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Artigo de método

Cultura Tridimensional de Tecido Adiposo Termogênico Vascularizado a partir de Fragmentos Microvasculares

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DOI:

10.3791/64650

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3 de fevereiro de 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering, University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine, University of Texas at San Antonio

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado delineando o uso de fragmentos microvasculares isolados de tecido adiposo humano ou de roedores como uma abordagem direta para a engenharia de tecido adiposo bege vascularizado funcional.

Resumo

A engenharia do tecido adiposo termogênico (por exemplo, tecido adiposo bege ou marrom) tem sido investigada como uma terapia potencial para doenças metabólicas ou para o design de microtecidos personalizados para triagem de saúde e testes de drogas. As estratégias atuais são frequentemente bastante complexas e falham em retratar com precisão as propriedades multicelulares e funcionais do tecido adiposo termogênico. Fragmentos microvasculares, pequenos microvasos intactos constituídos por arteríolas, vênulas e capilares isolados do tecido adiposo, servem como uma única fonte autóloga de células que permitem a vascularização e a formação de tecido adiposo. Este artigo descreve métodos para otimizar as condições de cultura para permitir a geração de tecido adiposo termogênico tridimensional, vascularizado e funcional a partir de fragmentos microvasculares, incluindo protocolos para isolamento de fragmentos microvasculares do tecido adiposo e condições de cultura. Adicionalmente, as melhores práticas são discutidas, assim como as técnicas de caracterização dos tecidos modificados, e resultados de amostras de fragmentos microvasculares de roedores e humanos são fornecidos. Essa abordagem tem potencial para ser utilizada para o entendimento e desenvolvimento de tratamentos para obesidade e doenças metabólicas.

Introdução

O objetivo deste protocolo é descrever uma abordagem para o desenvolvimento de tecido adiposo bege vascularizado a partir de uma única fonte potencialmente autóloga, o fragmento microvascular (MVF). Demonstrou-se que os tecidos adiposos marrom e bege exibem propriedades benéficas relacionadas à regulação metabólica; entretanto, o pequeno volume desses depósitos de tecido adiposo em adultos limita o potencial impacto sobre o metabolismo sistêmico, particularmente em condições de doenças como obesidade ou diabetes tipo 21,2,3,4,5,6,7. Há significativo interesse na gordura marrom/bege como alvo terapêutico para a prevenção dos efeitos metabólicos deletérios associados à obesidade e suas comorbidades 8,9,10,11,12.

As FVM são estruturas vasculares que podem ser isoladas diretamente do tecido adiposo, cultivadas e mantidas em uma configuração tridimensional por longos períodos de tempo13,14,15. Trabalhos anteriores de nosso grupo, entre outros, começaram a explorar a capacidade multicelular e multipotente das MVFs, especificamente no que se refere à formação de tecido adiposo16,17,18. Como um acúmulo deste trabalho, demonstramos recentemente que MVFs derivados de modelos de roedores com diabetes tipo 2 esaudáveis19 e de indivíduos humanos (adultos com mais de 50 anos de idade)20 continham células capazes de serem induzidas a formar tecido adiposo termogênico, ou bege.

Trata-se de uma abordagem inovadora a partir da qual se utiliza uma única fonte de FMV, capaz não só de criar tecido adiposo bege, mas também de seu componente vascular associado e crítico21. O uso dessa técnica pode ser de grande valia para estudos que buscam uma abordagem simples de engenharia tecidual para a formação de tecido adiposo termogênico. Ao contrário de outros métodos que aspiram a manipular tecido adiposo bege 22,23,24,25,26,27,28, o processo descrito neste estudo não requer o uso de múltiplos tipos celulares ou regimes complexos de indução. Modelos vascularizados de gordura bege e branca podem ser criados com MVFs provenientes de fontes de roedores e humanos, demonstrando grande potencial de tradução. O produto final deste protocolo é um tecido adiposo termogênico bege projetado com uma estrutura e função metabólica comparáveis ao tecido adiposo marrom. De modo geral, este protocolo apresenta a ideia de que uma FMVM de fonte facilmente acessível e possivelmente autóloga pode ser uma intervenção terapêutica e uma ferramenta valiosa para o estudo de distúrbios metabólicos.

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Protocolo

Este estudo foi conduzido em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e os Regulamentos de Implementação de Bem-Estar Animal de acordo com os princípios do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas em San Antonio.

NOTA: Para as etapas descritas abaixo, são utilizados ratos Lewis machos. Pequenos ajustes no protocolo devem ser feitos para uma fêmea, bem como para a coleta de fragmento microvascular (MVF)de camundongo 29. Para protocolos utilizando MVFs humanas (h-MVFs), as únicas etapas necessárias são a ressuspensão das h-MVFs seguindo o protocolo do fabricante, preparo do meio de crescimento (1,3), formação de hidrogéis de fibrina (5) e cultura (6). Para obter uma visão geral do protocolo, consulte a Figura 1.

diagrama de formação de MVF; preparação de reagentes, isolamento de gordura, hidrogéis de fibrina, processo de cultura de MVF.
Figura 1: Delineamento experimental. Detalhamento de seis etapas fundamentais, antes da análise, para a formação de tecido adiposo termogênico utilizando FMV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação dos reagentes

NOTA: Os reagentes abaixo correspondem a um rato, pesado e feito dentro de uma biocapuz.

  1. Preparar albumina de soro bovino (BSA) em PBS.
    1. Preparar 10 mg/mL (1,0%) de BSA em PBS para ser diluído para as etapas de lavagem (1 mg/mL, 0,1%) e digestão (4 mg/mL, 0,4%).
    2. Preparar diferentes concentrações de BSA, conforme mencionado na etapa 1.1.1, seguindo as etapas 1.1.3-1.1.5.
    3. 10 mg/mL de BSA em PBS (1% de BSA em PBS)
      1. Adicionar 500 mg de BSA e 500 mL de PBS a um tubo cônico de 50 mL e vórtice a solução para dissolver a BSA.
      2. Se se formarem bolhas excessivas, centrifugar a solução a 350 x g durante 2 minutos. Filtrar esterilizar a solução com um filtro líquido de nylon de 0,22 μm.
    4. 1 mg/mL de BSA em PBS (0,1% de BSA em PBS)
      1. Diluir 15 ml de 10 mg/ml de BSA em PBS 1:10 com PBS adicionando 15 ml de 10 mg/ml de BSA em PBS a 135 ml de PBS num frasco estéril de 500 ml e agitar suavemente o frasco para garantir uma mistura homogénea.
    5. 4 mg/mL de BSA em PBS (0,4% de BSA em PBS)
      1. Diluir 35 mL de 10 mg/mL de BSA em PBS 1:2.5 com PBS adicionando 35 mL de 10 mg/mL de BSA em PBS + 57,5 mL de PBS em um frasco estéril de 100 mL e agitar suavemente o frasco para garantir uma mistura homogênea.
  2. Preparar colagenase em BSA para a digestão de almofadas de gordura picadas.
    1. Preparar 6 mg/mL de colagenase.
      1. Em um tubo cônico de 50 mL, pesar 72 mg de colagenase (rótulo "para Epi").
      2. Em três tubos cônicos de 50 mL, pesar 144 mg de colagenase (rótulo "para Ing 1", "para Ing 2" e "para SubQ") cada.
      3. Conservar a colagenase pesada a 4 °C até à utilização.
        NOTA: Não adicione BSA/PBS até antes da digestão.
      4. Adicionar 12 mL de 4 mg/mL de BSA em PBS ao tubo contendo 72 mg de colagenase.
      5. Adicionar 24 mL de 4 mg/mL de BSA em PBS aos tubos contendo 144 mg de colagenase.
      6. Agitar os tubos para garantir uma solução homogénea e filtrar esterilizar a solução com um filtro de rede de nylon de 0,22 μm.
  3. Preparar meios de crescimento suplementados com Ácido Aminocapróico (ACA) para alimentar/diferenciar a MFM isolada.
    1. Meio de crescimento (GM): Suplemento DMEM com SFB a 20%, penicilina-estreptomicina a 1% (caneta estreptogênica), profilático a 0,2% de micoplasma e ac-ACL 1 mg/mL.
    2. Preparar meio adipogênico branco (WAM).
      1. Indução de WAM: Suplemento DMEM/F12 com 20% de SFB, 1% de radiografia por caneta, 0,2% profilático de micoplasma, 10 μg/mL de insulina, 10 μm de forskolina, 1 μm de dexametasona e 1 mg/mL de ACA.
        NOTA: Para h-MVFs, além disso, adicione 125 μM de indometacina.
      2. Manutenção da WAM: Suplemento DMEM/F12 com SFB a 20%, caneta estreptogênica a 1%, profilática a 0,2% de micoplasma, insulina a 5 μg/mL e ac-ACA a 1 mg/mL.
        NOTA: Para h-MVFs, altere a concentração de insulina para 10 μg/mL.
    3. Preparar meio adipogênico bege (MAB).
      1. Indução de MAB: Suplemento DMEM/F12 com SFB a 20%, estreptococo a 1%, profilático a 0,2% de micoplasma, 10 μg/mL de insulina, 10 μm de forskolina, 1 μm de dexametasona, 1 μm de rosiglitazona, 20 nM de 3,3′,5-Triiodo-L-tironina (T3) e 1 mg/mL de AAC.
        NOTA: Para h-MVFs, altere a concentração de T3 para 120 nM.
      2. Manutenção da MAS: Suplemento DMEM/F12 com 20% de SFB, 1% de estreptococo, 0,2% profilático de micoplasma, 5 μg/ml de insulina, 10 μm de forskolina, 1 μm de rosiglitazona, 20 nM de T3 e 1 mg/mL de ACA.
        NOTA: Para h-MVFs, alterar a concentração de insulina para 10 μg/mL e a concentração de T3 para 120 nM.
  4. Preparar trombina (só precisa ser feita se a solução alíquota de estoque não estiver disponível) para fazer o agente de coagulação a ser usado em géis de fibrina.
    1. 10 U/mL de trombina em ddH2O:
      1. Ressuspenda o pó de trombina usando 1-5 mL de ddH2O no frasco para injetáveis do fabricante e transfira a ressuspensão para um copo de 250 mL.
      2. Leve a solução para 100 mL e pipete a solução para cima e para baixo várias vezes para garantir uma mistura homogênea. Aliquot a solução em tubos cônicos de 15 mL (~10 mL/tubo) e armazenar as alíquotas em um freezer de -20 °C.
        NOTA: Para usar, descongelar a trombina à temperatura ambiente (TR).

2. Preparação de ferramentas/materiais

NOTA: Toda a instrumentação deve ser autoclavada/esterilizada antes do uso.

  1. Isolamento da gordura epididimal/inguinal/subcutânea (cirurgia a ser realizada em área cirúrgica definida)
    1. Garantir a disponibilidade de absorventes descartáveis, duas tesouras, um hemostático (opcional), duas pinças e quatro tubos cônicos de 50 mL com 10-15 mL de BSA 1 mg/mL (0,1%) em PBS.
  2. Isolamento de fragmentos microvasculares
    1. Para a picagem (a ser feita em biohood), assegure-se da disponibilidade de três placas de Petri estéreis de 100 mm não revestidas, um par de pinças e uma tesoura curva.
    2. Para digestão e isolamento (a ser feito em biohood), garantir a disponibilidade de uma tesoura, um par de pinças, oito placas de Petri estéreis de 100 mm não revestidas, três placas de Petri estéreis de 35 mm não revestidas, colagenase pesada e a 4 °C, quatro frascos de 250 mL, um suporte plástico com um furo no centro, quatro telas de 500 μM (cortadas em 3 em quadrados arredondados), quatro telas de 37 μM (cortadas em 3 em quadrados arredondados) e 11 tubos cônicos de 50 mL.
  3. Ressuspensão de fibrina
    1. Para hidrogéis de fibrina (a serem feitos em um biohood), certifique-se de que fibrinogênio, trombina e meios de crescimento (feitos durante a preparação do reagente) estejam disponíveis.

3. Protocolo de isolamento de gordura

  1. Etapas preliminares
    1. Encha um copo com etanol para lavar e higienizar os instrumentos cirúrgicos antes de usá-los. Em seguida, prepare a mesa para manusear o rato e tenha um vácuo pronto para aspirar o pelo gerado durante a etapa de barbear.
    2. Preparar um balde com gelo onde serão colocados os tubos cônicos de 50 mL previamente preparados, cada um contendo 10 mL de 1 mg/mL de BSA. Rotule os tubos de acordo.
      OBS: Pode ser necessário ter dois tubos cônicos separados para a gordura inguinal, uma vez que dois lados precisam ser extraídos e a quantidade de gordura coletada dessa região tende a ser a maior em comparação com o epidídimo e o subcutâneo posterior.
    3. Comece com um rato eutanasiado na área cirúrgica definida com as ferramentas cirúrgicas necessárias. Geralmente, o CO2 é usado para eutanásia dos ratos seguindo os protocolos da IACUC.
    4. Usando cortadores de cabelo, raspe o rato ao redor da área de interesse. Especificamente, faça a barba entre as virilhas e metade do abdômen para isolamento da gordura epididimal e inguinal (use o barbeador menor para o pelo nesta região). Faça a barba de todo o dorso para obter a gordura subcutânea posterior localizada entre as escápulas (é melhor usar um barbeador maior, pois o pelo é mais grosso na parte de trás do rato).
    5. Prepare assepticamente o rato pulverizando-o com etanol a 70%. Geralmente, recomenda-se limpar a área que será cortada duas vezes.
  2. Isolamento de diferentes depósitos de gordura
    1. Inguinal (subcutâneo)
      1. Na posição supina, levante a pele abaixo do pênis com uma tesoura. Iniciar a incisão com tesoura, iniciando no centro e cortando lateralmente, formando um formato de "V" e fazendo um loop até a parte de trás do rato para acessar todo o depósito de gordura. Lembre-se de cortar superficialmente para que a gordura abaixo esteja intacta. Durante a etapa de corte, garantir a separação da pele da gordura cortando o tecido da fáscia interconectado (Figura 2A).
      2. Uma vez que a fáscia é adequadamente cortada, certifique-se de que os dois lados da gordura inguinal são visíveis (a gordura inguinal se estende da área da virilha em direção às costas). Em seguida, remova a gordura dos dois lados em dois tubos cônicos separados contendo 10 mL de 1 mg/mL de BSA (Figura 2B).
    2. Epidídimo (visceral)
      1. Colher a gordura epididimal cortando a pele abdominal e cuidadosamente através da fina camada ao redor dos testículos (Figura 2C).
      2. Com pinças, puxe suavemente o tecido adiposo para fora e corte-o usando tesoura. Evite dissecar os principais vasos sanguíneos visíveis (se o testículo e o epidídimo forem colhidos, remova-os durante a etapa de limpeza na biohood).
      3. Coloque cuidadosamente a gordura removida em um tubo cônico de 50 mL com 10 mL de BSA 1 mg/mL em PBS.
        OBS: A retirada da gordura epididimal deve ser feita após a retirada da gordura inguinal. A gordura epididimal é geralmente menor em volume e localizada abaixo da gordura inguinal, abaixo da pele abdominal ao redor do testículo e do epidídimo.
    3. Subcutâneo posterior
      1. Virar o rato em decúbito ventral (dorsal para cima) e, com uma tesoura grande, cortar a pele do dorso (a pele dessa região é grossa) até o couro cabeludo, tomando cuidado para não cortar muito fundo, logo abaixo da pele (Figura 2D).
      2. Corte a fáscia conectando a pele ao tecido; A gordura localiza-se na região interescapular. Anote para diferenciar/separar a gordura subcutânea da gordura marrom. A gordura marrom está mais próxima da coluna vertebral (Figura 2E).
      3. Isolar e colocar a gordura no(s) tubo(s) cônico(s) correspondente(s) de 50 mL com 10 mL de BSA 1 mg/mL em PBS.

Diagrama de dissecção do tecido adiposo de camundongo; localizações de gordura inguinal, epididimal e posterior.
Figura 2: Isolamento dos diferentes depósitos de tecido adiposo. (A) Incisões iniciais necessárias para excisão do tecido adiposo inguinal. (B) Localização do depósito de gordura inguinal. (C) Localização do depósito de gordura epididimal, observando-se incisão da pele externa necessária para o acesso. (D) Incisões adicionais necessárias uma vez que os camundongos são colocados propensos a acessar gordura adicional. (E) Localização do depósito de gordura subcutânea posterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Protocolo de isolamento de fragmentos microvasculares

  1. Colocar 50 ml de tubo(s) cónico(s) contendo gordura excisada do rato em biohood.
  2. Usando pinças, coloque a gordura em uma placa de Petri padrão de 100 mm (com ~0,5 mL de 1 mg/mL de BSA em PBS para manter o tecido hidratado).
  3. Limpar e remover quaisquer vasos sanguíneos visíveis e músculos/tecidos estranhos da gordura.
  4. Pique a gordura com uma tesoura por ~10 min (pice o suficiente para que possa ser transferida com uma pipeta de 10 mL).
  5. Verifique se há grumos adicionando ~0,5 mL de 1 mg/mL de BSA em PBS; Continue picando, se necessário.
  6. Transferir a gordura picada para um balão estéril de 250 ml com uma pipeta de 10 ml.
    Observação : observe o volume usando um pipet.
  7. Adicionar BSA suficiente (1 mg/mL) para que o volume final seja de 20 mL.
  8. Adicionar 4 mg/mL de BSA em PBS à colagenase (concentração final de colagenase: 6 mg/mL) (ou seja, 12 mL para os 72 mg de colagenase ou 24 mL para os 144 mg de colagenase).
    Observação : não adicione até que a picagem é concluída, pois é sensível ao tempo.
  9. Agite suavemente o tubo cónico para garantir uma solução homogénea e filtre esterilizar a solução com um filtro líquido de nylon de 0,22 μm.
  10. Para a gordura epididimal, digerir por ~8-10 min; para a gordura subcutânea inguinal e posterior, digerir por ~15-20 min em banho-maria a 37 °C, agitando o frasco em movimento circular durante todo o trajeto (pare no momento em que a gordura chega onde restam apenas alguns grumos).
  11. Transfira a gordura digerida para um tubo cônico de 50 mL (deve haver ~30 mL/tubo) e rotule o tubo como "gordura digerida".
  12. Gire o tubo a 400 x g por 4 min; após a fiação, o pellet deve estar vermelho (Figura 3A).
  13. Durante o giro, colocar a tela estéril de 37 μM e as telas de 500 μM em uma placa de Petri estéril com 5 mL de 1 mg/mL de BSA em PBS para pré-embeber antes do uso.
  14. Após o spin, decantar o sobrenadante em um tubo cônico de 50 mL rotulado como "resíduo". Realizar a decantação suavemente para remover a gordura superficial e não perturbar o pellet feito de MVFs.
  15. Adicionar 10 mL de 1 mg/mL de BSA em PBS ao tubo contendo o pellet ("gordura digerida"). Triturar (pipetar para cima e para baixo) o pellet 2x.
  16. Evite ficar muito áspero no pellet para não atrapalhar os fragmentos.
  17. Coloque a tela de 500 μM em uma nova placa de Petri acima do suporte de tela de plástico (Figura 3B).
  18. Pipetar 10 mL do tubo "pastilha digerida" sobre uma tela de 500 μM usando círculos concêntricos (Figura 3C).
  19. Lavar o filtro com mais 5 ml de 1 mg/ml de BSA em PBS. As células desejadas serão filtradas para a placa de Petri; portanto, descarte a tela de 500 μM, mas guarde o líquido filtrado dentro da placa de Petri.
  20. Coloque a tela de 37 μM em uma nova placa de Petri acima do suporte de tela de plástico.
  21. Troque o pipet para eliminar quaisquer aglomerações antes de usar a tela de 37 μM.
  22. Pipetar o líquido obtido da primeira filtração sobre a tela de 37 μM usando círculos concêntricos.
  23. Lavar o filtro com mais 5 ml de 1 mg/ml de BSA em PBS. As células desejadas permanecerão no filtro, portanto, descarte o líquido filtrado, mas salve a tela de 37 μM.
  24. Deslizar a tela de 37 μM para uma nova placa de Petri contendo 5 mL de 1 mg/mL de BSA em PBS.
  25. Agite o prato batendo contra um suporte cônico para desalojar os fragmentos. Não agite muito vigorosamente, pois o líquido/células pode derramar-se para fora da placa de Petri.
  26. Enxaguar o filtro com mais 5 mL de 1 mg/mL de BSA em PBS. As células desejadas permanecerão em solução líquida na placa de Petri. Guarde a tela de 37 μM e o fragmento deslocado contendo líquido dentro da placa de Petri para as etapas seguintes.
  27. Transferir o fragmento BSA + contendo líquido para um tubo cônico estéril de 50 mL.
  28. Repita o enxágue da tela de 37 μM várias vezes mais vezes (cada vez com ~5 mL de 1 mg/mL de BSA em PBS) e adicione ao tubo cônico. Repita até que o volume total coletado seja de ~15-20 mL. Finalmente, as células desejadas serão coletadas da solução líquida na placa de Petri e colocadas em um tubo cônico; neste momento, descartar a tela de 37 μM após o enxágue final, mas guardar os fragmentos desalojados contendo líquido dentro do tubo cônico de 50 mL.
  29. Encaixe a extremidade de uma ponta de pipeta de 200 μL usando uma tesoura. Agitar suavemente o tubo de 50 ml, retirar duas amostras de 20 μL e colocá-las numa placa de Petri limpa de 35 mm.
  30. Contar o número de fragmentos em cada amostra na placa de Petri para obter o número total de MVFs isolados.
    Total de Fragmentos = Equação para cálculo da concentração média da amostra em um tubo cônico de 50 mL.
  31. Gire o fragmento remanescente deslocado contendo líquido em um tubo cônico de 50 mL a 400 x g por 4 min para coletar o MVF.

Diagrama do processo de centrifugação com instruções de configuração de pellets, isolamento do sobrenadante e filtração.
Figura 3: Isolamento das MVFs . (A) Pós-digestão do tecido adiposo, representação da separação das MVFs contendo pellet e sobrenadante após um spin-down. (B) Disposição dos suprimentos para filtração e aprisionamento de MVFs. (C) Ilustração do método do círculo concêntrico para as etapas de filtração/lavagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Formação de hidrogéis de fibrina

  1. Exemplos de cálculos:
    NOTA: Abaixo estão os cálculos para MVFs semeadas a ~15.000-20.000 MVF/mL e a relação fibrinogênio:gel de trombina em 2:5, com fibrinogênio usado na concentração de 20 mg/mL.
    1. Para fazer cinco géis de 250 μL, é necessário um volume total de 1.250 μL. Sempre contabilize os erros de pipetagem, portanto, faça o suficiente para 1,5 mL de géis.
      1. Calcule o volume de fibrinogênio necessário da seguinte forma:
        Fórmula da razão \( \frac{2}{7} = \frac{X_1}{1500 \, \mu L} \), cálculo em configuração experimental., X1 = 428,57 μL de fibrinogênio
      2. Calcule o volume de trombina necessário da seguinte forma:
        fórmula de cálculo de diluição, equação; 5/7 = X<sub>2</sub>/1500 μL, diagrama de química educacional, X2 = 1.071,43 μL de trombina
      3. Para o volume necessário de 428,57 μL, fazer 500 μL de fibrinogênio da seguinte forma:
        20 mg/mL * 0,5 mL = 10 mg de fibrinogênio. Ressuspendê-lo em 500 μL de DMEM
      4. Para obter cada gel, calcule o volume de fibrinogênio e trombina da seguinte forma:
        1. Fibrinogênio:
          Equação mostrando a fórmula de diluição, 2/7 = X1 / 250μL, usada em cálculos de laboratório de química., X1 = 71,43 μL de fibrinogênio (em DMEM) + MVF
        2. Trombina:
          Equação de proporção, 5/7=X2/250μL, usada em cálculos de diluição; fórmula para uso educacional., X2 = 178,57 μL de trombina
  2. Fundição em gel de fibrina MVF
    1. Decantar a maior parte do líquido no fragmento girado no tubo cônico de 50 mL. Use uma pipeta para remover o pequeno volume de líquido que pega na borda do tubo cônico.
    2. Adicionar trombina nos poços onde serão confeccionados os géis (Figura 4A).
    3. Clipe a extremidade de uma ponta de pipeta de 200 μL e ressuspenda as MVFs suavemente usando fibrinogênio para obter uma densidade final de ~15.000-20.000 MVF/mL uma vez no gel.
    4. Encaixe suavemente a extremidade de uma ponta de pipeta de 200 μL e pipeta MVF+Fibrinogênio na solução de trombina. Pipete rapidamente para cima e para baixo para garantir uma mistura homogênea. Repita até que todos os géis estejam prontos (Figura 4B).
    5. Coloque a(s) placa(s) de poço em uma incubadora (37 °C, 5% CO2) por ~15 min para permitir a reticulação em gel (Figura 4C).
    6. Adicionar 100-150 μL de meio de crescimento a cada poço.

Diagrama de formação de hidrogel de trombina em trombina: fibrinogênio pipetado, MVFs, ajuste de 37°C.
Figura 4: Formação dos géis de fibrina MVF . (A) Uma mistura de trombina de 5/7 partes é pipetada para o poço correspondente. (B) Em seguida, com uma ponta de pipeta cortada (para não perturbar as MVFs), uma mistura de fibrinogênio+MVF de 2/7 partes é pipetada no poço e misturada suavemente. (C) Por último, todos os géis completos são colocados numa incubadora a 37 °C, permitindo que o hidrogel se solidifique totalmente antes de o meio ser colocado por cima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Condições de cultivo de MVFs

  1. Para a cultura de tecido adiposo bege e branco não vascularizado (+ Controle MG), utilizar as linhas do tempo19 mostradas na Figura 5.
  2. Para a cultura do tecido adiposo branco e bege vascularizado (+ Controle MG), utilizar as linhas do tempo19 mostradas na Figura 6.
  3. Os hidrogéis devem ser mantidos em incubadora (37 °C, 5% CO2) durante a cultura do estudo, sendo os meios trocados em dias alternados. Para fixação e manuseio de amostras para análise, consultar trabalhos publicados anteriormente16,19,20.

Diagrama de linha do tempo de angiogênese vs. adipogênese: comparação de processos de 14 dias para GM, WAM, BAM.
Figura 5: Momento da formação do tecido adiposo não vascularizado. Esse valor foi modificado a partir de Acosta et al.19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama de linha do tempo de angiogênese e adipogênese detalhando a indução e maturação de GM e WAM/BAM.
Figura 6: Tempo para formação de tecido adiposo vascularizado. Esse valor foi modificado a partir de Acosta et al.19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Existem algumas características morfológicas fenotípicas importantes do tecido adiposo bege/marrom: é multilocular/contém pequenas gotículas lipídicas, possui um grande número de mitocôndrias (a razão de sua aparência caracteristicamente "acastanhada" in vivo), correspondentemente tem uma alta taxa de consumo de oxigênio/bioenergética mitocondrial, é altamente vascularizado, tem aumento da lipólise/captação de glicose estimulada por insulina e, mais notoriamente, expressa altos níveis de proteína desacopladora ...

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Discussão

O campo da engenharia do tecido adiposo marrom/bege é em grande parte imaturo 22,23,24,25,26,27,28, com a maior parte dos modelos adiposos sendo desenvolvidos para o tecido adiposo branco 8,22,31. M...

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Divulgações

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Dr. Acosta é apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health CA148724 e TL1TR002647. O Dr. Gonzalez é apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais dos Institutos Nacionais de Saúde, sob o número de prêmio F32-0DK122754. Este trabalho foi apoiado, em parte, pelo National Institutes of Health (5SC1DK122578) e pelo Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade do Texas em San Antonio. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. As figuras foram parcialmente criadas com Biorender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido aminocapróicoSigma AldrichA2504-100GAdicionado em DMEM na concentração de 1 mg/mL
Tesoura de ponta rombaFisher scientific12-000-172Esterilizar em autoclave
Bovin Serum Albumina (BSA)Millipore126575-10GMDiluído em PBS a 4 mg/mL e 1 mg/mL
de colagenase tipo 1Fisher scientificNC9633623Diluído a 6 mg/mL em BSA 4 mg/mL, Digestão de gordura picada
DexametasonaThermo ScientificAC230302500Diluído em etanol a uma concentração de estoque de 2 mg/ml
Absorventes descartáveisFisher scientific23-666-062Para absorção de fluidos durante
a cirurgia Tesoura de dissecaçãoFisher scientific08-951-5Esterilizar em autoclave
Dulbecco′ s Águia Modificada′ s Medium (DMEM)Fisher scientific11885092
Dulbecco′ s Águia Modificada′ s Mistura Média/Nutriente F-12 Ham (DMEM/F12)Sigma AldrichD8062
Soro Fetal Bovino Fisher scientific16140089Adicionado em DMEM a 20% v/v.
FibrinogênioSigma AldrichF8630-25GSolubilizado em DMEM na concentração de 20 mg/mL, Proteína encontrada no plasma sanguíneo e principal componente do hidrogel
Frasco, 250 mLFisher scientificFB500250Permite a digestão da gordura usando uma grande área de superfície
FórcepsFisher scientific50-264-21Esterilizar em autoclave, Para manuseio de tecidos e filtros
ForskolinSigma AldrichF6886Diluído em etanol a uma concentração de estoque de 10 mM
MVF humanoAdvanced Solutions Life Scienes, LLChttps://www.advancedsolutions.com/microvesselsMVFs humanos (hMVFs) isolados de três pacientes diferentes (mulheres de 52, 54 e 56 anos) foram usados no estudo atual.
Indometacina Sigma AldrichI7378Diluído em etanol a uma concentração estoque de 12,5 mM
Insulina do pâncreas suínoSigma AldrichI5523Diluído em HCl 0,01 N a uma concentração estoque de 5 mg/ml
MycoZapFisher scientificNC9023832Adicionado em DMEM a 0,2% p/v, Mycoplasma Prophylactic;
Pennycilin/Streptomycin (10.000 U/mL)15140122 científica de FisherAdicionado em DMEM a 1% v/v.
Placas de Petri, poliestireno (100 mm x 15 mm).Fisher scientific3510293 para remoção de vasos sanguíneos e picagem, 8 (tampa) para pré-imersão de telas e 8 (prato) para uso ao filtrar com 500 ou 37 µ M peneiras
de placas de Petri, poliestireno (35 mm x 10 mm).Fisher scientific50-202-036Para contagem de fragmentos
Tampão fosfato salino (PBS)Fisher scientific14-190-250Diluído a 1x com água deionizada estéril.
Aparadores de Rato (Aparador de Animais de Estimação Mini Arco Andwin)Fisher scientificNC0854141
RosiglitazoneFisher scientificR0106200MGDiluído em DMSO a uma concentração de estoque de 10 mM
TesouraFerramentas de Ciência Fina14059-111 para incisão inicial, 1 para incisão epididimal, 1 para recorte de ponta
Tela  37 µ M Carolina Biological Supply Company652222RCortado em quadrados arredondados de 3" e esterilizado em óxido de etileno, aprisionamento de fragmentos e remoção de fragmentos muito pequenos/células únicas e detritos
Tela 500 µ M Carolina Biological Supply Company652222FCortado em quadrados arredondados de 3" e esterilizado em óxido de etileno, Remove fragmentos/detritos
maiores Hemostat serrilhadoFisher scientific12-000-171Esterilizar em autoclave, Para fixação da pele antes da incisão
Filtro Steriflip 0.22 μ m MilliporeSE1M179M6
TrombinaFisher scientific6051601KUDiluído em água deionzada a 10 U/mL, Usado como agente de coagulação transformando fibrinogênio em fibrina
Hormônio tireoidiano (T3)Sigma AldrichT2877Diluído em 1N NaOH a uma concentração estoque de 0,02 mM
Ratos diabéticos gordurosos (ZDF) - obesos (FA/FA) ou magros (FA/+) masculinos Charles Riverhttps://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		Obtido de Charles River (Wilmington, MA). Os ratos foram adquiridos com 4 semanas de idade e alimentados com Purina 5008 até a eutanásia (15-19 semanas de idade). Os níveis de glicose (sangue da veia safena lateral) foram superiores a 300 mg/dL em todos os ratos FA/FA utilizados no estudo. Todos os animais foram alojados em ambiente com temperatura controlada com ciclo claro-escuro de 12 h e alimentados ad libitum.

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