Artigo de método

Novas perspectivas metodológicas no estudo da biologia do mosquito

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DOI:

10.3791/64602

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11 de agosto de 2022

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1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, 2Department of Entomology & Nematology, Florida Medical Entomology Laboratory, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida

Neste artigo

Resumo

ARTIGOS DISCUTIDOS:

Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese eficiente específica do local em Culex quinquefasciatus. Jornal de Experimentos Visualizados. (159), e61375 (2020).

Carballar-Lejarazú, R., Pham, T. B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A. A. Ensaios laboratoriais de gaiolas pequenas de mosquitos anofelinos geneticamente modificados. Jornal de Experimentos Visualizados. (171), e62588 (2021a).

Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T. B., James, A. A. Método de microinjeção para embriões de Anopheles gambiae . Jornal de Experimentos Visualizados. (173), e62591(2021b).

Chen, T. Y. et al. Um protocolo de extração de DNA de mosquito baseado em esferas magnéticas para sequenciamento de próxima geração. Jornal de Experimentos Visualizados. (170), e62354 (2021).

Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Propagação do parasita microsporidiano Edhazardia aedis em mosquitos Aedes aegypti . Jornal de Experimentos Visualizados. (162), e61574 (2020).

Jensen, B. M. et al. Bioensaio de aplicação tópica para quantificar a toxicidade de inseticidas para mosquitos e moscas-das-frutas. Jornal de Experimentos Visualizados. (179), e63391 (2022).

Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T. M., Duvall, L. B. Alimentação e quantificação de sangue de origem animal e refeições artificiais em mosquitos Aedes aegypti . Jornal de Experimentos Visualizados. (164), e61835 (2020).

Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. P. V. Estudando a atividade de neuropeptídeos e outros reguladores do sistema excretor no mosquito adulto. Jornal de Experimentos Visualizados. (174), e61849 (2021).

Liu, X. et al. Um ensaio de alimentação oral bacteriana com mosquitos tratados com antibióticos. Jornal de Experimentos Visualizados. (163), e61341 (2020).

Meuti, M. E., Harrell, R. Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9. Jornal de Experimentos Visualizados. (163), e61651 (2020).

Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Cultura de gametócitos Plasmodium falciparum e infecção por mosquito por meio de alimentação artificial por membrana. Jornal de Experimentos Visualizados. (161), e61426 (2020).

Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Ensaio de fecundidade e fertilidade melhorado para Aedes aegypti usando placas de cultura de tecidos de 24 poços (placas EAgaL). Jornal de Experimentos Visualizados. (171), e61232 (2021).

Wang, X. et al. Expressão heteróloga e análise funcional de receptores de odor de Aedes aegypti a odores humanos em oócitos de Xenopus . Jornal de Experimentos Visualizados. (172), e61813 (2021).

Editorial

Os patógenos transmitidos por mosquitos são responsáveis por milhões de infecções humanas a cada ano. Para combater doenças causadas por esses patógenos, como malária e dengue 1,2,3, os pesquisadores estão fortalecendo a compreensão da biologia do mosquito e desenvolvendo novas ferramentas de controle de mosquitos 4,5,6. Esta coleção facilita novas pesquisas nessas áreas por meio de avanços metodológicos envolvendo biologia de mosquitos, controle de mosquitos, infecção por patógenos e transgênese de mosquitos.

Jensen et al.7 descrevem um ensaio de atividade inseticida em mosquitos e moscas-das-frutas envolvendo aplicação tópica direta de inseticidas e um procedimento de determinação de dose baseado na massa do inseto. O artigo aborda a preparação do espaço de trabalho e as soluções químicas, a aplicação de inseticidas e o ensaio de sobrevivência de insetos pós-exposição. A metodologia de aplicação tópica facilita a exposição consistente a doses definidas de inseticidas, reduzindo a variabilidade interespecífica e interensaio, o que será de grande interesse para os envolvidos no controle de insetos-praga ou na investigação da resistência a inseticidas em populações de mosquitos.

Chen et al.8 destacam um protocolo de extração de DNA simples, tratável e de alto rendimento de amostras de mosquitos para sequenciamento do genoma completo, utilizando esferas magnéticas de ligação ao DNA. O protocolo inclui a homogeneização da amostra e o processo completo de extração. Essa abordagem promove um método de extração de DNA de alto rendimento, mas altamente reprodutível, adequado para laboratórios com recursos limitados. Interessará àqueles que trabalham com aplicações genômicas de mosquitos, especialmente com preparações de DNA de mosquitos de campo.

Vários artigos da coleção abordam avanços metodológicos ligados ao estudo da biologia do mosquito. Jové et al.9 descrevem a quantificação de alto rendimento e baseada em fluorescência de volumes de refeição para mosquitos alimentados com dieta artificial. Abrange a preparação da refeição, adição do corante fluoresceína, entrega da refeição em um sistema de alimentação de baixo custo, seguido pela quantificação do volume da refeição em amostras de mosquitos alimentados. A metodologia descrita permite a avaliação efetiva da alimentação de mosquitos, com relevância para ensaios de alimentação envolvendo dietas artificiais, sangue, açúcar ou néctar. Será valioso para aqueles que estudam o comportamento alimentar dos insetos. Tsujimoto e Adelman10 descrevem uma nova técnica para testar a fecundidade e a fertilidade do mosquito usando placas de cultura de células de 24 poços cheias de agarose. O protocolo detalha a preparação da placa, alimentação do mosquito, oviposição, imagem da placa e aquisição de dados. Reduz tempo, espaço e trabalho em comparação com a metodologia convencional e interessará aos pesquisadores que avaliam a aptidão do mosquito ou a base molecular da reprodução do mosquito. Lajevardi et al.11 utilizam o ensaio de Ramsay para estudar o transporte de íons e a secreção de fluidos em tecidos excretores de mosquitos. O protocolo adapta o ensaio de Ramsay para uso com uma pequena quantidade de tecido de inseto e também discute a preparação e calibração de eletrodos, a preparação de tecidos de mosquitos para o ensaio e o registro de leituras de túbulos de Malpighi e tecidos digestivos. Este protocolo interessará àqueles que trabalham com sistemas de digestão ou excreção e regulação neuropeptídica / endócrina de tecidos de insetos. Wang et al.12 descrevem a expressão heteróloga de receptores de odor de Ae. aegypti em oócitos de Xenopus para avaliar sua resposta a odores humanos. Abrange a clonagem de genes receptores de odor, síntese de cRNA, dissecação e isolamento de oócitos de Xenopus , expressão heteróloga dos genes e, em seguida, registro de sensillum único para avaliar a atividade do receptor. Este protocolo fornece um sistema único para avaliar a base genética e funcional do olfato do mosquito, com aplicações potenciais ligadas à pesquisa do comportamento do mosquito.

Quatro artigos da coleção discutem mosquitos geneticamente modificados e o processo de transgênese. Carballar-Lejarazú et al.13 descrevem procedimentos detalhados para a produção de mosquitos Anopheles gambiae transgênicos por meio de microinjeção embrionária, enquanto Bui et al.14 demonstram microinjeção de embriões de Culex quinquefasciatus para edição de genoma baseada em CRISPR/Cas9. O primeiro é um vetor chave de parasitas da malária humana, enquanto o último é um vetor chave de arbovírus, incluindo o vírus do Nilo Ocidental, e é pouco estudado no contexto da transgênese. Esses protocolos abrangem agulhas de tração e carregamento, preparação e alinhamento de óvulos seguidos de injeção e recuperação e triagem de embriões para fenótipos transgênicos. O protocolo de An. gambiae detalha os procedimentos de oviposição e coleta de ovos e retrata visualmente as injeções bem-sucedidas. O Cx. O protocolo Quinquefasciatus descreve parâmetros específicos para puxar agulhas e dicas para aumentar as taxas de mutagênese. O artigo de Meuti e Harrell15 fornece um foco aprofundado na transgênese em Culex pipiens, particularmente no processo de injeção. O vídeo mostra todo o processo de injeção em grande profundidade; Ele descreve o preenchimento e a fixação da agulha, o posicionamento dos ovos e do injetor, bem como os detalhes sobre como injetar com sucesso. Ele fornece instruções técnicas rigorosas e solução de problemas sobre o processo de injeção e oferece dicas para maximizar a taxa de eclosão dos ovos e a aptidão larval. Esses três artigos interessarão àqueles que buscam desenvolver novas estratégias de controle de vetores, bem como àqueles que estudam a genética de Anopheles e Culex e as interações patógeno-hospedeiro. Carballar-Lejarazú et al.16 descrevem o processo de execução de ensaios em gaiolas pequenas para avaliar se os sistemas de genética dirigida podem espalhar genes específicos em populações de mosquitos virgens sob diferentes condições. O protocolo examina a mecânica dos ensaios de liberação inundativa sem acionamento e dos ensaios de genética dirigida com gerações de mosquitos sobrepostas ou não sobrepostas. Ele fornece detalhes precisos sobre taxas de adição de transgênicos de tipo selvagem, processos de triagem e adaptação de parâmetros experimentais para incluir ensaios de aptidão ou para modelar a disseminação do alelo de gene drive. Este protocolo beneficiará pesquisadores no campo de controle de vetores que estão desenvolvendo novos sistemas de genética dirigida e examinando a eficácia da genética dirigida.

Os três últimos artigos da coleção discutem a cultura e a exposição a patógenos. Liu et al.17 demonstram o protocolo de reintrodução de bactérias em mosquitos adultos após o tratamento com antibióticos, a fim de ajudar a entender os papéis biológicos desempenhados pela microbiota. Abrange cultura e isolamento de bactérias, tratamento com antibióticos e ensaios de alimentação bacteriana. O protocolo fornece uma boa síntese de um procedimento complexo e multifacetado. Será útil para os interessados no estudo da microbiota do mosquito ou no desenvolvimento de mosquitos gnotobióticos adultos. Grigsby et al.18 destacam o protocolo para a integração do cultivo do parasita Edhazardia aedis microsporidian na criação padrão de Aedes aegypti . Ele detalha o isolamento, identificação e enumeração de esporos infecciosos, antes da reinfecção dos mosquitos e manutenção dos ovos do mosquito infectado. Ele fornece conselhos de solução de problemas sobre a detecção de esporos e a coordenação da eclosão do mosquito com a preparação de esporos. Este protocolo interessará àqueles que buscam cultivar parasitas microsporídeos para fins experimentais e aqueles que examinam o impacto da infecção parasitária na imunidade ou capacidade vetorial do mosquito. Tripathi et al.19 detalham o protocolo de cultivo de gametócitos de Plasmodium falciparum , realização de infecções de mosquitos Anopheles via sistema de alimentação de membrana-vidro e contagem de oocistos e esporozoítos. É um protocolo essencial para a cultura de P. falciparum , que pode ser difícil de alcançar. O protocolo será altamente valioso para aqueles que investigam a infecção e transmissão de Plasmodium em mosquitos, para aqueles que procuram desenvolver estratégias antimaláricas, incluindo ferramentas de bloqueio de transmissão, e para aqueles que examinam a competência vetorial de populações de An. gambiae , incluindo linhas transgênicas e estratégias de genética dirigida.

A coleção de artigos trata de muitos tópicos de pesquisa que são importantes para o futuro do controle de mosquitos e patógenos transmitidos por mosquitos. Compreender a resistência do mosquito aos pesticidas é fundamental, pois reflete o sucesso dos programas de controle atuais; Além disso, detectar resistência pode ser um sinal de que mudanças nas estratégias de controle são necessárias. As tecnologias de engenharia genética, incluindo transgênese de mosquitos, edição de genoma e genética dirigida, provavelmente desempenharão um papel fundamental no controle de mosquitos na próxima década e além devido à sua alta tratabilidade e adaptabilidade. O conhecimento aprimorado da biologia do mosquito, especificamente nos tópicos de genômica populacional, interações patógeno-hospedeiro, comportamento do mosquito e a base molecular das principais características biológicas, fornecerá informações valiosas que podem ser utilizadas para desenvolver novas ferramentas de controle. Por exemplo, a identificação de genes envolvidos no olfato pode ajudar os pesquisadores a desenvolver novos repelentes, enquanto a identificação de genes envolvidos nas interações patógeno-hospedeiro pode levar ao desenvolvimento de mosquitos transgênicos portadores de efetores antipatogênicos. Esta coleção aborda todos esses tópicos e, nas mãos de biólogos de vetores de todo o mundo, os métodos descritos aqui ajudarão a facilitar insights novos e exclusivos sobre muitos aspectos da biologia do mosquito. Um dos principais desafios para o futuro será alavancar o conhecimento gerado nessas áreas temáticas para produzir novas estratégias de controle ou complementar ou otimizar as estratégias atuais.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), o projeto Hatch 1026692 ao EPC.

Referências

  1. Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
  2. Bhutta, Z. A., Sommerfeld, J., Lassi, Z. S., Salam, R. A., Das, J. K. Global burden, distribution, and interventions for infectious diseases of poverty. Infectious Diseases of Poverty. 3, 21(2014).
  3. Caminade, C., McIntyre, K. M., Jones, A. E. Impact of recent and future climate change on vector-borne diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1436 (1), 157-173 (2019).
  4. Caragata, E. P., et al. Prospects and pitfalls: Next-Generation tools to control mosquito-transmitted disease. Annual Review of Microbiology. 74, 455-475 (2020).
  5. Jones, R. T., Ant, T. H., Cameron, M. M., Logan, J. G. Novel control strategies for mosquito-borne diseases. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 376 (1818), 20190802(2021).
  6. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (1), 0007831(2020).
  7. Jensen, B. M., et al. Topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies. Journal of Visualized Experiments. (179), e63391(2022).
  8. Chen, T. Y., et al. A magnetic-bead-based mosquito DNA extraction protocol for next-generation sequencing. Journal of Visualized Experiments. (170), e62354(2021).
  9. Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T. M., Duvall, L. B. Feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (164), e61835(2020).
  10. Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Improved fecundity and fertility assay for Aedes aegypti using 24 well tissue culture plates (EAgaL plates). Journal of Visualized Experiments. (171), e61232(2021).
  11. Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. V. Studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito. Journal of Visualized Experiments. (174), e61849(2021).
  12. Wang, X., et al. Heterologous expression and functional analysis of Aedes aegypti odorant receptors to human odors in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (172), e61813(2021).
  13. Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T. B., James, A. A. Microinjection method for Anopheles gambiae embryos. Journal of Visualized Experiments. (173), e62591(2021).
  14. Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in Culex quinquefasciatus. Journal of Visualized Experiments. (159), e61375(2020).
  15. Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing and injecting embryos of Culex mosquitoes to generate null mutations using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (163), e61651(2020).
  16. Carballar-Lejarazú, R., Pham, T. B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A. A. Small-Cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (171), e62588(2021).
  17. Liu, X., et al. A bacterial oral feeding assay with antibiotic-Tteated mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61341(2020).
  18. Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Propagation of the microsporidian parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (162), e61574(2020).
  19. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426(2020).

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