Artigo de método

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

DOI:

10.3791/64604

⸱

3 de fevereiro de 2023

 ,  ,  , 
1Department of Nutrition, Diabetes and Metabolism, Pontificia Universidad Católica de Chile

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O tecido adiposo marrom (BAT) está presente apenas em mamíferos e tem função termogênica. Os adipócitos marrons são caracterizados por um citoplasma multilocular com múltiplas gotículas lipídicas, um núcleo central, um alto conteúdo mitocondrial e a expressão da proteína desacopladora 1 (UCP1). O BAT foi proposto como um potencial alvo terapêutico para a obesidade e seus distúrbios metabólicos associados devido à sua capacidade de dissipar energia metabólica como calor. Para investigar a função e regulação do BAT, a cultura de adipócitos marrons é indispensável. O presente protocolo otimiza o processamento de tecidos e a diferenciação celular para a cultura de adipócitos marrons de camundongos recém-nascidos. Além disso, são mostrados procedimentos para a imagem de adipócitos diferenciados com imunofluorescência confocal e microscopia eletrônica de transmissão. Nos adipócitos marrons diferenciados com as técnicas aqui descritas, as principais características definidoras do BAT clássico são preservadas, incluindo altos níveis de UCP1, aumento da massa mitocondrial e contato físico muito próximo entre as gotículas lipídicas e as mitocôndrias, tornando este método uma ferramenta valiosa para estudos de BAT.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O tecido adiposo branco e marrom diferem em sua localização anatômica, origem celular, função, morfologia e massa total. O tecido adiposo branco (TAB) é o principal reservatório de energia fisiológica do corpo e armazena grandes quantidades de triacilglicerol (TAG) em células altamente especializadas que possuem uma única gotícula lipídica gigante ocupando a maior parte de seu volume celular1. A lipólise TAG libera ácidos graxos livres, que entram na circulação sistêmica para atender às demandas de energia durante o jejum ou outros estados de balanço energético negativo. Além disso, o WAT secreta produtos proteicos e lipídicos, chamados adipocinas e lipocinas, respectivamente, que possuem funções reguladoras metabólicas, imunológicas e reprodutivas, tornando o WAT o maior tecido endócrino do corpo2.

O tecido adiposo marrom (BAT) é um órgão muito menor cuja principal função fisiológica é a termogênese sem tremores para prevenir a hipotermia. Em camundongos e humanos recém-nascidos, o BAT é um órgão bem definido localizado no espaço interescapular. Humanos adultos não têm BAT interescapular (iBAT); no entanto, eles desenvolvem aglomerados de células marrons semelhantes a adipócitos integradas em depósitos que, de outra forma, compreendem principalmente o WAT. Esses adipócitos "marrom-em-branco" (brite) compartilham características morfológicas e moleculares com os adipócitos clássicos do iBAT, mas têm uma origem celular diferente 3,4.

Em contraste com os adipócitos brancos, os adipócitos marrons têm múltiplas gotículas lipídicas pequenas e mitocôndrias abundantes5. A proteína de desacoplamento 1 (UCP1, também conhecida como termogenina) é expressa exclusivamente por adipócitos marrons e brite e medeia o vazamento de prótons na membrana mitocondrial interna (IMM), desacoplando assim o transporte de elétrons da síntese de ATP e gerando calor. A termogênese sem tremores no BAT é ativada pela norepinefrina (NE), que é liberada dos terminais simpáticos no BAT em resposta à estimulação fria6. O NE se liga aos receptores beta-adrenérgicos (principalmente beta 3) na superfície dos adipócitos marrons e desencadeia uma cascata de sinalização mediada por cAMP intracelular. Isso resulta em lipólise de TAG, beta-oxidação de ácidos graxos mitocondriais e geração de calor após a ativação de UCP13. A estreita relação funcional entre gotículas lipídicas e mitocôndrias em adipócitos marrons tem paralelos estruturais, como a interação entre essas organelas em áreas grandes e com contato físico muito estreito 7,8.

O iBAT tem vasos sanguíneos abundantes e terminais simpáticos9. Essas estruturas, juntamente com os pré-adipócitos, células imunes, fibroblastos e moléculas da matriz extracelular, compõem a fração vascular estromal adiposa (FVS)10. Muitos protocolos foram relatados para gerar adipócitos maduros a partir de pré-adipócitos 11,12,13,14,15 (Tabela Suplementar 1); no entanto, eles exibem variações extremas no processamento de tecidos e na composição dos meios de cultura de diferenciação. O protocolo aqui descrito permite a diferenciação eficiente e reprodutível de adipócitos marrons que (1) expressam os principais fatores de transcrição adipogênica receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PPARγ) e CCAAT/proteína alfa de ligação ao intensificador (C/EBPα), (2) expressam os marcadores de adipócitos maduros perilipina1 (PLIN1) e determinante de cluster 36 (CD36), (3) acumulam gotículas lipídicas abundantes, (4) têm alta massa mitocondrial e uma alta abundância de complexos OXPHOS, (5) têm potencial termogênico, determinado por altos níveis de UCP1, e (6) têm alterações morfológicas mitocondriais associadas ao fenótipo de adipócitos marrons maduros. Essa metodologia é utilizada para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à lipodistrofia generalizada 15,16,17.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Pontifícia Universidade Católica do Chile. Camundongos recém-nascidos P0,5 de ambos os sexos, derivados de um fundo misto de cepas C57BL/6J e 129J, foram usados para este estudo.

1. Extração de tecido

  1. Limpe e desinfete a bancada com uma solução de etanol a 70% e use material cirúrgico estéril.
  2. Eutanasiar filhotes recém-nascidos P0,5 por decapitação com tesoura cirúrgica seguindo o protocolo aprovado institucionalmente.
  3. Coloque o rato em decúbito ventral (virado para baixo) e faça uma incisão de 1 cm de comprimento na pele ao nível médio das costas do animal com uma tesoura afiada. Remova a pele com cuidado.
    NOTA: Esta etapa é crítica porque, se a pele não for bem removida, pode rasgar e danificar o iBAT e impedir a preparação ideal do SVF.
  4. Separe cirurgicamente o iBAT da carcaça usando uma tesoura pequena.
    NOTA: O IBAT é visualizado como dois lóbulos gordurosos que podem ser removidos independentemente.
  5. Colha os dois lóbulos do iBAT usando um alicate de ponta curva para remover os lóbulos de forma independente.
  6. Coloque os dois lóbulos em um tubo de plástico com 1,5 mL de PBS estéril em temperatura ambiente. Mantenha os tecidos em seus tubos individuais até que a extração de tecido seja concluída para todos os filhotes necessários.

2. Digestão de tecidos

  1. Alíquota de 300 μL de tampão de digestão de colagenase tipo II (0,2% de colagenase tipo II em tampão [25 mM de KHCO3, 1,2 mM de MgSO4, 120 mM de NaCl, 5 mM de glicose, 12 mM de KH2PO4, 4,8 mM de KCl, 1,2 mM de CaCl2, 2,5% de BSA e 1% de penicilina/estreptomicina, em pH 7,4]) (Tabela 1) em tubos de 1,5 mL em gabinete de biossegurança.
    NOTA: Prepare tubos suficientes para o número de tecidos individuais a serem extraídos. No presente estudo, foram utilizados sete tubos, correspondendo a uma ninhada de sete filhotes.
  2. Vá para a bancada e coloque os lobos do iBAT no tampão de digestão da colagenase tipo II para degradar a matriz extracelular.
  3. Incubar os tecidos do iBAT durante 45 min a 37 °C com agitação suave contínua a 800 rpm (figura 1).

3. Processamento de tecidos

NOTA: Após a digestão, execute todas as etapas a seguir em uma capela de cultura de tecidos de fluxo laminar classe II.

  1. Prepare e rotule dois conjuntos de tubos de plástico de 1,5 mL para cada amostra individual.
  2. Interrompa mecanicamente a suspensão tecidual no tampão de digestão da colagenase tipo II pipetando para cima e para baixo usando uma micropipeta P1.000 e pontas filtradas. Use uma nova ponta para cada amostra.
    NOTA: Esta é uma etapa crítica. Certifique-se de desagregar mecanicamente o tecido com a ponta e pipetar para cima e para baixo até que a homogeneização macroscópica esteja completa.
  3. Passe os tecidos desagregados através de filtros de células individuais de 100 μm (consulte a Tabela de Materiais) em novos tubos de 1,5 mL.
  4. Adicione 500 μL de tampão ACK (consulte a Tabela de Materiais) às amostras de tecido filtrado, inverta os tubos 4-5 vezes e incube em temperatura ambiente por 4 min.
    NOTA: Não exceda o tempo de incubação, pois isso pode danificar as células de interesse.
  5. Centrifugue as amostras de tecido a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente.
  6. Descarte o sobrenadante invertendo o tubo e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio de cultura (DMEM-F12 com 10% de FBS, antibiótico antimicótico a 1%, pH 7,2) (consulte a Tabela de Materiais).
  7. Passe as suspensões por um filtro de células de 40 μm em novos tubos de 1,5 mL usando uma micropipeta P1.000 e pontas filtradas.
  8. Centrifugue as amostras a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
    NOTA: O pellet corresponde ao SVF contendo pré-adipócitos.
  9. Rejeitar o sobrenadante invertendo o tubo e ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de cultura pipetando.
  10. Prepare um tubo de 15 mL para cada amostra, adicionando 5 mL de meio de cultura.
  11. Adicione cada pellet ressuspenso ao seu tubo de 15 ml correspondente, contendo 5 ml de meio de cultura. Inverta o tubo 4-5 vezes para misturar o conteúdo da célula.
  12. Semeie cada amostra em seis poços de uma placa de cultura de 24 poços adicionando 1 mL da suspensão a cada poço (Figura 1).

4. Cultura da fração vascular estromal (SVF)

  1. Troque o meio de cultura a cada dois dias até que as células atinjam 100% de confluência.
    NOTA: Durante este período, as células aderentes não plásticas são removidas, resultando em uma cultura primária enriquecida com um SVF contendo pré-adipócitos.
  2. Quando as células se tornarem 100% confluentes, remova o meio de cultura e lave as células com 800 μL de PBS estéril.
  3. Adicione 150 μL de tripsina-EDTA a 0,25% (consulte a Tabela de Materiais) a cada poço e coloque a placa de cultura por 3 min na incubadora para o descolamento das células.
    NOTA: Verifique se as células estão separadas usando um microscópio de luz de contraste de fase.
  4. Inative a tripsina adicionando 850 μL de meio de cultura a cada poço.
  5. Colete as células dos seis poços semeados na etapa 3.12 e transfira-as para um tubo de 15 mL.
  6. Faça o volume total até 12 mL adicionando 6 mL de meio de cultura. Inverta o tubo 4-5 vezes para misturar o conteúdo.
  7. Semeie 1 mL da amostra em cada poço de uma placa de 12 poços. Troque o meio de cultura a cada dois dias até que as células atinjam a confluência.
  8. Quando as células se tornarem 100% confluentes, separe-as com 150 μL de tripsina-EDTA a 0,25% seguindo as mesmas condições de incubação da etapa 4.3 e semeie-as de acordo com a área de superfície do poço necessária para o experimento.
  9. Realize imagens de alta resolução após fixar as células seguindo a etapa 8.
    NOTA: Uma densidade de 35.000 células/cm² é recomendada para experimentos posteriores (extração de proteína e RNA total, 330.000 células [um poço de uma placa de 6 poços]; imunofluorescência [IF], 10.500 células [um poço de uma placa de 96 poços]).

5. Diferenciação adipogênica

  1. Incubar as células com meio de indução (DMEM-F12 com 10% de FBS, antibiótico antibiótico a 1%, pH 7,2, suplementado com dexametasona 500 nM, indometacina 125 nM, 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM [IBMX], rosiglitazona 5 μM, T3 1 nM e insulina 20 nM) (Tabela 1) por 72 h (dia 0 ao dia 2) (Figura 2).
    NOTA: O meio de cultura deve ser trocado em dias alternados; Assim, a primeira mudança do meio deve ocorrer no dia 2 após a indução inicial.
  2. Mude para meio de manutenção (DMEM-F12 com 10% de FBS, antibiótico a 1%, pH 7,2, suplementado com 5 μM de rosiglitazona, 1 nM de T3 e 20 nM de insulina) (Tabela 1) no dia 3 e mantenha esse meio de manutenção até o dia 7 (Figura 2).
    NOTA: O meio de manutenção deve ser trocado no dia 5 e no dia 7. Pequenas gotículas lipídicas podem ser visualizadas por microscopia de contraste de fase a partir do dia 3 de diferenciação. Grandes gotículas lipídicas são evidentes no dia 7 de diferenciação. Procedimentos de diferenciação com mais de 7 dias resultam em perda celular por descolamento, provavelmente devido à alta flutuabilidade das células carregadas de lipídios.

6. Preparação do homogeneizado celular

  1. Remova o meio de cultura no dia 0 e no dia 7 de diferenciação e lave as células 3 vezes com PBS estéril.
  2. Após a última limpeza, adicione 1,3 mL de PBS estéril a cada poço.
    NOTA: Mantenha as células no gelo até a limpeza da última placa.
  3. Colha as células mecanicamente de um poço de uma placa de 6 poços (~ 330.000 células) com um raspador de células e coloque a suspensão celular em um tubo de 1,5 mL.
  4. Centrifugue as amostras a 2.800 x g por 5 min a 4 °C.
  5. Remova o PBS com uma micropipeta e mantenha os tubos no gelo.
  6. Ressuspenda o pellet celular em tampão RIPA com inibidores de protease e fosfatase (consulte a Tabela de Materiais) e incube por 30 min em gelo.
    NOTA: Para lisar o pellet celular, 70-80 μL são suficientes.
  7. Centrifugue as amostras a 21.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  8. Remova cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de 1,5 mL e descarte o pellet.
    NOTA: O sobrenadante representa o homogeneizado celular.
  9. Determinar a concentração proteica do homogeneizado celular usando ácido bicinconínico (BCA) para a detecção colorimétrica e quantificação da proteína total18,19.

7. Western blotting

  1. Preparar 30 μg do homogeneizado celular (a partir do passo 6.8) e adicionar tampão de carregamento de amostras SDS-PAGE disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).
  2. Resolva em eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS20 (PAGE-SDS) de acordo com o peso molecular de cada proteína.
    NOTA: Use 10% PAGE-SDS para PPARγ, C / EBPα, PLIN1, CD36 e UCP1, 12% PAGE-SDS para OXPHOS e 15% PAGE-SDS para TOM20 (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Eletrotransfira as proteínas para a membrana de PVDF (consulte a Tabela de Materiais) a 350 mA por 2 h.
    NOTA: O recipiente de gelo deve ser trocado após 1 h. Durante todo o processo, mantenha a câmara no gelo.
  4. Bloqueie as membranas com 5% de BSA ou leite sem gordura em solução salina tamponada com Tris (TBS) 0,1% Tween 20 (TBS-T) por 2 h seguindo as recomendações das folhas de dados dos anticorpos.
  5. Incubar com os anticorpos primários (os anticorpos utilizados neste estudo são detalhados na Tabela de Materiais) durante a noite a 4 °C.
    NOTA: Todos os anticorpos utilizados neste estudo foram diluídos para 1:1.000 em solução de bloqueio.
  6. Lave as membranas 3 vezes com 0,1% de TBS-T e incube-as com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (consulte a Tabela de Materiais) por 2 h em temperatura ambiente.
  7. Lave as membranas 3 vezes com 0,1%. TBS-T. Faça uma última lavagem com 1x TBS. Armazene as membranas em 1x TBS até a visualização. Recomenda-se armazenar por no máximo 1 h.
  8. Visualize as membranas por quimioluminescência20 ou qualquer outro método preferido.

8. Imagens de alta resolução

  1. Realize o ensaio de imunofluorescência seguindo as etapas abaixo.
    1. Semeie e diferencie as culturas primárias de pré-adipócitos marrons de camundongos recém-nascidos P0,5 (seguindo a etapa 4.8) em placas de 96 poços com fundo óptico (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Fixe as células no dia 0 e no dia 7 de diferenciação com PFA a 4% por 20 min e lave 3 vezes com PBS estéril.
    3. Permeabilize as células com Triton X-100 a 0,1% por 15 min e bloqueie-as com gelatina de peixe a 3% (consulte a Tabela de Materiais) por 1 h em temperatura ambiente.
    4. Lave 3 vezes com PBS estéril e incube com anticorpo PLIN1 (1:400, consulte a Tabela de Materiais) em 1% BSA / PBS durante a noite a 4 ° C em uma câmara úmida.
    5. Lave 3 vezes com PBS estéril e incube com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo a 1:1.000 (1% BSA/PBS) (consulte a Tabela de Materiais) por 1 h em temperatura ambiente.
    6. Manchar os núcleos com 1 μg/mL Hoechst 33342 e as gotículas lipídicas com 1 μg/mL BODIPY por 30 min à temperatura ambiente.
      NOTA: As imagens de fluorescência foram adquiridas usando um sistema de imagem celular (consulte a Tabela de Materiais). No geral, 9 ou 16 fotos por poço foram adquiridas com dois a três canais com uma ampliação de 20x.
  2. Realize a microscopia eletrônica de transmissão seguindo as etapas abaixo.
    1. Cultive e diferencie os pré-adipócitos marrons em placas de cultura de células de 35 mm x 10 mm.
    2. No dia 0 e no dia 7 de diferenciação, remova o meio e fixe as células por 1 h com glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,0 (consulte a Tabela de Materiais).
    3. Lave as células 3 vezes com tampão de cacodilato de sódio 0,05 M por 10 min e trate-as com tetróxido de ósmio aquoso a 1% (consulte a Tabela de Materiais) por 15 min.
    4. Lave as células 3 vezes com água bidestilada por 5 min e trate-as com acetato de uranila a 1% (consulte a Tabela de Materiais) por 15 min.
    5. Desidrate as células com um gradiente de etanol de 30%, 50%, 70%, 95% e 100% por 5 minutos de cada vez.
    6. Pré-incorpore as células em epon / etanol 1: 1 por 30 min e depois em epon por 1 h (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: A inclusão de células é realizada diretamente no prato, adicionando epon fresco para cobrir toda a monocamada de cultura de células. Deixe o epon polimerizar em um forno a 60 ° C por 24 h.
    7. Mergulhe a placa de cultura de células em nitrogênio líquido por 2 min e, em seguida, frature-a usando um alicate para soltar a inclusão de plástico.
    8. Cole os segmentos de inclusão com células em um bloco de resina para obter cortes finos (80 nm) paralelos à superfície em um ultramicrótomo (consulte a Tabela de Materiais).
    9. Manchar os cortes com acetato de uranila a 1% por 4 min e citrato de chumbo por 5 min, de acordo com Reynolds et al.21.
    10. Visualize as grades em um microscópio eletrônico (consulte a Tabela de Materiais).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A adipogênese é regulada por uma rede de fatores de transcrição que são responsáveis tanto pela expressão de proteínas-chave que induzem a formação e o funcionamento dos adipócitos marrons22, incluindo reguladores adipogênicos clássicos como PPARγ e C / EBPα23 , 24 , 25 , bem como marcadores de adipócitos maduros26 , 27. Através do teste das difer...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo é um procedimento de diferenciação bifásica simples e replicável (Figura 2) para gerar células com as características moleculares e morfológicas de adipócitos marrons maduros. A colheita cirúrgica do iBAT é o primeiro passo crítico porque a ruptura do tecido limita severamente a viabilidade do material de partida. O processamento de tecidos também é fundamental porque uma suspensão celular homogênea e livre de detritos aumenta muito a quantidade de SVF que pode ser culti...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O financiamento foi fornecido pela FONDECYT (1181214 e 1221146) e Anillos (ACT210039) para bolsas de VC e doutorado ANID 21171743 para AMF e ANID 21150665 para FS. Agradecemos a Alejandro Munizaga pela ajuda no processamento das amostras e assessoria técnica para a microscopia eletrônica de transmissão. As ilustrações foram produzidas usando BioRender.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x Tris/Glycine BufferBioRad1610734
16% Paraformaldeído Solução AquosaCiências de Microscopia Eletrônica15710
35 mm TC-tratado Easy-Grip Estilo Placa de Cultura de CélulasFalcon353001
3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)Calbiochem410957
40% Solução de Acrilamida/Bis, 37.5:1BioRad1610148
placa de 6 poços SPL Ciências da Vida -
96 poços ópticos pretos com tampa para cultura de células estéreisThermo Scientific165305
AccuRuler RGB Plus Escada de Proteína Pré-manchada Maestrogen02102-250
ACK tampão de lisificação GibcoA10492-01
Persulfato de Amônio BioRad1610700
Antibiótico-antimicóticoGibco 
Anti-mouse IgG, Anticorpo Ligado a HRPSinalização Celular7076
Anti-coelho IgG, Anticorpo Ligado a HRP   Cell Signaling7074
Bloqueador de grau de blotting BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C/EBPα anticorpoSinalização Celular2295
CaCl2Calbiochem 
CD36 anticorpoInvitrogenPA1-16813
Cell Strainer 100 µ m, nylonFalcon352360
Cell Strainer 40 µ m, nylonFalcon352340
Collagenase tipo IIGibco17101-015
Cytation 5 Cell Imaging MultimodeReader Biotek
Dexametasone SigmaD4902
DMEM/F-12, póGibco12500062
EMBed-812 KIT DE INCORPORAÇÃO (EPON)Microscopia Eletrônica Sciences14120
Etanol absolutoMerck 100983 
Soro fetal bovinoGibco16000-044
Gelatina de pele de peixe de água friaSigmaG7041
GlicoseGibco 15023-021
Solução Aquosa de Glutaraldeído 25%Microscopia Eletrônica Ciências16210
Anticorpo Secundário de AngiG (H+L) Anti-Ácido Cruzado Anti-Coelho de Cabra, Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11012
Halt Inibidor de Fosfatase Coquetel 100X Thermo Scientific78427
Inibidor de Protease Halt Cocktail 100X Thermo Scientific78429
Hoechst 33258InvitrogenH1398
Membrana PVDF Immun-Blot BioRad1620177
Indometacina Sigma I7378 
Insulina SigmaI3536
KClCalbiochem 
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Lane Marker Reducing Sample Buffer Thermo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
MilliQ estéril à água --
Mitoprofile Total OXPHOS Anticorpos de roedores WB CocktailAbcam MS604
NaClMerck 
OmniPur  10x PBS Concentrado LíquidoCalbiochem6505-OP
Tetróxido de Ósmio Microscopia Eletrônica Sciences19100
Anticorpo Perilipin 1Sinalização Celular9349
PPAR&gama; (81B8) anticorpoCell Signaling2443
RIPA buffer lysis Thermo Scientific89901
RosiglitazoneMerck557366
Bicarbonato de sódio SigmaS5761
Microscopia Eletrônicade Cacpdilato de SódioSciences 12300
Dodecyl Sulfato de Sódio BioRad1610301
T3SigmaT6397
Talos F200C G2Thermo Scientific
TEMED BioRad1610800
TOM20 anticorpoSinalização Celular42406
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Sinalização Celular12498
Triton X-100 Sigma93443
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco25200056
Tween 20, Grau de Biologia MolecularPromega Anticorpo H5152
UCP1Sinalização Celular14670
Ultracut RLeica 
Ciências de Microscopia Eletrônicade Acetato de Uranila22400
Westar Sun CyanagenXLS063
Westar Supernova CyanagenXLS3
152400622082915295521064041000

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
  2. Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 320 (3), 488-495 (2021).
  3. Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Frontiers in Bioscience. 16, 1233-1260 (2011).
  4. Rosenwald, M., Wolfrum, C. The origin and definition of brite versus white and classical brown adipocytes. Adipocyte. 3 (1), 4-9 (2014).
  5. Smorlesi, A., Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. The adipose organ: White-brown adipocyte plasticity and metabolic inflammation. Obesity Reviews. 13, Suppl 2 83-96 (2012).
  6. Townsend, K., Tseng, Y. -H. Brown adipose tissue: Recent insights into development, metabolic function and therapeutic potential. Adipocyte. 1 (1), 13-24 (2012).
  7. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  8. Benador, I. Y., Veliova, M., Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization. Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).
  9. Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance. Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).
  10. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  11. Klein, J., et al. Beta(3)-adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced glucose uptake in brown adipocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (3), 34795-34802 (1999).
  12. Gaom, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
  13. Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes. Bio-protocol. 11 (24), 4265(2021).
  14. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).
  15. Tapia, P. J., et al. Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology. Metabolism. 111, 154341(2020).
  16. González-Hódar, L., et al. Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167(2021).
  17. Fernández-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cortés, V. A. AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism. Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).
  18. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  20. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  21. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  22. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  23. Ambele, M. A., Dhanraj, P., Giles, R., Pepper, M. S. Adipogenesis: A complex interplay of multiple molecular determinants and pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4283(2020).
  24. Lefterova, M. I., et al. PPARγ and C/EBP factors orchestrate adipocyte biology via adjacent binding on a genome-wide scale. Genes & Development. 22 (21), 2941-2952 (2008).
  25. Ntambi, J. M., Young-Cheul, K. Adipocyte differentiation and gene expression. The Journal of Nutrition. 130 (12), (2000).
  26. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16, 83(2017).
  27. Christiaens, V., Van Hul, M., Lijnen, H. R., Scroyen, I. CD36 promotes adipocyte differentiation and adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1820 (7), 949-956 (2012).
  28. Carobbio, S., Rosen, B., Vidal-Puig, A. Adipogenesis: New insights into brown adipose tissue differentiation. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (3), 75-85 (2013).
  29. Ricquier, D. Uncoupling protein 1 of brown adipocytes, the only uncoupler: A historical perspective. Frontiers in Endocrinology. 2, 85-91 (2011).
  30. Cui, L., Mirza, A. H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation. Protein & Cell. 10 (12), 921-926 (2019).
  31. Hao, L., et al. Indomethacin enhances brown fat activity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).
  32. Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. A. Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma are activated by indomethacin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3406-3410 (1997).
  33. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  34. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1281-1289 (2004).
  35. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  36. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).
  37. Merlin, J., et al. Rosiglitazone and a β3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture. Frontiers in Endocrinology. 9, 249(2018).
  38. Fayyad, A. M., et al. Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).
  39. Zennaro, M. -C., et al. Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action. The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).
  40. Klaus, S., et al. Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression. Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).
  41. Guennoun, A., et al. Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype. Journal of Translational Medicine. 13, 135(2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Tecido Adiposo MarromDiferencia o de Adip citosImunofluoresc ncia ConfocalMicroscopia Eletr nica de Transmiss oFun o MitocondrialExpress o de UCP1Got culas Lip dicas

Artigos relacionados