Modelagem do carcinoma epidermóide orco-esofágico em organoides 3D

Samuel Flashner; Cecilia Martin; Norihiro Matsuura; Masataka Shimonosono; Yasuto Tomita; Masaki Morimoto; Ogoegbunam Okolo; Victoria X. Yu; Anuraag S. Parikh; Andres J. P. Klein-Szanto; Kelley Yan; Joel T. Gabre; Chao Lu; Fatemeh Momen-Heravi; Anil K. Rustgi; Hiroshi Nakagawa

doi:10.3791/64676

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Artigo de método

Modelagem do carcinoma epidermóide orco-esofágico em organoides 3D

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DOI:

10.3791/64676

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23 de dezembro de 2022

Samuel Flashner^*¹ , Cecilia Martin^*¹^,² , Norihiro Matsuura¹ , Masataka Shimonosono¹ , Yasuto Tomita¹ , Masaki Morimoto¹ , Ogoegbunam Okolo¹ , Victoria X. Yu¹^,³ , Anuraag S. Parikh¹^,³ , Andres J. P. Klein-Szanto⁴ , Kelley Yan¹^,² , Joel T. Gabre¹^,⁵ , Chao Lu¹^,⁶ , Fatemeh Momen-Heravi¹^,⁷ , Anil K. Rustgi¹^,⁵ , Hiroshi Nakagawa¹^,²^,⁵

¹Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, ²Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, ³Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, ⁴Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, ⁵Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, ⁶Department of Genetics and Development, Columbia University, ⁷Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve os principais passos para gerar e caracterizar organoides 3D oro-esofágicos murinos que representam lesões normais, pré-neoplásicas e de carcinoma espinocelular induzidas por carcinogênese química.

Resumo

O carcinoma epidermóide de esôfago (CEC) é prevalente em todo o mundo, responsável por 90% de todos os casos de câncer de esôfago a cada ano, e é o mais mortal de todos os carcinomas de células escamosas humanos. Apesar dos recentes progressos na definição das alterações moleculares que acompanham o início e o desenvolvimento do CEC, o prognóstico dos pacientes permanece ruim. A anotação funcional dessas alterações moleculares é o próximo passo necessário e requer modelos que capturam as características moleculares do CEC e podem ser manipulados de forma rápida e barata para anotação funcional. Camundongos tratados com o 4-óxido de nitroquinolina 1-óxido mimético da fumaça do tabaco (4NQO) previsivelmente formam CEC e pré-neoplasia esofágica. Vale ressaltar que as lesões de 4NQO também surgem na cavidade oral, mais comumente na língua, bem como no pré-estômago, que compartilham o epitélio escamoso estratificado. No entanto, esses camundongos não podem ser simplesmente manipulados para testes de hipóteses funcionais, já que a geração de modelos isogênicos em camundongos consome muito tempo e recursos. Neste estudo, superamos essa limitação gerando organoides tridimensionais (3D) derivados de células únicas a partir de camundongos tratados com 4NQO para caracterizar células murinas ESCC ou células pré-neoplásicas ex vivo. Esses organoides capturam as características salientes do CEC e da pré-neoplasia esofágica, podem ser aproveitados de forma barata e rápida para formar modelos isogênicos e podem ser utilizados para experimentos de transplante singênico. Demonstramos como gerar organoides 3D a partir de tecido esofágico murino normal, pré-neoplásico e CEC e manter e criopreservar esses organoides. As aplicações desses organoides versáteis são amplas e incluem o uso de camundongos geneticamente modificados e posterior caracterização por citometria de fluxo ou imunohistoquímica, a geração de linhagens organoides isogênicas usando tecnologias CRISPR e triagem de drogas ou transplante singênico. Acreditamos que a adoção generalizada das técnicas demonstradas neste protocolo acelerará o progresso neste campo para combater a grave carga de CEC.

Introdução

O carcinoma epidermóide de esôfago (CEC) é o mais letal dos carcinomas epidermóides humanos, devido ao seu diagnóstico tardio, resistência à terapia e metástase1,2. O CEC origina-se do epitélio escamoso estratificado, que reveste a superfície luminal do esôfago. O epitélio escamoso é composto por células basais proliferativas e células diferenciadas dentro da camada celular suprabasal. Em condições fisiológicas, as células basais expressam marcadores como p63, Sox2 e citoqueratinas K5 e K14, enquanto as células diferenciadas expressam K4, K13 e IVL. As próprias células basais são heterogêneas e incluem células....