Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.
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Artigo de método
Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tecido adiposo marrom (BAT) está presente apenas em mamíferos e tem função termogênica. Os adipócitos marrons são caracterizados por um citoplasma multilocular com múltiplas gotículas lipídicas, um núcleo central, um alto conteúdo mitocondrial e a expressão da proteína desacopladora 1 (UCP1). O BAT foi proposto como um potencial alvo terapêutico para a obesidade e seus distúrbios metabólicos associados devido à sua capacidade de dissipar energia metabólica como calor. Para investigar a função e regulação do BAT, a cultura de adipócitos marrons é indispensável. O presente protocolo otimiza o processamento de tecidos e a diferenciação celular para a cultura de adipócitos marrons de camundongos recém-nascidos. Além disso, são mostrados procedimentos para a imagem de adipócitos diferenciados com imunofluorescência confocal e microscopia eletrônica de transmissão. Nos adipócitos marrons diferenciados com as técnicas aqui descritas, as principais características definidoras do BAT clássico são preservadas, incluindo altos níveis de UCP1, aumento da massa mitocondrial e contato físico muito próximo entre as gotículas lipídicas e as mitocôndrias, tornando este método uma ferramenta valiosa para estudos de BAT.
Introdução
O tecido adiposo branco e marrom diferem em sua localização anatômica, origem celular, função, morfologia e massa total. O tecido adiposo branco (TAB) é o principal reservatório de energia fisiológica do corpo e armazena grandes quantidades de triacilglicerol (TAG) em células altamente especializadas que possuem uma única gotícula lipídica gigante ocupando a maior parte de seu volume celular1. A lipólise TAG libera ácidos graxos livres, que entram na circulação sistêmica para atender às demandas de energia durante o jejum ou outros estados de balanço energético negativo. Além disso, o WAT secreta produtos proteicos e lipídicos, chamados adipoci....
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Protocolo
Os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Pontifícia Universidade Católica do Chile. Camundongos recém-nascidos P0,5 de ambos os sexos, derivados de um fundo misto de cepas C57BL/6J e 129J, foram usados para este estudo.
1. Extração de tecido
- Limpe e desinfete a bancada com uma solução de etanol a 70% e use material cirúrgico estéril.
- Eutanasiar filhotes recém-nascidos P0,5 por decapitação com tesoura cirúrgica seguindo o protocolo aprovado institucionalmente.
- Coloque o rato em decúbito ventral (virado para baixo) e faça uma incisão de....
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Resultados
A adipogênese é regulada por uma rede de fatores de transcrição que são responsáveis tanto pela expressão de proteínas-chave que induzem a formação e o funcionamento dos adipócitos marrons22, incluindo reguladores adipogênicos clássicos como PPARγ e C / EBPα23 , 24 , 25 , bem como marcadores de adipócitos maduros26 , 27. Através do teste das difer.......
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Discussão
O presente protocolo é um procedimento de diferenciação bifásica simples e replicável (Figura 2) para gerar células com as características moleculares e morfológicas de adipócitos marrons maduros. A colheita cirúrgica do iBAT é o primeiro passo crítico porque a ruptura do tecido limita severamente a viabilidade do material de partida. O processamento de tecidos também é fundamental porque uma suspensão celular homogênea e livre de detritos aumenta muito a quantidade de SVF que pode ser culti.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O financiamento foi fornecido pela FONDECYT (1181214 e 1221146) e Anillos (ACT210039) para bolsas de VC e doutorado ANID 21171743 para AMF e ANID 21150665 para FS. Agradecemos a Alejandro Munizaga pela ajuda no processamento das amostras e assessoria técnica para a microscopia eletrônica de transmissão. As ilustrações foram produzidas usando BioRender.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10x Tris/Glycine Buffer | BioRad | 1610734 | |
| 16% Paraformaldeído Solução Aquosa | Ciências de Microscopia Eletrônica | 15710 | |
| 35 mm TC-tratado Easy-Grip Estilo Placa de Cultura de Células | Falcon | 353001 | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Calbiochem | 410957 | |
| 40% Solução de Acrilamida/Bis, 37.5:1 | BioRad | 1610148 | |
| placa de 6 poços | SPL Ciências da Vida | - | |
| 96 poços ópticos pretos com tampa para cultura de células estéreis | Thermo Scientific | 165305 | |
| AccuRuler RGB Plus Escada de Proteína Pré-manchada | Maestrogen | 02102-250 | |
| ACK tampão de lisificação | Gibco | A10492-01 | |
| Persulfato de Amônio | BioRad | 1610700 | |
| Antibiótico-antimicótico | Gibco | ||
| Anti-mouse IgG, Anticorpo Ligado a HRP | Sinalização Celular | 7076 | |
| Anti-coelho IgG, Anticorpo Ligado a HRP | Cell Signaling | 7074 | |
| Bloqueador de grau de blotting | BioRad | 170-6404 | |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| C/EBPα anticorpo | Sinalização Celular | 2295 | |
| CaCl2 | Calbiochem | ||
| CD36 anticorpo | Invitrogen | PA1-16813 | |
| Cell Strainer 100 µ m, nylon | Falcon | 352360 | |
| Cell Strainer 40 µ m, nylon | Falcon | 352340 | |
| Collagenase tipo II | Gibco | 17101-015 | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multimode | Reader Biotek | ||
| Dexametasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM/F-12, pó | Gibco | 12500062 | |
| EMBed-812 KIT DE INCORPORAÇÃO (EPON) | Microscopia Eletrônica Sciences | 14120 | |
| Etanol absoluto | Merck | 100983 | |
| Soro fetal bovino | Gibco | 16000-044 | |
| Gelatina de pele de peixe de água fria | Sigma | G7041 | |
| Glicose | Gibco | 15023-021 | |
| Solução Aquosa de Glutaraldeído 25% | Microscopia Eletrônica Ciências | 16210 | |
| Anticorpo Secundário de AngiG (H+L) Anti-Ácido Cruzado Anti-Coelho de Cabra, Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11012 | |
| Halt Inibidor de Fosfatase Coquetel 100X | Thermo Scientific | 78427 | |
| Inibidor de Protease Halt Cocktail 100X | Thermo Scientific | 78429 | |
| Hoechst 33258 | Invitrogen | H1398 | |
| Membrana PVDF Immun-Blot | BioRad | 1620177 | |
| Indometacina | Sigma | I7378 | |
| Insulina | Sigma | I3536 | |
| KCl | Calbiochem | ||
| KH2PO4 | Calbiochem | 529568 | |
| KHCO3 | Sigma | 60339 | |
| Lane Marker Reducing Sample Buffer | Thermo Scientific | 39000 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| MilliQ estéril à água | - | - | |
| Mitoprofile Total OXPHOS Anticorpos de roedores WB Cocktail | Abcam | MS604 | |
| NaCl | Merck | ||
| OmniPur 10x PBS Concentrado Líquido | Calbiochem | 6505-OP | |
| Tetróxido de Ósmio | Microscopia Eletrônica Sciences | 19100 | |
| Anticorpo Perilipin 1 | Sinalização Celular | 9349 | |
| PPAR&gama; (81B8) anticorpo | Cell Signaling | 2443 | |
| RIPA buffer lysis | Thermo Scientific | 89901 | |
| Rosiglitazone | Merck | 557366 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma | S5761 | |
| Microscopia Eletrônica | de Cacpdilato de Sódio | Sciences 12300 | |
| Dodecyl Sulfato de Sódio | BioRad | 1610301 | |
| T3 | Sigma | T6397 | |
| Talos F200C G2 | Thermo Scientific | ||
| TEMED | BioRad | 1610800 | |
| TOM20 anticorpo | Sinalização Celular | 42406 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Sinalização Celular | 12498 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tween 20, Grau de Biologia Molecular | Promega | Anticorpo H5152 | |
| UCP1 | Sinalização Celular | 14670 | |
| Ultracut R | Leica | ||
| Ciências de Microscopia Eletrônica | de Acetato de Uranila | 22400 | |
| Westar Sun | Cyanagen | XLS063 | |
| Westar Supernova | Cyanagen | XLS3 |
Referências
- Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
- Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings.
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Reimpressões e permissões
