Cultura Tridimensional de Tecido Adiposo Termogênico Vascularizado a partir de Fragmentos Microvasculares

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado delineando o uso de fragmentos microvasculares isolados de tecido adiposo humano ou de roedores como uma abordagem direta para a engenharia de tecido adiposo bege vascularizado funcional.

Resumo

A engenharia do tecido adiposo termogênico (por exemplo, tecido adiposo bege ou marrom) tem sido investigada como uma terapia potencial para doenças metabólicas ou para o design de microtecidos personalizados para triagem de saúde e testes de drogas. As estratégias atuais são frequentemente bastante complexas e falham em retratar com precisão as propriedades multicelulares e funcionais do tecido adiposo termogênico. Fragmentos microvasculares, pequenos microvasos intactos constituídos por arteríolas, vênulas e capilares isolados do tecido adiposo, servem como uma única fonte autóloga de células que permitem a vascularização e a formação de tecido adiposo. Este artigo descreve métodos para otimizar as condições de cultura para permitir a geração de tecido adiposo termogênico tridimensional, vascularizado e funcional a partir de fragmentos microvasculares, incluindo protocolos para isolamento de fragmentos microvasculares do tecido adiposo e condições de cultura. Adicionalmente, as melhores práticas são discutidas, assim como as técnicas de caracterização dos tecidos modificados, e resultados de amostras de fragmentos microvasculares de roedores e humanos são fornecidos. Essa abordagem tem potencial para ser utilizada para o entendimento e desenvolvimento de tratamentos para obesidade e doenças metabólicas.

Introdução

O objetivo deste protocolo é descrever uma abordagem para o desenvolvimento de tecido adiposo bege vascularizado a partir de uma única fonte potencialmente autóloga, o fragmento microvascular (MVF). Demonstrou-se que os tecidos adiposos marrom e bege exibem propriedades benéficas relacionadas à regulação metabólica; entretanto, o pequeno volume desses depósitos de tecido adiposo em adultos limita o potencial impacto sobre o metabolismo sistêmico, particularmente em condições de doenças como obesidade ou diabetes tipo 21,2,3,4,5,6,7.

Protocolo

Este estudo foi conduzido em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e os Regulamentos de Implementação de Bem-Estar Animal de acordo com os princípios do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas em San Antonio.

NOTA: Para as etapas descritas abaixo, são utilizados ratos Lewis machos. Pequenos ajustes no protocolo devem ser feitos para uma fêmea, bem como para a coleta de fragmento microvascular (MVF)^{de camundongo 29}. Para protocolos utilizando MVFs humanas (h-MVFs), as úni....

Resultados

Existem algumas características morfológicas fenotípicas importantes do tecido adiposo bege/marrom: é multilocular/contém pequenas gotículas lipídicas, possui um grande número de mitocôndrias (a razão de sua aparência caracteristicamente "acastanhada" in vivo), correspondentemente tem uma alta taxa de consumo de oxigênio/bioenergética mitocondrial, é altamente vascularizado, tem aumento da lipólise/captação de glicose estimulada por insulina e, mais notoriamente, expressa altos níveis de proteína desacopladora .......

Discussão

O campo da engenharia do tecido adiposo marrom/bege é em grande parte imaturo 22,23,24,25,26,27,28, com a maior parte dos modelos adiposos sendo desenvolvidos para o tecido adiposo branco ^8,22,31. M.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido aminocapróico	Sigma Aldrich	A2504-100G	Adicionado em DMEM na concentração de 1 mg/mL
Tesoura de ponta romba	Fisher scientific	12-000-172	Esterilizar em autoclave
Bovin Serum Albumina (BSA)	Millipore	126575-10GM	Diluído em PBS a 4 mg/mL e 1 mg/mL
de colagenase tipo 1	Fisher scientific	NC9633623	Diluído a 6 mg/mL em BSA 4 mg/mL, Digestão de gordura picada
Dexametasona	Thermo Scientific	AC230302500	Diluído em etanol a uma concentração de estoque de 2 mg/ml
Absorventes descartáveis	Fisher scientific	23-666-062	Para absorção de fluidos durante
a cirurgia Tesoura de dissecação	Fisher scientific	08-951-5	Esterilizar em autoclave
Dulbecco′ s Águia Modificada′ s Medium (DMEM)	Fisher scientific	11885092
Dulbecco′ s Águia Modificada′ s Mistura Média/Nutriente F-12 Ham (DMEM/F12)	Sigma Aldrich	D8062
Soro Fetal Bovino	Fisher scientific	16140089	Adicionado em DMEM a 20% v/v.
Fibrinogênio	Sigma Aldrich	F8630-25G	Solubilizado em DMEM na concentração de 20 mg/mL, Proteína encontrada no plasma sanguíneo e principal componente do hidrogel
Frasco, 250 mL	Fisher scientific	FB500250	Permite a digestão da gordura usando uma grande área de superfície
Fórceps	Fisher scientific	50-264-21	Esterilizar em autoclave, Para manuseio de tecidos e filtros
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	Diluído em etanol a uma concentração de estoque de 10 mM
MVF humano	Advanced Solutions Life Scienes, LLC	https://www.advancedsolutions.com/microvessels	MVFs humanos (hMVFs) isolados de três pacientes diferentes (mulheres de 52, 54 e 56 anos) foram usados no estudo atual.
Indometacina	Sigma Aldrich	I7378	Diluído em etanol a uma concentração estoque de 12,5 mM
Insulina do pâncreas suíno	Sigma Aldrich	I5523	Diluído em HCl 0,01 N a uma concentração estoque de 5 mg/ml
MycoZap	Fisher scientific	NC9023832	Adicionado em DMEM a 0,2% p/v, Mycoplasma Prophylactic;
Pennycilin/Streptomycin (10.000 U/mL)	15140122 científica de Fisher		Adicionado em DMEM a 1% v/v.
Placas de Petri, poliestireno (100 mm x 15 mm).	Fisher scientific	351029	3 para remoção de vasos sanguíneos e picagem, 8 (tampa) para pré-imersão de telas e 8 (prato) para uso ao filtrar com 500 ou 37 µ M peneiras
de placas de Petri, poliestireno (35 mm x 10 mm).	Fisher scientific	50-202-036	Para contagem de fragmentos
Tampão fosfato salino (PBS)	Fisher scientific	14-190-250	Diluído a 1x com água deionizada estéril.
Aparadores de Rato (Aparador de Animais de Estimação Mini Arco Andwin)	Fisher scientific	NC0854141
Rosiglitazone	Fisher scientific	R0106200MG	Diluído em DMSO a uma concentração de estoque de 10 mM
Tesoura	Ferramentas de Ciência Fina	14059-11	1 para incisão inicial, 1 para incisão epididimal, 1 para recorte de ponta
Tela  37 µ M	Carolina Biological Supply Company	652222R	Cortado em quadrados arredondados de 3" e esterilizado em óxido de etileno, aprisionamento de fragmentos e remoção de fragmentos muito pequenos/células únicas e detritos
Tela 500 µ M	Carolina Biological Supply Company	652222F	Cortado em quadrados arredondados de 3" e esterilizado em óxido de etileno, Remove fragmentos/detritos
maiores Hemostat serrilhado	Fisher scientific	12-000-171	Esterilizar em autoclave, Para fixação da pele antes da incisão
Filtro Steriflip 0.22 μ m	Millipore	SE1M179M6
Trombina	Fisher scientific	6051601KU	Diluído em água deionzada a 10 U/mL, Usado como agente de coagulação transformando fibrinogênio em fibrina
Hormônio tireoidiano (T3)	Sigma Aldrich	T2877	Diluído em 1N NaOH a uma concentração estoque de 0,02 mM
Ratos diabéticos gordurosos (ZDF) - obesos (FA/FA) ou magros (FA/+) masculinos	Charles River	https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611	Obtido de Charles River (Wilmington, MA). Os ratos foram adquiridos com 4 semanas de idade e alimentados com Purina 5008 até a eutanásia (15-19 semanas de idade). Os níveis de glicose (sangue da veia safena lateral) foram superiores a 300 mg/dL em todos os ratos FA/FA utilizados no estudo. Todos os animais foram alojados em ambiente com temperatura controlada com ciclo claro-escuro de 12 h e alimentados ad libitum.