a complexidade das DCCs e os mecanismos que as causam devido aos camundongos terem corações de quatro câmaras e sequências de DNA de desenvolvimento cardíaco comparáveis em fetos de camundongo....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
O uso de camundongos para esses estudos é necessário, pois os camundongos têm corações de quatro câmaras que podem imitar as DCCs humanas. Os camundongos receberam cuidados veterinários e foram alojados na instalação de cuidados com animais credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC) da instituição. Protocolos rigorosos foram seguidos para minimizar o desconforto, o estresse, a dor e a lesão dos camundongos. Os ratos foram sacrificados usando gás CO2 , o que é aceitável para pequenos roedores de acordo com as Diretrizes da Associação Médica Veterinária Americana sobre Eutanásia. Os estudos em camund....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Os embriões de camundongos com defeitos hemodinâmicos significativos foram observados como embrionários letais. Uma grande variedade de DCC pode ser identificada através do ecocardiograma fetal não invasivo de alto débito, utilizando diferentes pontos de vista (Figura 1).
Defeitos septais: As DCC mais comuns são defeitos septais, como um defeito do septo ventricular (CIV), um defeito do septo atrioventricular (DSAV) e um defeito do septo atrial (T.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Camundongos geneticamente modificados têm sido usados para entender os patomecanismos de defeitos cardíacos congênitos. Os protocolos que fornecemos neste estudo tentam agilizar e padronizar o processo de avaliação de defeitos cardíacos fetais murinos. No entanto, existem etapas críticas a serem observadas durante o protocolo. Os embriões de camundongos crescem significativamente durante cada dia de gestação, e o tempo correto para colher um camundongo pode ser determinado pela realização de um ecocardiograma fetal com p.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste manuscrito.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1,5 mL Tubos Eppendorf (ou frasco preferido para armazenamento de tecidos) | SealRite | 1615-5599 | |
| Solução de fosfato de formalina tamponada a 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Etanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldeído (PFA) fixador | ThermoScientific | 28908 | 4% de concentração de trabalho recém-preparada em 1x PBS a 4 &graus; Tubos C |
| 50 mL | Falcon | 352070 | |
| 6– Placa de 12 poços ou frasco de 20 mL para armazenamento de embriões | Falcon | 353046 | |
| Microscópio de dissecação | Leica | MDG36 | |
| (grau A1 ou A2) | F.S.T | 26002-15 | |
| Placa de Dissecação | de | FB0875713 F.S.T | com base em parafina |
| Moldes de embutir | Sakura | 4133 | |
| Tesoura extra estreita (10,5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1– 2 pares |
| Aplicação/Imagem Fiji J | NIH | Fiji.sc | |
| Ponta fina (0,05 mm x 0,01 mm) Pinça de dissecação (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pares |
| de pinças quentes | F.S.T | 11252-00 | Para orientação de embriões |
| Marcador Industrial para Blocos de Cera | Sharpie | 2003898 | Formatado para uso em laboratório |
| Câmera de microscópio Jenoptik ProgRes C14plus | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro software de aquisição | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Grande copo de vidro | Fisher Scientific | S111053 | Para derreter parafina |
| Microscópio binocular Leica M165 FC (óptica zoom 16.5:1) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Versão 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| de vidro pequeno | Fisher Scientific | 1003230215 | |
| Colher pequena perfurada (14,5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| 8 mm) | FST | 15018-10 | Um par |
| de biomicroscópio de ultrassom de ultra-alta frequência Vevo2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xileno | Fisher Químico | UN1307 |
Referências
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).
- vander Linde, D., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
