Manipulação da Ingestão Rítmica de Alimentos em Camundongos Utilizando um Sistema de Alimentação Customizado

O relógio circadiano é encontrado de forma onipresente em todas as espécies e fornece um mecanismo de cronometragem que ajuda os organismos a se adaptarem ao seu ambiente em mudança rítmica. O marcapasso circadiano mestre está localizado no núcleo supraquiasmático (NSC) do hipotálamo. O SCN é primariamente arrastado pelo ciclo claro-escuro ambiental e sincroniza relógios periféricos presentes em quase todas as células do corpo por meio de múltiplas pistas, incluindo sinais neuronais e hormonais, alimentação e temperatura corporal 1,2,3,4,5,6,7,8 . Em mamíferos, o relógio circadiano molecular depende do fator de transcrição heterodimérico CLOCK: BMAL1 9,10, que controla a expressão dos genes core clock denominados Period (Per1, Per2 e Per3) e Cryptochrome (Cry1 e Cry2) para iniciar um ciclo de feedback transcricional crítico para a geração de ritmos circadianos 9,11,12 . O relógio molecular também regula a transcrição rítmica de milhares de genes que controlam a ritmicidade de praticamente todas as funções biológicas^13,14,15. Mais de 50% do genoma em mamíferos é ritmicamente expresso em pelo menos um tipo de tecido 16,17,18, e tecidos como o fígado em camundongos têm cerca de 25%-30% de seu transcriptoma expresso ritmicamente^18,19. A expressão gênica rítmica é crucial para ativar processos biológicos importantes, como o controle do ciclo^celular20, a homeostase da^glicose21 e o metabolismo de^{aminoácidos22}, na hora certa do dia, a fim de aumentar a aptidão do organismo.

Nas últimas décadas, têm sido crescentes as evidências sugerindo que a ingestão alimentar pode atuar como uma potente pista sincronizadora para estimular ritmos de expressão gênica em múltiplos tecidos, incluindo o fígado^23,24. É importante ressaltar que a alimentação tem demonstrado introduzir ritmos no fígado independentemente do NSC ou do ciclo claro-escuro²⁵, e a alimentação rítmica pode conduzir a expressão gênica rítmica sem envolver o relógio molecular 26,27,28,29,30,31. A alimentação restrita ao período inativo de camundongos (diurno) inverte a fase de expressão dos genes core clock e de muitos genes rítmicos³¹. A alimentação com restrição de tempo (TRF), que é uma intervenção nutricional em que a ingestão calórica diária é restrita a um período de 8-10 h, demonstrou proteger contra obesidade, hiperinsulinemia, esteatose hepática e síndrome metabólica^32,33. Todos os experimentos acima envolvendo manipulação da ingestão de alimentos exigem que o experimentador faça uso de métodos eficazes para entregar alimentos na hora certa do dia.

Diferentes métodos de entrega de alimentos têm sido desenvolvidos, apresentando diversas vantagens e desvantagens 29,34,35,36,37,38,39 (Tabela 1). Alguns alimentadores automatizados foram projetados para operar com base em um software que controla a quantidade, a duração e o tempo de disponibilidade de alimentos enquanto registra a alimentação e a atividade voluntária de corrida de rodas em camundongos³⁴. Alguns outros métodos envolvem camundongos sendo colocados em gaiolas diferentes para diferentes condições de alimentação, com o experimentador adicionando manualmente pastilhas de alimento no tempo pré-requisito^38,39. Outro sistema utiliza um sistema alimentador automatizado controlado por um computador onde um escudo acionado pneumático impede o acesso aos alimentos e que pode ser controlado por intervalos de tempo ou massa de alimentos³⁵. Todos esses métodos ou requerem a utilização e configuração de um software computadorizado que pode ser caro e requer algum treinamento para o funcionamento adequado do instrumento ou são trabalhosos porque o experimentador precisa estar presente em momentos específicos para alterar manualmente as condições de alimentação. Os sistemas informatizados também vêm com sua parcela de problemas, incluindo mau funcionamento de alavancas ou portas que deixam o alimento sair, pelotas de comida ficando presas nas tomadas e quebra de software. Além disso, o som que pode ser produzido durante a abertura de portas ou alavancas apresenta o risco de condicionar camundongos a associá-los à entrega de alimentos, comprometendo a interpretação dos efeitos da manipulação alimentar como sendo estritamente devido ao acesso ao alimento ou devido a efeitos sobre outros ritmos comportamentais, como o ciclo sono/vigília. O objetivo geral deste estudo foi desenvolver um sistema acessível e eficiente para manipular a ingestão de alimentos rítmicos a longo prazo que ajudasse a aliviar muitos desses problemas mencionados anteriormente. Em primeiro lugar, o aparelho de alimentação que foi desenvolvido e é descrito abaixo pode ser construído a um custo muito mínimo em comparação com as máquinas automatizadas (Tabela 2) e não requer treinamento sofisticado para manuseio, operação e manutenção. Em segundo lugar, o sistema de alimentação produz apenas um ruído branco de fundo e nenhum som alto durante a entrega de alimentos, evitando assim o condicionamento pavloviano. Em conjunto, esse sistema de alimentação é econômico, mais acessível e confiável para os pesquisadores, ao mesmo tempo em que é eficiente na manipulação da ingestão rítmica de alimentos.

Todos os animais são utilizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Texas A&M University (AUP #2022-0050). Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas entre 2-4 meses de idade são usados aqui. O procedimento para a construção do sistema de alimentação é descrito abaixo, e as matérias-primas necessárias para a construção do aparelho estão referenciadas na Tabela de Materiais.

1. Construção do sistema de alimentação

1. Construção de uma base de policloreto de vinila (PVC)
   1. Adquira quatro peças de chapas de PVC de 0,25 polegadas cortadas de acordo com as seguintes dimensões: 4,875 polegadas x 4,5 polegadas; 4,875 polegadas x 2,125 polegadas; 9,5 polegadas x 2,125 polegadas (duas peças). Faça quatro furos na base de 4,875 polegadas x 4,5 polegadas para fixar um temporizador de 24 horas usando as medidas fornecidas na Figura 1A. Cole as quatro peças de PVC para obter a base como na Figura 1A.
2. Fixação do temporizador na base de PVC
   1. Abra o temporizador para remover o plugue. Faça uma conexão usando uma extensão/cabo elétrico padrão (Figura 1B).
   2. Coloque o temporizador na base de PVC para alinhá-lo com os orifícios perfurados na base no passo 1.1.1. Use parafusos de 1,5 polegadas para fixar o temporizador na base de PVC. Certifique-se de que o temporizador está plano e estável na base de PVC.
   3. Faça quatro furos na parte superior do temporizador e fixe parafusos de 0,75 polegadas para segurar o recipiente de alimentos de oito compartimentos (Figura 1B). A base do sistema está completa e se parece com a Figura 1C.
      CUIDADO: Não faça furos em todo o temporizador.
3. Configuração da gaiola
   1. Corte um tubo de PVC de 4 polegadas (diâmetro externo de 4,5 polegadas) a uma altura de 3,125 polegadas. Faça um furo de cerca de 0,5 polegada na parte inferior do tubo para deixar o cabo elétrico passar.
   2. Lixe a parte superior do tubo (por exemplo, com um roteador ou uma ferramenta giratória) para permitir que a tampa seja removida facilmente ao trocar o recipiente de alimentos.
   3. Use uma gaiola de mouse com largura maior que 4,5 polegadas e corte um furo de 4,5 polegadas no fundo da gaiola usando uma serra de furo.
      NOTA: A localização do orifício depende da configuração da gaiola (por exemplo, localização do topo da gaiola e da garrafa de água, adição de uma roda de corrida, etc.).
4. Configuração do recipiente de alimentação
   1. Faça um dispensador de alimentos com um organizador de joias de oito compartimentos de 4 polegadas, conforme mostrado na Figura 1D. Corte a borda do recipiente de forma que ele se encaixe bem no tubo.
   2. Use uma tampa de tubo de PVC de 4 polegadas e corte um orifício correspondente ao tamanho de um único compartimento dispensador (por exemplo, com uma ferramenta giratória) para criar uma abertura que exponha apenas um dos oito compartimentos por vez. À medida que o temporizador se move, a abertura expõe um novo compartimento a cada 3 h. Os componentes do sistema de alimentação agora estão prontos para serem usados. Uma vez que todas as gaiolas são ajustadas, o arranjo final se assemelha ao mostrado na Figura 1E.
   3. O transporte de muitos recipientes de alimentos ao mesmo tempo pode ser complicado. Para facilitar o transporte, leve três peças de cano de PVC de 0,25 polegada. Faça um furo de 0,625 polegadas no centro de duas peças e cole-as. Em seguida, use um tubo de PVC estreito de 0,625 polegadas que se encaixe no orifício e através do centro dos copos de comida para empilhar copos de alimentos para facilitar seu transporte, como mostrado na Figura 1F.
   4. Teste os temporizadores antes de introduzir os mouses conectando a configuração em tomadas elétricas, colocando um pedaço de nestlet em um compartimento em um tempo registrado e monitorando a posição do ninho 12 h depois para garantir que o temporizador gire imediatamente.

2. Aplicação do sistema de alimentação

1. Medição contínua da ingestão alimentar em camundongos
   1. Transfira os camundongos para a sala experimental e aclimate-os ao ciclo claro-escuro (LD) estabelecido na sala por pelo menos 1 semana, e por 2 semanas se o ciclo claro-escuro for deslocado por mais de 3 h. Para este experimento, são coletados dados de camundongos C57BL/6 machos e fêmeas entre 2-4 meses de idade expostos à DL 12:12 (n = 7 machos e 4 fêmeas).
   2. Registrar o peso dos camundongos antes de alojá-los individualmente nas gaiolas de alimentação (os pesos foram registrados às 15:00 horas, ou seja, no momento em que as trocas alimentares foram realizadas). Certifique-se de que os ratos têm acesso ad libitum à água e roupas de cama e ninhos suficientes.
   3. Adicione 1,5 g de alimento (usado rotineiramente 45 mg de pellets de precisão sem poeira) a todos os oito compartimentos do copo alimentador. Coloque o copo alimentador no temporizador. Em seguida, coloque a tampa no copo comedouro de forma que apenas um compartimento fique exposto e observe o horário de apresentação do alimento. Quatro compartimentos representam pontos noturnos e os outros quatro representam pontos diurnos.
      OBS: Devido ao comportamento de colecionismo observado na apresentação do excesso de alimento, 1,5 g foi otimizado como peso inicial do alimento. Os ratos tendem a acumular pellets em cima das tampas dos copos de comida ou na cama dentro da gaiola. Isso distorce os dados, levando a sua interpretação equivocada. Camundongos machos não acumulam pellets quando alimentados com 1,5 g ou menos por compartimento. As fêmeas tendem a acumular mais alimentos do que os machos, mas isso é específico do rato e pode ser atenuado se fornecer 1 g de pellet por compartimento.
   4. Troque os alimentos todos os dias no mesmo horário e conte o número de pellets restantes em cada compartimento para calcular a quantidade de alimento consumido. Monitore o perfil alimentar por uma semana para obter um perfil alimentar basal de camundongos alimentados ad libitum.
   5. Com base nos alimentos consumidos em cada compartimento, calcule o consumo alimentar médio diário de cada camundongo (Figura 2).
2. Tratamento com dieta rica em gordura (DHH)
   NOTA: Este sistema de alimentação também pode ser usado para estudar o efeito da DH em doenças metabólicas e, eventualmente, ser usado para horários de alimentação com restrição de tempo. O HFD não está disponível comercialmente como pellets precisos de tamanho e peso, e os pellets para alimentação são geralmente obtidos como pellets de 0,5 polegada.
   1. Coloque os pellets de HFD em uma superfície limpa ou filme transparente e corte-os em 6-7 pedaços menores de tamanho uniforme usando uma lâmina de barbear. Cortar os pellets suficientemente pequenos para que se assemelhem aos pellets de ração normais, tal como utilizados no ponto 2.1 acima.
      NOTA: Os ratos tendem a acumular pelotas maiores em suas gaiolas, levando a erros de cálculo dos alimentos consumidos.
   2. Pesar 1,5 g de pedaços de HFD cortados e colocar em cada um dos 8 compartimentos de alimentos. Para a troca de alimentos a cada dois dias, 1,5 g de HFD por compartimento é suficiente.
   3. Troque o alimento todos os dias ou em dias alternados de acordo com as necessidades experimentais e registre o peso do alimento que resta.
   4. Calcule a quantidade de alimento consumido subtraindo o peso restante do alimento da quantidade inicial de alimento dado. Repita esse processo por um período de 1 semana para obter uma linha de base da ingestão alimentar de DH (Figura 2).
3. Aclimatando camundongos machos a uma dieta noturna restrita (NR)
   1. Siga as etapas 2.1.1-2.1.4 para obter uma linha de base da alimentação ad libitum . Para este experimento, são coletados dados de camundongos machos C57BL/6 entre 2-4 meses de idade expostos à DL 12:12 (n = 18 machos).
   2. Após 3-7 dias de dieta ad libitum , coloque os ratos em uma dieta de transição, reduzindo gradualmente o número de pellets nos compartimentos do dia. Para fazer isso, tenha cinco pellets por compartimento no dia 1 de transição (0,225 g por compartimento), 3 pellets no dia 2 (0,135 g por compartimento), 1 pellet no dia 3 (0,045 g por compartimento) e nenhum depois disso para fazer a transição completa dos camundongos em uma dieta noturna restrita.
      NOTA: Certifique-se de que os ratos não têm restrição calórica. Calcule a média do consumo diário de alimentos de ratos por compartimento com base na linha de base ad libitum e dê-lhes a mesma quantidade de alimento, distribuindo-o apenas pelos compartimentos de quatro noites.
   3. Continue monitorando a ingestão de alimentos por 2 semanas após os camundongos terem se adaptado ao regime noturno restrito. Durante esse período, ajustar a quantidade de alimento dada a cada camundongo para melhor adequar seu consumo alimentar total (Figura 3A). Normalmente, adicione pellets de comida (1 pellet para cada um dos quatro compartimentos noturnos) quando os ratos comem todos os seus alimentos por duas noites consecutivas.
   4. Pese os ratos no final do período de 2 semanas para monitorar qualquer mudança de peso devido ao regime de alimentação. Ao final desse período, anestesiar os camundongos com isoflurano e eutanasiá-los por decapitação. Coletar tecidos e analisá-los para mudanças diárias devido ao paradigma alimentar.
4. Aclimatando camundongos machos a uma dieta arrítmica (AR)
   1. Siga as etapas 2.1.1-2.1.4 para obter uma linha de base da alimentação ad libitum . Para este experimento, são coletados dados de camundongos machos C57BL/6 entre 2-4 meses de idade expostos à DL 12:12 (n = 18 machos).
   2. Após uma semana de dieta ad libitum , calcule o consumo alimentar médio por dia e divida esse número por 8 para obter a quantidade de alimento a ser fornecida em cada compartimento. Consiga a alimentação de RA garantindo que os ratos recebam uma quantidade igual de alimento em todos os oito compartimentos ao longo do dia.
   3. Em seguida, coloque os camundongos em uma dieta de transição, reduzindo gradualmente, ao longo de 3-5 dias, a quantidade de alimento dado por compartimento para, finalmente, abolir qualquer ritmo de ingestão de alimentos (como mostrado na Figura 3B). Quando em uma dieta AR, certifique-se de que os camundongos tenham acesso a 1/8 de sua ingestão diária de alimentos em cada um dos oito compartimentos e, portanto, acesso aos alimentos a cada 3 h. Certifique-se de que os ratos não têm restrição calórica.
   4. Manter os camundongos em dieta de RA por 2 semanas ou mais (Figura 3B).
   5. Durante a dieta AR, ajuste o alimento todos os dias para garantir que os ratos deixem apenas algumas pelotas para trás (normalmente menos de 5). Isso garante que os ratos estejam recebendo a quantidade certa de alimento e não tenham restrição calórica. Faça ajustes reduzindo ou adicionando pellets em todos os oito compartimentos ou reduzindo ou adicionando pellets em dois compartimentos opostos, para não induzir nenhum ritmo de ingestão de alimentos.
      NOTA: Ratos alimentados sob uma dieta AR deixam comida quase exclusivamente entre ZT3 e ZT9 (entre 3 h e 9 h após a luz acender), mas estão com fome à noite e mordem o dispensador de alimentos para acessar o próximo compartimento. No entanto, os camundongos alimentados com RA não têm restrição calórica e, de fato, ganham mais peso do que os camundongos alimentados com NR ao longo do tempo.
   6. Pese os ratos no final do período de 2 semanas para monitorar qualquer mudança de peso devido ao regime de alimentação. Ao final desse período, anestesiar os camundongos com isoflurano e eutanasiá-los por decapitação. Coletar tecidos e analisá-los para mudanças diárias devido ao paradigma alimentar.

O sistema de alimentação descrito acima pode ser usado para manipulação a longo prazo da ingestão rítmica de alimentos em camundongos. Este sistema essencialmente expõe um novo compartimento alimentar ao rato a cada 3 h, permitindo ao investigador manipular especificamente os alimentos em cada compartimento. Uma das aplicações foi analisar o perfil de consumo alimentar no período de 24 horas. Os dados indicam que camundongos WT alimentados com ração normal ad libitum comem cerca de 75% de sua comida durante a noite (Figura 2A). Além disso, a maioria dos alimentos ingeridos durante o dia ocorre dentro das 3 h antes do apagar da luz.

Camundongos alimentados com HFD ad libitum consumiram mais alimento nos primeiros 2 dias de exposição, provavelmente devido à novidade da HFD (Figura 2A). Após 2 dias, a ingestão de DH permaneceu rítmica, porém com amplitude diminuída em relação à alimentação normal ad libitum. Enquanto machos e fêmeas de camundongos WT foram alimentados com HFD, verificou-se que camundongos fêmeas acumulavam uma grande quantidade de alimento na tampa do aparelho de alimentação e na gaiola, enquanto os machos não apresentavam nenhum colecionismo perceptível. Como mencionado acima, o açambarcamento de alimentos pode resultar em erros de cálculo do consumo de alimentos e levar a uma interpretação equivocada dos dados. Além disso, camundongos fêmeas mordiam as bordas de plástico dos copos de comida com mais frequência, especialmente nos compartimentos noturnos. Camundongos machos apresentaram ganho de peso significativo após 1 semana de ração normal ad libitum e após 1 semana de DH (Figura 2E). Uma tendência semelhante foi observada com camundongos fêmeas, mas não atingiu valores de p significativos, provavelmente devido ao menor número de fêmeas usadas em comparação com os machos.

Os camundongos que fizeram a transição para uma dieta NR ingerem suas calorias totais diárias apenas à noite, sem uma diminuição significativa na ingestão calórica nas primeiras 3-5 semanas (Figura 3A). A exposição mais prolongada ao esquema de NR diminui a ingestão calórica média diária em 10%-15% em comparação com camundongos alimentados ad libitum, como descrito em outro artigo34. Os ratos que fizeram a transição para uma dieta de RA consumiram suas calorias totais diárias em quantidades iguais ao longo do dia, levando a um amortecimento dramático do ritmo diário de ingestão alimentar (Figura 3B). Quanto ao horário alimentar do RN, a média diária de ingestão calórica não é afetada pelo horário alimentar de RA nas primeiras 3-5 semanas de exposição, mas diminui com o maior tempo de exposição. Os camundongos apresentaram ganho de peso após os esquemas de NR (Figura 3C) e RA (Figura 3C).

Figura 1: Projeto e construção do sistema do aparelho de alimentação. (A) As dimensões da base de PVC para o sistema de alimentação e a descrição de onde devem ser feitos furos para a fixação do temporizador. (B) Temporizador de 24 h antes e após reaproveitamento do fio e perfuração com parafusos para colocação do copo alimentício. (C) A base cinza montada e temporizador juntamente com um tubo de PVC de 4 polegadas. (D) O copo de alimento de oito compartimentos após o corte das bordas externas. (E) A configuração final das gaiolas com o copo de comida coberto com uma tampa de 4 polegadas de modo que apenas um compartimento seja acessível por vez. (F) O transporte de vários copos de alimentos durante um experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Perfis alimentares sob diferentes regimes alimentares . (A) Perfil alimentar de camundongos WT machos alimentados ad libitum com ração normal (NC) por 7 dias e dieta hiperlipídica (DH) por mais 7 dias. As linhas coloridas representam perfis individuais de camundongos (n = 7) e a linha preta indica a média ± MEV de sete camundongos. (B) A dieta rica em gordura antes e depois do fatiamento. (C) A média diária de consumo alimentar a cada 3 h ± EPM (n = 7). A média foi calculada nos últimos 5 dias do horário de alimentação da CP ou do DF. (D) A média (esquerda) e a porcentagem (direita) de ingestão alimentar durante o dia e a noite para camundongos alimentados com NC ou DH. Os valores representam a média de sete camundongos ± EPM e foram calculados usando os dados de consumo alimentar nos últimos 5 dias dos horários de alimentação de CN ou DHL. * p < 0,05 entre os dois grupos (teste t pareado). (E) O peso corporal médio dos camundongos utilizados no experimento após 1 semana de CN e 1 semana de DH. Os dados para homens (esquerda) e mulheres (direita) são mostrados com * p < 0,05 entre os dois grupos (teste t pareado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Manipulação do ritmo diário de ingestão alimentar. (A) Perfil alimentar de camundongos WT machos alimentados com ração normal ad libitum por 2 dias, transferidos para um regime de alimentação com restrição noturna (NR) por 3 dias e mantidos sob alimentação NR por 8 noites. As linhas coloridas representam perfis individuais de camundongos (n = 18) e a linha preta indica a média ± MEV de 18 camundongos. O asterisco cinza indica o mau funcionamento do temporizador para aquele mouse naquele único dia em que o temporizador parou de girar. (B) Perfil alimentar de camundongos WT machos alimentados com ração normal ad libitum por 2 dias, transferidos para um regime de alimentação arrítmica (AR) por 1 dia e mantidos sob alimentação AR por 8 noites. As linhas coloridas representam perfis individuais de camundongos (n = 18) e a linha preta indica a média ± MEV dos 18 camundongos. (C) O peso corporal médio dos camundongos utilizados no experimento após 2 semanas de exposição às dietas NR e AR. Os dados são apresentados com * p < 0,05 entre os dois grupos (teste t pareado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Vantagens e desvantagens dos sistemas de alimentação existentes. Uma tabela destacando os diferentes sistemas de alimentação utilizados para manipulação da ingestão alimentar, com uma breve descrição dos prós e contras de cada sistema. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Custo dos materiais necessários para a construção do sistema de alimentação. Uma tabela listando o custo dos itens necessários para a construção do sistema de alimentação descrito neste trabalho, juntamente com uma estimativa do custo de construção por gaiola. Clique aqui para baixar esta tabela.

Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.