Estabelecimento e Caracterização de Modelos de Xenoenxerto Derivado de Pacientes de Carcinoma Anaplásico de Tireoide e Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço

O modelo PDX é um modelo animal no qual o tecido tumoral humano é transplantado em camundongos imunodeficientes e cresce no ambiente fornecido pelos camundongos¹. Os modelos tradicionais de linhagens celulares tumorais sofrem de várias desvantagens, como a falta de heterogeneidade, a incapacidade de reter o microambiente tumoral, a vulnerabilidade a variações genéticas durante repetidas passagens in vitro e a pobre aplicação^clínica2,3. As principais desvantagens dos modelos animais geneticamente modificados são a perda potencial das características genômicas dos tumores humanos, a introdução de novas mutações desconhecidas e a dificuldade em identificar o grau de homologia entre tumores de camundongos e tumores^humanos4. Além disso, a preparação de modelos animais geneticamente modificados é cara, demorada e relativamente ineficiente⁴.

O modelo PDX tem muitas vantagens sobre outros modelos tumorais em termos de refletir a heterogeneidade tumoral. Do ponto de vista histopatológico, embora a contraparte do camundongo substitua o estroma humano ao longo do tempo, o modelo PDX preserva bem a estrutura morfológica do tumor primário. Além disso, o modelo PDX conserva a identidade metabolômica do tumor primário por pelo menos quatro gerações e reflete melhor as complexas inter-relações entre as células tumorais e seu microambiente, tornando-o único na simulação do crescimento, metástase, angiogênese e imunossupressão do tecido tumoral^humano5,6,7. Em nível celular e molecular, o modelo PDX reflete com precisão a heterogeneidade inter e intratumoral de tumores humanos, bem como as características fenotípicas e moleculares do câncer original, incluindo padrões de expressão gênica, status de mutação, número de cópias, metilação e proteômica do DNA ^8,9. Modelos PDX com passagens diferentes têm a mesma sensibilidade à terapia medicamentosa, indicando que a expressão gênica de modelos PDX é altamente estável^10,11. Estudos têm demonstrado excelente correlação entre a resposta do modelo PDX a um fármaco e as respostas clínicas dos pacientes a esse fármaco^12,13. Portanto, o modelo PDX emergiu como um poderoso modelo de pesquisa pré-clínica e translacional, particularmente para triagem de drogas e predição de prognóstico clínico.

O câncer de tireoide é um tumor maligno comum do sistema endócrino e é uma neoplasia maligna humana que tem mostrado um rápido aumento na incidência nos últimos^anos14. O carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) é o câncer mais maligno da tireoide, com sobrevida mediana de apenas 4,8^meses15. Embora apenas uma minoria dos pacientes com câncer de tireoide seja diagnosticada com ATC a cada ano na China, a taxa de mortalidade é próxima de 100%^16,17,18. A ATC geralmente cresce rapidamente e invade os tecidos adjacentes do pescoço, bem como os linfonodos cervicais, e cerca de metade dos pacientes apresenta metástases à^{distância19,20}. O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é o sexto câncer mais comum no mundo e uma das principais causas de morte por câncer, estimando-se que 600.000 pessoas sofram de CEC de cabeça e pescoço a cada ano^21,22,23. O CEC de cabeça e pescoço inclui um grande número de tumores, incluindo nariz, seios da face, boca, amígdalas, faringe e laringe²⁴. ATC e CEC de cabeça e pescoço são duas das principais neoplasias malignas de cabeça e pescoço. Para facilitar o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e tratamentos personalizados, é necessário desenvolver modelos animais pré-clínicos robustos e avançados, como os modelos PDX de ATC e HNSCC.

Este artigo apresenta métodos detalhados para estabelecer o modelo PDX subcutâneo de ATC e CEC de cabeça e pescoço, analisa os principais fatores que afetam a taxa de tomada tumoral na construção do modelo e compara as características histopatológicas entre o modelo PDX e o tumor primário. Enquanto isso, neste trabalho, testes farmacodinâmicos in vivo foram realizados utilizando os modelos PDX construídos com sucesso para validar sua relevância clínica.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do West China Hospital, Sichuan University. Camundongos imunodeficientes NOD-SCID com idade entre 4-6 semanas de idade (de ambos os sexos) e camundongos fêmeas Balb/c nude com idade entre 4-6 semanas foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). O comitê de ética do West China Hospital autorizou o estudo com seres humanos (protocolo número 2020353). Cada paciente assinou o termo de consentimento livre e esclarecido.

1. Preparação experimental

1. Arrume lâminas descartáveis, tesouras e pinças esterilizadas e outros instrumentos necessários para o transplante de tumor, coloque-os na bancada ultralimpa e irradie-os com luz ultravioleta com antecedência.
2. Preparar soro fisiológico estéril e placas de Petri para uso durante o teste.

2. Aquisição e transporte de tecido tumoral fresco

1. Obter amostras tumorais frescas (geralmente maiores que 5 mm x 5 mm de tamanho) da sala de cirurgia e colocá-las em um tubo centrífugo de 15 mL ou 50 mL contendo solução HTK estéril (ver Tabela de Materiais) ou soro fisiológico. Rotule os tubos de centrífuga.
   OBS: Amostras tumorais frescas foram obtidas por remoção cirúrgica ou punção de pacientes com CTA ou CEC de cabeça e pescoço.
2. Coloque os tubos da centrífuga em uma caixa de gelo preparada com antecedência.
   NOTA: Durante este tempo, o operador de transplante deve preparar os itens necessários para o transplante (ver Tabela de Materiais).
3. Certifique-se de que o tempo entre a coleta da amostra e o transporte para o laboratório para a construção do PDX não exceda 2 h. Durante o transporte, envolva os tubos que contêm os tecidos com uma mistura de água gelada ou bolsas de gelo para preservar a atividade do tecido.

3. Transplante de tumor

1. Assim que os tecidos tumorais chegarem ao laboratório, registre-os e renumere-os.
   OBS: Para o presente estudo, as informações dos pacientes foram mantidas em absoluto sigilo. As demais etapas do procedimento foram realizadas em laboratório de nível de biossegurança 2 (BSL-2). Ao entrar no laboratório, recomenda-se o uso de um smock sobre a roupa de trabalho ou de proteção, um chapéu e uma máscara. O tratamento do tecido tumoral é realizado em um gabinete de biossegurança.
2. Desinfetar os tubos de centrífuga contendo os tecidos tumorais com álcool 75% e colocá-los na mesa de operação. Transfira os tecidos tumorais para placas de Petri de 6 cm preenchidas com soro fisiológico utilizando pinça oftálmica esterilizada. Em seguida, corte-os em pequenos pedaços de cerca de 2 mm x 2 mm e 3 mm x 3 mm usando uma lâmina.
3. Transfira os pedaços de tecidos tumorais para uma placa de Petri de 6 cm contendo a quantidade adequada de soro fisiológico, envolva a placa com o filme selante, coloque-a em uma caixa de gelo e leve-a para a sala de animais específica livre de patógenos (FPS) juntamente com os instrumentos necessários (uma tesoura, pinça e agulhas de inoculação).
4. Prepare o animal seguindo os passos abaixo.
   1. Remova os pelos no tórax lateral direito de camundongos imunodeficientes NOD-SCID fêmeas ou machos de 4-6 semanas de idade e desinfete a pele com álcool a 75%. Anestesiar os ratos através de uma injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de quetamina e 10 mg/kg de xilazina (ver Tabela de Materiais) e manchar os olhos com pomada veterinária para evitar o ressecamento. Confirme a profundidade da anestesia através da perda do reflexo pedal.
   2. Faça uma incisão de 2 mm com tesoura através da pele no meio do tórax lateral direito de camundongos.
5. Pegue um pedaço de tumor da placa de Petri e coloque-o na agulha do trocarte de 2,4 mm x 2,0 mm (ver Tabela de Materiais) com pinças.
6. Segure o rato, aperte a pele no local da punção, use o trocarte contendo as peças do tumor para inserir o tumor através da incisão inicial de 2 mm na pele, mova-se para a parte de trás do ombro e empurre o núcleo do trocarte.
7. Certifique-se de que o pedaço do tumor seja empurrado para fora e seja deixado no seio transicional formado pela punção do trocarte e, em seguida, puxe o trocarte.
8. Se o tumor se mover com a agulha quando for retirado, use o trocarte para resetá-lo e suturar a incisão.
   OBS: Neste estudo, cada camundongo foi inoculado nos membros dorsais anteriores e posteriores. Um a três camundongos foram inoculados por amostra tumoral de cada paciente com base no tamanho do tumor.

4. Preservação, fixação e congelamento de tecidos tumorais

OBS: Os demais tecidos tumorais foram utilizados para preservação, fixação e congelamento de DNA/RNA/proteínas, respectivamente.

1. Remova o soro fisiológico da superfície do tumor com uma gaze estéril antes de colocá-lo no tubo de criopreservação para garantir que a superfície do tumor não esteja excessivamente úmida.
2. Colocar quatro a seis pedaços de tecido tumoral de 2 mm x 2 mm em um tubo de criopreservação de células de 2 mL, adicionar 1 mL de solução de criopreservação composta de soro fetal bovino (FBS) a 90% e dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% no tubo, colocar o tubo em uma caixa de resfriamento gradiente, congelá-lo a -80 °C durante a noite e, finalmente, transferi-lo para nitrogênio líquido.
3. Colocar os blocos de tecido tumoral de 3 mm x 3 mm em formalina tamponada a 10% para fixação do tecido para exame anatomopatológico.
4. Coloque o bloco de tecido de 3 mm x 3 mm em um tubo de criopreservação de células de 2 mL, congele-o rapidamente em nitrogênio líquido e, em seguida, transfira para um refrigerador de -80 °C para extração de DNA/RNA e proteína.
5. Coletar as informações clínicas dos pacientes, como história tabágica, tamanho do tumor, diferenciação, subtipo patológico, grau de câncer, estádio do câncer, metástase à distância, origem, história clínica, imunohistoquímica, infecção pelo papilomavírus humano (HPV) em pacientes com CEC de cabeça e pescoço e medicação de tratamento.

5. Passaging, criopreserva e ressuscitação de tumores modelo PDX

1. Medir o comprimento e a largura dos tumores subcutâneos em camundongos usando paquímetro vernier uma vez por semana e calcular o volume tumoral de acordo com a fórmula: volume tumoral = 0,5 × comprimento × largura². Desenhar a curva de crescimento do tumor.
2. Quando o tumor PDX atingir 2.000 mm³, passe-o para a próxima geração de camundongos e realize o retransplante do tumor. Realizar a preparação dos instrumentos seguindo o passo 4.
3. Eutanásia dos camundongos por deslocamento cervical após anestesia com 80 mg/kg de cetamina.
4. Desinfetar a pele com álcool a 75%. Em seguida, corte a pele ao redor do tumor usando uma tesoura, depois remova o tumor com pinça e coloque-o em uma placa de Petri.
5. Realizar o procedimento de transplante de tumor seguindo o passo 3.
6. Realizar a preservação e criopreservação dos tumores modelo PDX seguindo o passo 4.
7. Para a ressuscitação do tecido tumoral, siga o princípio de congelamento lento e dissolução rápida. Depois de retirar os crióvios do azoto líquido, coloque-os rapidamente num banho-maria a 37 °C para uma rápida dissolução.
8. Agite suavemente os crióvios em banho-maria para acelerar o processo de descongelamento.
9. Descongelar, transferir os pedaços do tumor para o soro fisiológico preparado para lavagem e, em seguida, inocular a próxima geração de camundongos. Para a operação específica, consulte o procedimento de transplante de tecido na etapa 3.

6. Determinação da eficácia terapêutica do lenvatinibe e da cisplatina no modelo ATC PDX

OBS: O modelo ATC PDX foi utilizado para testar o efeito terapêutico do inibidor de tirosina quinase lenvatinibe e do quimioterápico cisplatina^25,26,27.

1. Selecionar o tecido tumoral da geração P5 de um modelo ATC PDX (THY-017), cortar em pedaços de tecido de 2-4 mm 3 e inocular subcutaneamente (passo³ ) no dorso direito de dez camundongos Balb/c nus fêmeas de 4-6 semanas.
2. Selecionar 15 camundongos com volumes tumorais entre 50-150 mm³ e dividi-los em três grupos.
3. Administrar lenvatinib (10 mg/kg) por via intragástrica a um grupo uma vez por dia durante 15 dias, administrar cisplatina (3 mg/kg) por via intraperitoneal a um grupo a cada 3 dias, num total de seis doses, e administrar o grupo controlo com o mesmo volume de solução salina normal.
4. Medir o peso corporal e o volume tumoral dos ratos duas vezes por semana.
5. No final do teste, eutanasiar os camundongos (etapa 5.3) e pesar os tumores.

Um total de 18 espécimes de câncer de tireoide foram transplantados, e cinco modelos PDX de câncer de tireoide foram construídos com sucesso (taxa de tomada tumoral de 27,8%), incluindo quatro casos de câncer indiferenciado de tireoide e um caso de câncer anaplásico de tireoide. A correlação entre a taxa de sucesso de construção do modelo e a idade, sexo, diâmetro do tumor, grau e diferenciação tumoral foram analisadas. Embora a taxa de sucesso do modelo de amostras tumorais de grau 4 tenha sido maior do que a de amostras com graus mais baixos, e a taxa de sucesso de amostras tumorais indiferenciadas também tenha sido maior do que a de amostras altamente diferenciadas, os resultados da análise de correlação mostraram que esses fatores não foram associados com a taxa de sucesso do modelo PDX (Tabela 1). Dezessete amostras de CEC de cabeça e pescoço foram inoculadas e quatro modelos PDX de CECP foram construídos com sucesso. A análise de correlação entre a taxa de tomada do tumor na construção do modelo e os parâmetros clínicos das amostras tumorais demonstrou que o grau de diferenciação foi associado com a taxa de sucesso do modelo, enquanto idade, sexo, história tabágica, diâmetro do tumor, grau de câncer, metástase e infecção pelo HPV não afetaram a taxa de tomada do tumor (Tabela 2).

As curvas de crescimento tumoral para cada modelo PDX foram construídas para melhor compreensão das taxas de crescimento dos modelos PDX de diferentes pacientes (Figura 1, Figura 2 e Tabela 3). Os ciclos tumorigênicos médios (tempo desde a inoculação até o tamanho do tumor de 1.000 mm3) de THY-004 das gerações P0 a P5 foram de 68 dias, 87 dias, 29 dias, 34 dias, 28 dias e 26 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios do THY-012 das gerações P0 a P5 foram de 119 dias, 61 dias, 66 dias, 55 dias, 87 dias e 116 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios de THY-017 das gerações P0 a P5 foram de 27 dias, 17 dias, 30 dias, 13 dias, 22 dias e 15 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios de THY-018 das gerações P0 a P3 foram de 134 dias, 70 dias, 48 dias e 48 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios do THY-021 das gerações P0 a P3 foram de 53 dias, 66 dias, 35 dias e 49 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios da OTO-017 das gerações P0 a P4 foram de 118 dias, 86 dias, 67 dias, 129 dias e 88 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios da OTO-022 das gerações P0 a P5 foram de 155 dias, 55 dias, 32 dias, 37 dias, 27 dias e 46 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios da OTO-030 das gerações P0 a P2 foram de 133 dias, 93 dias e 104 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios do OTO-031 das gerações P0 a P5 foram de 144 dias, 58 dias, 33 dias, 34 dias, 52 dias e 50 dias, respectivamente. As amostras de ATC foram passadas de forma estável para a geração P3 e mais tarde, enquanto dois casos de amostras de CEC de cabeça e pescoço não conseguiram formar tumores após passarem para a geração P1. As taxas de crescimento de algumas amostras foram relativamente lentas na geração P0, mas suas taxas de crescimento foram aceleradas após a passagem para a geração P1 e gerações posteriores. As características histopatológicas dos tumores dos pacientes com as de diferentes gerações de modelos PDX foram comparadas. Os resultados mostraram que os tumores PDX e os tumores primários derivados de pacientes eram morfologicamente quase semelhantes (Figura 3), com pequenas diferenças que podem ser devidas à heterogeneidade na área de amostragem entre os pacientes e as diferentes gerações de PDX.

A eficácia antitumoral do lenvatinibe (um inibidor de tirosina quinase multialvo aprovado para o tratamento do câncer avançado de tireoide28) foi avaliada no modelo PDX de ATC. Como mostrado na Figura 4A, o tratamento com lenvatinibe inibiu significativamente o crescimento tumoral no modelo ATC PDX em comparação com o grupo controle salino normal (P < 0,05). Ao final do experimento, o tecido tumoral foi excisado e pesado para determinação do peso tumoral. Em comparação com o grupo controle, o peso tumoral do grupo de tratamento com lenvatinibe foi menor, embora não tenha sido obtida diferença estatística (Figura 4B). Além disso, não foram observadas alterações óbvias no estado geral e no peso corporal nos ratinhos tratados com lenvatinib (Figura 4C). Devido à excessiva frequência de administração de cisplatina durante os experimentos, os camundongos apresentaram toxicidade significativa, manifestada por perda de peso e até morte. A eficácia antitumoral da cisplatina é demonstrada na Figura 1 Suplementar.

Figura 1: Curva de crescimento tumoral dos modelos ATC PDX de diferentes pacientes. Cada cor representa a geração especificada, e cada curva representa um único tumor. Um a três camundongos foram inoculados na passagem 0 (P0) da geração, e cinco camundongos foram inoculados nas passagens subsequentes (P1-P5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Curva de crescimento tumoral dos modelos de CEC de cabeça e pescoço PDX de diferentes pacientes. Cada cor representa a geração especificada, e cada curva representa um único tumor. Um a três camundongos foram inoculados na geração P0, e cinco camundongos foram inoculados na geração P1 e gerações posteriores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Estudo histopatológico. Comparação histopatológica entre os tumores primários dos pacientes e as PDXs correspondentes (passagem 1 e passagem 3) de ATC (THY-012, THY-017) e CEC de cabeça e pescoço (OTO-017) (coloração hematoxilina-eosina, 100x). Os subtipos patológicos de THY-012 e THY-017 foram carcinoma anaplásico de tireoide, e o subtipo patológico de OTO-017 foi carcinoma de células escamosas. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Eficácia terapêutica do lenvatinibe no modelo ATC PDX. Alterações no (A) volume tumoral, (B) peso tumoral e (C) peso corporal de camundongos portadores de ATC PDX após tratamento com lenvatinibe (10 mg/kg). As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste T para comparar levatinibe com controle. *P < 0,05 versus controle foi considerado estatisticamente significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Parâmetros	Classe	Taxa de tomada tumoral (%)	P
Idade (anos)	<60	16.67 (1/6)	0.615
	≥60	33.33 (4/12)
Gênero	Macho	16.67 (1/6)	0.615
	Fêmea	33.33 (4/12)
Diâmetro do tumor	<6cm	37.50 (3/8)	0.608
	≥6cm	20.00 (2/10)
Estágio patológico do TNM	Eu	0.00 (0/1)	1
	Ш	0.00 (0/1)
		31.25 (5/16)
Diferenciação	Alto	0.00 (0/7)	0.059
	Pobre	25.00 (1/4)
	Indiferenciado	57.14 (4/7)

Tabela 1: Correlação entre a taxa de tomada tumoral do CTA e as características clínicas dos pacientes.

Parâmetros	Classe	Taxa de tomada tumoral (%)	P
HPV	Negativo	33.33 (2/6)	1
	Desconhecido ou positivo	36.36 (4/11)
Idade (anos)	<60	33.33 (3/9)	1
	≥60	37.50 (3/8)
Gênero	Macho	50.00 (5/10)	0.304
	Fêmea	14.29 (1/7)
Tabagismo	Alguma vez	44.44 (4/9)	0.62
	Nunca	25.00 (2/8)
Diâmetro do tumor	<3cm	40.00 (4/10)	1
	≥3cm	28.57 (2/7)
Estágio patológico do TNM	Eu	75.00 (3/4)	0.423
		25.00 (2/8)
	Ш	0.00 (0/1)
		33.33 (1/3)
Metástase à distância	Y	28.57 (2/7)	0.633
	N	44.44 (4/9)
Diferenciação	Alto	12.50 (1/8)	0.036*
	Moderada a alta	100.00 (2/2)
	Moderado	0.00 (0/2)
	Moderado a ruim	66.67 (2/3)
* P < 0,05

Tabela 2: Correlação entre a taxa de tomada tumoral de CEC de cabeça e pescoço e as características clínicas dos pacientes. *P < 0,05.

Tabela 3: Ciclo tumorigênico médio (tempo desde a inoculação até o tamanho do tumor de 1.000 mm3) dos modelos ATC e CEC de cabeça e pescoço.

Figura suplementar 1: Eficácia terapêutica da cisplatina no modelo ATC PDX. Alterações no (A) volume tumoral, (B) peso do tumor e (C) peso corporal de camundongos portadores de ATC PDX após tratamento com cisplatina (3 mg/kg). As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste T para comparar a cisplatina com o controle. *P < 0,05 versus controle foi considerado estatisticamente significativo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Não são divulgados potenciais conflitos de interesse.