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Artigo de método

Cultura de Longo Prazo de Caenorhabditis elegans Individuais em Meio Sólido para Monitoramento Longitudinal de Fluorescência e Intervenções Aversivas

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DOI:

10.3791/64682

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2 de dezembro de 2022

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1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para cultura de isolados de nematoides individuais em meio sólido para rastreamento de parâmetros fisiológicos ao longo da vida e quantificação de fluorescência. Este sistema de cultura inclui uma barreira de ácido palmítico ao redor de poços de verme único para evitar a fuga de animais, permitindo o uso de intervenções aversivas, incluindo bactérias patogênicas e estressores químicos.

Resumo

Caenorhabditis elegans são amplamente utilizados para estudar a biologia do envelhecimento. A prática padrão em estudos de envelhecimento de C. elegans é cultivar grupos de vermes em meios de crescimento de nematoides sólidos (NGM), permitindo a coleta eficiente de dados em nível populacional para sobrevivência e outros fenótipos fisiológicos, e amostragem periódica de subpopulações para quantificação de biomarcadores fluorescentes. As limitações dessa abordagem são a incapacidade de (1) acompanhar vermes individuais ao longo do tempo para desenvolver trajetórias etárias para fenótipos de interesse e (2) monitorar biomarcadores fluorescentes diretamente no contexto do ambiente de cultura. Abordagens de cultura alternativa usam cultura líquida ou microfluídica para monitorar animais individuais ao longo do tempo, em alguns casos incluindo quantificação de fluorescência, com a compensação de que o ambiente de cultura é contextualmente distinto do NGM sólido. O WorMotel é um dispositivo multipoço microfabricado previamente descrito para o cultivo de vermes isolados em NGM sólido. Cada verme é mantido em um poço contendo NGM sólido cercado por um fosso preenchido com sulfato de cobre, um repelente de contato para C. elegans, permitindo o monitoramento longitudinal de animais individuais. Achamos o sulfato de cobre insuficiente para evitar que vermes fujam quando submetidos a intervenções aversivas comuns em pesquisas sobre envelhecimento, incluindo restrição alimentar, bactérias patogênicas e agentes químicos que induzem estresse celular. Os dispositivos multipoços também são moldados a partir de polidimetilsiloxano, que produz artefatos de alto fundo em imagens de fluorescência. Este protocolo descreve uma nova abordagem para o cultivo de lombrigas isoladas em NGM sólido usando microbandejas de poliestireno disponíveis comercialmente, originalmente projetadas para tipagem de antígenos leucocitários humanos (HLA), permitindo a medição da sobrevivência, fenótipos fisiológicos e fluorescência ao longo da vida. Uma barreira de ácido palmítico impede que os vermes fujam, mesmo na presença de condições aversivas. Cada placa pode cultivar até 96 animais e se adapta facilmente a uma variedade de condições, incluindo restrição alimentar, RNAi e aditivos químicos, e é compatível com sistemas automatizados para coletar dados de vida útil e atividade.

Introdução

C. elegans é um poderoso organismo modelo para pesquisas em genética, biologia celular e biologia molecular, pois são facilmente cultivadas em laboratório, têm curto tempo de geração e vida útil, compartilham alto grau de homologia proteica com mamíferos e possuem estrutura corporal transparente que permite a visualização in vivo de proteínas fluorescentes e corantes1. Como resultado do uso de longa data de C. elegans como um sistema modelo principal em uma variedade de campos, incluindo biologia do desenvolvimento e envelhecimento, seu crescimento e desenvolvimento são bem compreendidos, seu genoma foi totalmente sequenciado e uma série de ferramentas genéticas poderosas foram criadas, incluindo bibliotecas de alimentação de RNAi em todo o genoma e milhares de cepas mutantes e transgênicas. Historicamente, C. elegans são cultivadas como populações em meios de crescimento de nematoides sólidos em ágar (NGM), e os fenótipos são avaliados manualmente por observação direta ou por imagem e análise a jusante. A microscopia fluorescente é usada para capturar uma variedade de fenótipos moleculares usando corantes ou etiquetas fluorescentes transgenicamente expressas em C. elegans individuais. A imagem fluorescente geralmente envolve a fixação ou paralisação de um animal em lâminas contendo almofadas finas de agarose, o que é invasivo e muitas vezes letal. Envolve também o uso de substâncias químicas, como levamisol ou azida sódica, que potencialmente podem interferir no processo molecular de interesse 2,3. Juntas, essas abordagens permitem que dados transversais em nível populacional sejam coletados em uma ampla gama de fenótipos, mas não permitem o rastreamento de animais individuais ao longo do tempo.

Nos últimos anos, várias abordagens têm surgido para cultivar C. elegans isolados, permitindo aos pesquisadores capturar mudanças dinâmicas nos fenótipos fisiológicos e moleculares de animais ao longo do tempo utilizando novas tecnologias de imagem. Uma categoria de abordagem de cultura de C. elegans são os dispositivos microfluídicos, incluindo o WormFarm4, o chip Nemalife5 e o chip 'comportamento' de Chronis et al.6, entre vários outros 7,8,9. Relacionados a estes estão os métodos de cultura em base líquida, que utilizam placas de poços múltiplos para caracterizar vermes individuais ou pequenas populações ao longo do tempo10,11. Sistemas microfluídicos e de microplacas fornecem excelentes medidas quantitativas de respostas fenotípicas em C. elegans até um único animal, mas o ambiente de cultura apresenta uma limitação fundamental. A grande maioria das pesquisas anteriores em C. elegans, particularmente no campo do envelhecimento, foi concluída em meios sólidos baseados em ágar. A cultura líquida faz com que C. elegans nade continuamente e representa um contexto ambiental distinto que pode alterar a biologia subjacente. Por exemplo, animais cultivados em meio líquido alteraram drasticamente o conteúdo de gordura e a expressão gênica — particularmente para genes envolvidos na resposta ao estresse — em relação a animais cultivados em NGM sólida à base de ágar12,13. Uma categoria alternativa de métodos de imagem de um único animal envolve dispositivos de polidimetilsiloxano (PDMS) que isolam animais individuais em meios sólidos, em um esforço para mimetizar mais de perto o ambiente padrão experimentado por vermes cultivados em NGM sólido em cultura de grupo em placas de Petri. O WorMotel é um dispositivo PDMS de 240 poços projetado para cultivar animais individuais em mídia sólida. Cada poço é preenchido com um NGM modificado usando agarose de baixo derretimento no lugar do ágar e semeado com alimento bacteriano, criando um ambiente de meio sólido semelhante ao sistema de cultura mais comum usando placas de Petri. As paredes do poço são redondas, permitindo que cada animal seja fotografado independentemente da localização no poço (evitando o obscurecimento visual causado por um animal perto de uma parede em uma placa de vários poços). O sulfato de cobre em um fosso estreito ao redor de cada poço é usado como dissuasor para manter os animais em seus poços14,15. Uma limitação dessa abordagem é que o sulfato de cobre é ineficaz para impedir a fuga de vermes quando condições ambientais aversivas estão presentes, incluindo restrição alimentar, bactérias patogênicas ou produtos químicos que induzem estresse celular (por exemplo, paraquat).

Um segundo sistema que utiliza meios sólidos é o Worm Corral, que emprega um hidrogel para criar um pequeno ambiente selado para cada verme em uma lâmina, permitindo o monitoramento a longo prazo de animais isolados individualmente16. Uma limitação fundamental é que os animais devem ser selados no ambiente como ovos, exigindo o uso de animais estéreis para evitar a reprodução e limitando os tratamentos medicamentosos a uma única aplicação. Ensaios de drogas multidose podem ser realizados no WorMotel realizando várias rodadas de exposição antes de transferir vermes para o dispositivo ou adicionando topicamente drogas adicionais aos poços durante o experimento; No entanto, neste último caso, a dose de exposição real após a adição de um medicamento adicional a um poço existente é difícil de quantificar com precisão e depende da rapidez com que o medicamento se degrada. Tanto o WorMotel quanto o Worm Corral são excelentes para imagens de campo claro ou campo escuro para capturar informações relacionadas à atividade e fisiologia animal (por exemplo, crescimento e desenvolvimento). Embora esses sistemas possam ser usados para monitorar a fluorescência, em nossa experiência, o PDMS usado para criar as outras tecnologias de imagem de worm único é propenso a formar microbolhas, capturar partículas e outras pequenas anormalidades que geram artefatos fluorescentes irregulares que interferem na visualização e quantificação consistentes de fluorescência, especialmente na faixa de emissão de GFP, o fluoróforo mais comum usado na pesquisa de C. elegans. Até o momento, imagens de fluorescência viva de animais individuais de C. elegans de forma longitudinal dependem principalmente de dispositivos microfluídicos17.

Aqui, descrevemos um novo método para cultivo de C. elegans individuais em meios sólidos que é compatível com intervenções aversivas e imagens fluorescentes diretas. Essa abordagem é semelhante em conceito a outras tecnologias de imagem de worm único, exceto que o chip PDMS moldado sob medida é substituído por microbandejas de poliestireno disponíveis comercialmente originalmente desenvolvidas para ensaios de microcitotoxicidade (também comumente chamadas de bandejas Terasaki)18. Essas microbandejas apresentam poços que podem ser preenchidos com meio sólido e semeados com alimento bacteriano, imitando de perto o ambiente experimentado pelos animais sob a metodologia padrão de cultura sólida NGM. Cada poço é cercado por uma barreira aversiva de ácido palmítico em vez de sulfato de cobre. O ácido palmítico é comumente usado para evitar que vermes fujam de meios sólidos, usando cultura de grupo padrão em placas de Petri em experimentos onde os vermes são desafiados com um ambiente aversivo, como restrição alimentar ou exposição a um estressor químico. As microbandejas também produzem fundo fluorescente mínimo e consistente, permitindo imagens fluorescentes de animais diretamente em seu ambiente de cultura. Este novo sistema de cultura baseado em ágar sólido de animal único não só permite rastrear animais individuais ao longo da vida e monitorar o crescimento, desenvolvimento, atividade e tempo de vida, mas também é compatível com microscopia fluorescente direta. Como os vermes podem ser fotografados sem paralisia ou fixação, biomarcadores de fluorescência in vivo podem ser quantificados longitudinalmente em animais individuais remanescentes em seus meios de cultura, permitindo a observação de mudanças dinâmicas ao longo da vida de cada animal. Esse sistema de cultura também é compatível com sistemas automatizados de geração atual para rastreamento da vida útil e outras métricas de saúde14,19. Nós fornecemos um protocolo detalhado para a cultura de C. elegans individuais neste sistema baseado em microbandeja, discutimos possíveis armadilhas e solução de problemas, e discutimos as vantagens e limitações em relação a outros sistemas e, em particular, um protocolo WorMotel atualizado e otimizado15.

Cada ambiente de cultura de worm único consiste em uma microbandeja montada dentro de uma bandeja padrão de poço único usando um adaptador personalizado impresso em 3D (Figura 1A). Os poços são preenchidos com meios de crescimento de nematoides de agarose de baixo derretimento (lmNGM), semeados com bactérias concentradas como fonte de alimento e cercados por um revestimento de ácido palmítico para evitar a fuga de vermes (Figura 1B). O espaço entre a microbandeja e as paredes da placa de poço único é preenchido com cristais de água saturados para manter a umidade (Figura 1B). Um revestimento de detergente é aplicado na tampa da bandeja para evitar a condensação. Um único verme é adicionado a cada poço, e a bandeja de poço único é selada com Parafilm para manter a umidade e permitir a troca de oxigênio. Até seis microbandejas podem ser razoavelmente preparadas em paralelo por um único pesquisador praticante.

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Protocolo

1. Receitas

NOTA: Prepare as soluções-mãe antes de iniciar a preparação da placa de microbandeja.

  1. Soluções estoque para meios de crescimento de nematoides de agarose de baixa fusão (lmNGM)
    1. Preparar 1 M K 2 HPO4 dissolvendo 174,18 g de K2HPO4 em 1L de água deionizada estéril num frasco de 1 L. Autoclave a solução a 121 °C, 15 psi, por 30 min e armazene-a à temperatura ambiente (TR).
    2. Preparar 1 M KPi (pH 6,0) dissolvendo 136,09 g de KH2HPO4 em 1 L de água deionizada estéril num frasco de 1 L. Titular a solução com 1 M K2HPO4 para atingir pH 6,0. Autoclave a solução a 121 °C, 15 psig, por 30 min e armazene-a em RT.
    3. Preparar 1 M de CaCl 2 dissolvendo 73,5 g de CaCl2 em 500 mL de água deionizada estéril em um frasco de 500 mL. Autoclave a solução a 121 °C, 15 psig, por 30 min e armazene-a em RT
    4. Preparar 1 M de MgSO 4 dissolvendo 123,25 g de MgSO4 em 500 mL de água deionizada estéril em um frasco de 500 mL. Autoclave a solução a 121 °C, 15 psig, por 30 min e armazene-a em RT.
    5. Prepare 3 M NaCl para lmNGM: Em frasco limpo de 100 mL, combine 100 mL de água ultrapura e 18,20 g de NaCl. Autoclave a 121 °C, 15 psig, por 30 min.
    6. Preparar 5 mg/mL de colesterol combinando 2,5 g de colesterol, 275 mL de etanol 100% e 25 mL de água deionizada estéril em um frasco âmbar de 500 mL. Autoclave a solução a 121 °C, 15 psig, por 30 min e armazene-a em RT.
    7. Preparar 50 mM de fluordesoxiuridina (FUdR) dissolvendo 0,1231 g de FUdR em 10 mL de água deionizada estéril em um tubo cônico de 15 mL. Utilizar seringa de 10 mL e filtro de 0,22 μm para esterilizar a solução. Alíquota 1 mL da solução cada em 10 tubos de microcentrífuga e armazená-los a -20 °C.
    8. Preparar 50 mg/mL de carbenicilina dissolvendo 500 mg de carbenicilina em 10 mL de água deionizada estéril em um tubo cônico de 15 mL. Utilizar seringa de 10 mL e filtro de 0,22 μm para esterilizar a solução. Alíquota 1 mL da solução cada em 10 tubos de microcentrífuga e armazená-los a -20 °C.
    9. Preparar 1 mM de isopropil ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) dissolvendo 2,38 g de IPTG em 10 mL de água deionizada estéril em um tubo cônico de 15 mL. Utilizar seringa de 10 mL e filtro de 0,22 μm para esterilizar a solução. Alíquota 1 mL da solução cada em 10 tubos de microcentrífuga e armazená-los a -20 °C.
    10. Preparar 100 mg/mL de ampicilina dissolvendo 1 g de ampicilina em 10 mL de água deionizada estéril em um tubo cônico de 15 mL. Utilizar seringa de 10 mL e filtro de 0,22 μm para esterilizar a solução. Alíquota 1 mL da solução de ampicilina a 100 mg/mL cada em 10 tubos de microcentrífuga e armazenar os tubos a -20 °C.
  2. Preparação de meios de crescimento de nematoides (NGM) para manutenção geral de C. elegans
    1. Para fazer 50 placas, dissolver 10 g de ágar Bacto, 1,5 g de NaCl e 1,25 g de peptona Bacto em 486 mL de água ultrapura em um frasco de 1 L. Esterilizar o meio autoclavando-o em ciclo líquido a 121 °C, 15 psig, por pelo menos 30 min.
    2. Após a autoclave, deixar o meio esfriar até 55 °C. Em seguida, adicionar 12,5 mL de 1 M KPi, 500 μL de 1 M MgSO4, 500 μL de 1 M CaCl2 e 500 μL de 5 mg/mL de colesterol à solução.
    3. Usando uma técnica estéril, despejar 10 mL do meio preparado na etapa 1.2.2 em cada placa de 60 mm (50 no total). Deixe as placas com o meio por pelo menos 30 min para solidificar. Pipetar 300 μL de cultura bacteriana cultivada durante a noite no centro da placa e deixar a placa na bancada. Deixe a cultura secar e crescer mais grossa por 1-2 dias. Conservar estas placas de NGM com bactérias a 4 °C.
  3. Preparando a pré-mistura lmNGM
    1. Em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL, combinar 2 g de agarose de baixo derretimento, 0,25 g de peptona, 1 mL de NaCl 3 M e 99 mL de água ultrapura. Autoclave a solução a 121 °C, 15 psig, durante 30 min.
    2. Alíquota 10 mL de lmNGM em tubos de ensaio e cobrir com Parafilm para evitar perda de líquido. Tampe os tubos e deixe-os arrefecer e solidificar.
  4. Prepare NaCl 85 mM para alimentos bacterianos: Em um frasco de 100 mL, combine 515,61 mg de NaCl e encha até 100 mL com água ultrapura. Autoclave a 121 °C, 15 psig, por 30 min.
  5. Prepare cristais de poliacrilamida absorvedores de água dissolvendo 1 g de polímero superabsorvente Tipo S em 150 mL de água ultrapura em um frasco de compressão autoclavável. Corte a ponta para garantir um tamanho de dosagem adequado. Autoclave a 121 °C, 15 psig, por 30 min, tampar com tinfoil, e agitar para misturar os cristais.
  6. Preparar uma solução de detergente combinando 3 ml de Tween-20 a 100% com 7 ml de água ultrapura num frasco cónico de 15 ml.
  7. Preparar 5 mg/mL de colesterol combinando 2,5 g de colesterol, 275 mL de EtOH 100% e 25 mL de água ultrapura em um frasco de 500 mL.
  8. Preparar solução de trabalho de ácido palmítico
    1. Triture 500 mg de ácido palmítico sólido numa argamassa e pilão e combine-o com 15 ml de Tween-20 num frasco cónico de 50 ml. Misture por vórtice, dissolvendo o maior número possível de cristais.
    2. Adicionar 17,5 mL de etanol a 100% e vórtice a solução para dissolver o máximo possível de ácido palmítico.
    3. Adicionar 17,5 mL de água ultrapura e vórtice rigorosamente. Aqueça suavemente a solução num banho de contas a 80 °C até que o ácido palmítico se dissolva completamente. Algum ácido palmítico pode precipitar-se durante o arrefecimento.
  9. Preparar o caldo de lisogenia (LB) misturando 20 g de pó de LB em 1 L de água deionizada num copo de 1 L ou maior. Alíquota 500 mL do caldo em dois copos de 500 mL. Autoclave o caldo a 121 °C, 15 psig, por 30 min. Guarde o caldo preparado na RT.
  10. Preparação de placas de ágar caldo lisogênico (LB)
    1. Misturar 10 g de LB em pó e 7,5 g de ágar Bacto em 500 μL de água deionizada num balão de 1 L. Autoclave a solução em ciclo líquido a 121 °C, 15 psig, durante 30 min.
    2. Se desejar, adicionar antibióticos opcionais (500 μL de 100 μg/mL de ampicilina) após o meio autoclavado ser resfriado a 55 °C. Usando uma técnica estéril, fazer placas de ágar LB despejando 20 mL de meio em cada placa de 100 mm (25 no total). Conservar as placas a 4 °C.

2. Preparando uma população de vermes sincronizados com a idade

  1. Prepare uma população de vermes sincronizados com a idade que estão prontos para adicionar à microbandeja no estágio larval 4 (L4). Alternativamente, worms em qualquer estágio de vida podem ser adicionados (FUdR deve ser excluído do meio da microbandeja se os vermes forem adicionados em um estágio de desenvolvimento anterior a L4 para evitar a parada do desenvolvimento).
    NOTA: Esta etapa deve ser concluída 2 dias antes de adicionar os worms à microbandeja se o estágio de vida alvo no início do experimento for L4. O tempo de sincronização pode ser ajustado para permitir que os vermes atinjam o estágio de vida desejado.
  2. A temperatura pode afetar a vida útil. Para obter resultados consistentes, utilize placas NGM padrão (ver secção 1) para manter C. elegans a 20 °C e transfira vermes para pratos frescos se estes consumirem alimentos bacterianos.
  3. A partir das placas de estoque com muitos vermes adultos jovens, use uma abordagem padrão para gerar uma população sincronizada com a idade, mais comumente clareando20 ou colocando ovos cronometrados21.
  4. Isole os ovos e adicione-os a uma placa de NGM manchada por bactérias. Se usar C. elegans selvagem, os ovos eclodirão e formarão vermes, atingindo o estágio larval L4 em 2 dias.

3. Preparação da cultura de bactérias

  1. Um dia antes do início do experimento, inocular a fonte de alimento bacteriana desejada. Preparar ~5 mL de cultura bacteriana por placa.
    NOTA: A estria bacteriana pode ser preparada com até 1 mês de antecedência e armazenada a 4 °C para fonte alimentar de E. coli.
    1. Esticar bactérias para colônias únicas na placa de ágar LB a partir de um estoque congelado de glicerol.
    2. Cultivar a cultura a 37 °C durante a noite.
    3. Inocular caldo LB líquido com uma única colônia por inoculação.
    4. Agitar a ~250 rpm a 37 °C por 12-16 h.

4. Aplicação de revestimento de ácido palmítico na microbandeja

NOTA: O ácido palmítico serve como uma barreira aversiva para impedir a fuga de animais dos poços individuais. O revestimento é aplicado em toda a superfície inferior da microbandeja, com exceção das superfícies internas dos poços. Nistatina é adicionada ao ácido palmítico para mitigar a contaminação fúngica. Esta etapa pode ser concluída 1 dia antes do início do experimento, se desejado.

  1. Ajuste o banho de contas a 80 °C para dar tempo de pré-aquecer.
  2. Imediatamente antes da utilização, aliquotar 1 ml da solução de trabalho de ácido palmítico por microbandeja num recipiente estéril separado (normalmente um frasco cónico de 15 ml) e adicionar 4 μL de 10.000 unidades/ml de nistatina por 1 ml de solução de ácido palmítico antes do aquecimento.
  3. Borrifar dentro e fora da microbandeja com etanol (70% ou maior) até a saturação e sacudir o excesso de etanol.
    NOTA: O etanol residual deve evaporar durante o tratamento em reticulação UV (passo 4.4).
  4. Use um reticulante UV para esterilizar a microbandeja (as seguintes instruções são para o reticulante UV usado neste estudo):
    1. Coloque a microbandeja e a tampa no reticulador UV separadamente (ou seja, não coloque as tampas nas placas, pois o UV não penetra no plástico).
    2. Feche a porta e ligue o reticulador UV.
    3. Pressione Time, digite 20 min e pressione Iniciar.
    4. Após 20 minutos, vire a placa e a tampa e repita os passos 4.2.2-4.2.3.
    5. Ao usar luvas, coloque as tampas na microbandeja para evitar contaminação após a esterilização.
  5. Misture bem a solução de trabalho de ácido palmítico por vórtice e inversão.
  6. Colocar o frasco para injetáveis cónico de 15 ml com a solução de trabalho de ácido palmítico no banho de contas e permitir que os cristais visíveis se dissolvam completamente antes da utilização.
  7. Coloque a microbandeja na borda ao redor do banho de contas com as tampas ligadas por ~2 min para aquecer.
  8. Remova a tampa da microbandeja. Adicione lentamente 200 μL de solução de trabalho de ácido palmítico através da parede traseira (lado longo) da microbandeja. Substitua as tampas e deixe a microbandeja descansar no banho de contas por 2-3 minutos para permitir que a solução de ácido palmítico se acomode no fundo da microbandeja.
    NOTA: Embora o fundo completo da microbandeja não seja completamente revestido até o passo 4.10, a solução deve se espalhar uniformemente por mais da metade da superfície inferior. Se a solução de ácido palmítico não estiver se espalhando uniformemente, ligue um vórtice ou motor vibratório perto da microbandeja. Isso fornecerá uma pequena quantidade de vibração que pode ajudar a permitir que a solução de ácido palmítico se espalhe mais facilmente. Mantenha as tampas da microbandeja no lugar para mitigar a contaminação.
  9. Repita a etapa 4.8.
    NOTA: Cerca de metade, ou mais, do fundo da microbandeja deve ser visivelmente coberto com o ácido palmítico líquido.
  10. Gire a microbandeja 180° e repita as etapas 4.8 e 4.9 do outro lado da bandeja.
    NOTA: O fundo da bandeja de Terasaki só será coberto com uma fina camada de solução de ácido palmítico após o volume total combinado ter sido adicionado a ambos os lados (passos 4.9 e 4.10). Mais ou menos mistura de ácido palmítico pode ser necessária dependendo da preparação da mistura, temperatura, e outros fatores. Geralmente, entre 400 a 800 μL da mistura de ácido palmítico serão suficientes para revestir todo o fundo da microbandeja. Assim que o fundo da microbandeja estiver visivelmente coberto, nenhum ácido palmítico adicional deve ser adicionado, pois isso pode contaminar os poços.
  11. Seque a bandeja em uma caixa de secagem estéril ou exaustor laminar por pelo menos 1 h descoberta. Alternativamente, conclua esta etapa no dia anterior ao carregamento das placas (seção 5), secando a microbandeja com a tampa ligada em RT por pelo menos 16 h.

5. Carregamento da microbandeja com meio de crescimento de nematoide de baixo derretimento (lmNGM)

NOTA: Este método utiliza NGM padrão misturado com agarose de baixo derretimento no lugar do ágar usual. O ágar pode começar a gelificar a 45 °C. Ao trabalhar com os pequenos volumes necessários para encher os poços da microbandeja, o NGM à base de ágar muitas vezes entope a ponta da pipeta e/ou produz superfícies irregulares do poço devido à rápida gelificação. NGM usando agarose de baixa fusão começa a gelificar a ~28 °C, permitindo que o meio fundido seja facilmente pipetado e consistentemente formando superfícies planas de poço. Prepare o lmNGM no mesmo dia em que os vermes devem ser colocados na microbandeja. Se preparar a microbandeja com lmNGM, semear com bactérias e carregar o C. elegans no mesmo dia, certifique-se de que os animais estejam na idade desejada ou perto dela antes de iniciar este conjunto de etapas.

  1. Coloque uma bacia de pipeta em um banho de contas a 80 °C para aquecer.
  2. Derreter uma pré-mistura de 10 mL de lmNGM por microbandeja que está sendo preparada (etapa 1.1) no micro-ondas por ~30-45 s.
    1. Coloque os tubos de ensaio de pré-mistura lmNGM em um copo de 200 mL, descoberto para que não tombar.
    2. Após ~10-15 s, ou quando a pré-mistura de lmNGM começar a borbulhar, pause o micro-ondas, despeje a pré-mistura de lmNGM em um copo estéril de 200 mL e retome o microwaving.
    3. Faça uma pausa conforme necessário para evitar que ferva e gire para misturar.
    4. Pare de microwaving uma vez que todo o lmNGM se transformou em líquido sem pedaços.
      NOTA: Uma única alíquota de 10 mL é suficiente para preencher um total de 192 poços (duas microbandejas).
  3. Preparar o lmNGM adicionando os seguintes componentes na ordem listada à agarose de baixa fusão quente (os volumes são por 10 mL de agarose de baixa fusão): 250 μL de 25 mM KPi (pH 6), 10 μL de 1 M CaCl2, 10 μL de 1 M MgSO4 e 10 μL de 5 mg/mL de colesterol
    1. Se o pesquisador planeja examinar animais adultos ao longo do tempo e precisa evitar a reprodução, adicione também 10 μL de 50 mM de FUdR.
    2. Se estiver conduzindo um experimento de alimentação de RNAi usando a cepa comum de E. coli HT115 RNAi e plasmídeos RNAi associados, adicione também 5 μL de 50 mg/mL de carbenicilina (para selecionar o plasmídeo RNAi) e 12 μL de IPTG 1 mM (para induzir a expressão do RNA de fita dupla do plasmídeo RNAi).
      NOTA: Aditivos adicionais podem ser incluídos dependendo dos antibióticos seletivos e outros produtos químicos necessários para a fonte de alimento desejada. Drogas ou estressores químicos também podem ser adicionados ao lmNGM nesta fase. NGM e lmNGM contêm a mesma concentração final de NaCl, mas diferem na forma como o NaCl é adicionado ao meio. Para NGM, todo o NaCl é adicionado durante a preparação do meio (etapa 1.2). Para o lmNGM, é adicionada uma porção de NaCl durante a preparação do meio (passo 5.3) e uma porção com o alimento bacteriano (secção 6). A razão para essa mudança decorre do pequeno volume de mídia em cada poço de microbandeja. A adição de 5 μL de bactérias concentradas suspensas em LB a um poço contendo 20 μL de meio alterará substancialmente a composição nutricional do meio (adicionando os componentes do LB em um volume comparável). Para evitar isso, a bactéria é ressuspensa em uma solução de NaCl para remover os componentes LB, evitando o estresse osmótico sobre as bactérias. O NaCl adicionado ao meio é reduzido de acordo com o sal adicionado às bactérias.
  4. Despeje lmNGM na bacia de pipeta aquecida.
  5. Com a microbandeja em uma bancada, pipete 20 μL de lmNGM em cada microbandeja. Tampe a microbandeja ao reabastecer a pipeta para minimizar a contaminação.
    NOTA: Esta etapa é mais fácil com uma pipeta eletrônica de repetição.

6. Semeando os poços da microbandeja com alimento bacteriano

NOTA: 5 μL de 10x de alimento concentrado de uma cultura inoculada durante a noite é suficiente para alimentar um único C. elegans durante toda a sua vida útil.

  1. Transfira as bactérias da cultura noturna para um frasco cônico de 50 mL.
  2. Centrifugar a ~3.500 x g por 20 min.
  3. Remova o sobrenadante. Ressuspender a cultura bacteriana na concentração de 10x (1/10 volume da cultura original) com solução de NaCl 85 mM.
  4. Antes de adicionar bactérias aos poços, inspecione visualmente a microbandeja para garantir que o lmNGM sólido esteja completamente contido dentro de cada poço. Se algum lmNGM estiver pendurado na lateral de um poço, raspe o lmNGM em excesso com uma ponta de pipeta. Esse excesso de meios pode fazer com que o alimento esbarre em ácido palmítico se não for eliminado.
  5. Pipetar cuidadosamente 5 μL de cultura bacteriana concentrada de 10x na superfície do lmNGM em cada poço. Tente evitar que a cultura de bactérias passe pelo lado do poço e entre no ácido palmítico, pois isso atrairá vermes para deixar o poço.
  6. Deixe as microbandejas secarem em uma caixa de secagem estéril ou exaustor de fluxo laminar por ~35 min. Verifique a cada ~5 min e tome cuidado para não secar demais. Remova quando alguns poços estiverem visivelmente levemente molhados, pois os poços secarão ainda mais enquanto os nematoides estão sendo adicionados.

7. Fechar cada microbandeja dentro de uma placa de poço único

NOTA: Nesta seção, a microbandeja é montada dentro de uma placa padrão de poço único usando uma pastilha personalizada impressa em 3D e cercada por cristais absorvedores de água. A placa de poço único é então fechada e selada com Parafilm. Isso permite a troca de oxigênio, evitando a contaminação e mantendo umidade suficiente para evitar que o lmNGM seque ao longo de experimentos de várias semanas (experimentos de vida útil do verme podem durar de 6 a 8 semanas se examinarem mutações que prolongam a vida útil ou condições ambientais). Durante a preparação, certifique-se de cobrir a placa sempre que algo não for adicionado ativamente para minimizar a contaminação bacteriana ou fúngica.

  1. Esterilize uma placa de poço único e um adaptador e tampa impressos em 3D mergulhando cada um em uma solução de água sanitária a 10%. Enxágue abundantemente com água DI estéril. Seque com um apagar tarefa.
  2. Borrife a placa de poço único e o adaptador impresso em 3D e a tampa com solução de etanol a 70% ou mais e limpe com uma limpeza de tarefa. Deixe secar qualquer etanol residual ao ar.
    NOTA: A radiação UV também pode ser usada após água sanitária e etanol com os mesmos parâmetros da microbandeja, conforme descrito acima na etapa 4.4.
  3. Coloque a pastilha estéril impressa em 3D em uma placa estéril de poço único.
  4. Esterilizar a parte externa da microbandeja preparada pulverizando-a com etanol 70%.
  5. Coloque a microbandeja no adaptador impresso em 3D na placa de poço único.
  6. Descarte a tampa da microbandeja.
  7. Distribua generosamente cristais de água sobre o inserto impresso em 3D entre a parede externa da microbandeja e a parede interna da placa de poço único.
  8. Adicione imediatamente os vermes (secção 8) ou sele a microbandeja para utilizar no dia seguinte. Feche a tampa da bandeja e use um único pedaço de Parafilm para envolver todos os quatro lados para selar a microbandeja. Repita a etapa de vedação com Parafilm mais duas vezes para um total de três camadas.
  9. Depois de selar a microbandeja, deixe-a na bancada em RT por até 4 dias antes de adicionar as minhocas (seção 8).

8. Adicionando worms à microbandeja

NOTA: Um verme pode ser adicionado manualmente a cada poço transferindo animais das populações de vermes sincronizados com a idade (seção 2) usando uma picareta de platina. Transfira apenas animais na fase de vida desejada. Se o processo de transferência demorar mais de 1 h, o lmNGM nos poços de microbandeja pode dessecar. Transferir grupos de 10 a 20 vermes por vez pode acelerar essa etapa, mas é preciso alguma prática para liberar consistentemente apenas um único animal por poço.

  1. Adicione um nematoide por poço assim que atingirem a fase de vida desejada.
  2. Coloque a tampa de volta sobre a microbandeja ao retirar as minhocas da placa de origem para minimizar a contaminação.

9. Acabamento preparando o ambiente de cultura para uso a longo prazo

NOTA: As etapas abaixo são executadas para garantir que a mídia e os worms na microbandeja permaneçam hidratados durante a duração do experimento.

  1. Adicione ~40 μL da solução de detergente à tampa de um prato de poço único e use um lenço de tarefa para revestir uniformemente a tampa. Este revestimento evitará a condensação ao longo do tempo, uma vez que a placa é selada. Use lenços de limpeza de tarefa adicionais para espalhar a solução de detergente até que a visão através da tampa não seja distorcida (isso geralmente leva cerca de dois lenços de tarefa).
  2. Examine os cristais de água para garantir que ambos estejam nivelados com a borda superior da microbandeja e não transbordem. Se necessário, adicione ou remova cristais de água ao prato.
  3. Usando a abordagem a seguir, envolva a bandeja com Parafilm (três peças no total) para garantir que o selo Parafilm dure por muito tempo.
    1. Estique levemente o primeiro pedaço de Parafilm para cobrir dois lados da bandeja.
    2. Estique ligeiramente o segundo pedaço de Parafilm e cubra os restantes lados da bandeja.
    3. Estique a peça final de Parafilm e envolva totalmente todos os quatro lados da bandeja, cobrindo a primeira e a segunda peças de Parafilm. Uma microbandeja devidamente selada pode permanecer hidratada por ~2 meses.
      NOTA: Monitore a integridade do Parafilm a cada 1-2 semanas durante todo o experimento e substitua conforme necessário.
    4. Limpe a parte superior da bandeja com um lenço de limpeza, úmido com etanol 70%, para remover quaisquer impressões digitais.
  4. Rotule a placa de poço único usando fita adesiva. A microbandeja agora está pronta para geração de imagens e armazenamento de longo prazo para monitorar worms ao longo do tempo. Entre as sessões de imagem, mantenha a bandeja a 20 °C. A microbandeja pode ser aberta e lacrada várias vezes para dosagem de medicamentos ou outros procedimentos, mas deve ser minimizada para evitar contaminação e perda de umidade.

10. Imagem de vermes individuais em poços de microbandeja

NOTA: O objetivo deste protocolo é fornecer uma descrição detalhada de como preparar o ambiente de cultura de microbandeja. Uma vez preparados e povoados com vermes, os ambientes de cultura de worm único de microbandeja podem ser usados para monitorar longitudinalmente muitos fenótipos usando técnicas estabelecidas para cultura padrão em placas de Petri. A seção a seguir fornece instruções básicas para medir alguns fenótipos comuns. As imagens fluorescentes devem ser realizadas em microscópio vertical. A refração da luz através da bandeja de Terasaki é minimizada em uma sala escura.

  1. Tempo de vida: Meça o tempo de vida batendo suavemente na lateral ou no topo da placa ou acendendo uma luz azul brilhante na placa e observando cada animal. Marque um animal "morto" se ele não se mover dentro de alguns segundos. Repita esta tarefa a cada 1-3 dias até que todos os vermes tenham morrido.
    NOTA: O ambiente de cultura de microbandejas é compatível com sistemas que automatizam a coleta e análise de imagens para estimativa da vida útil14,19.
  2. Microscopia padrão: Execute imagens de campo claro (ou campo escuro) em poços individuais ou em toda a bandeja com uma câmera ou scanner de alta resolução. Esses dados de imagem podem ser usados para uma variedade de fenótipos, incluindo tamanho do animal 22,23,24, desenvolvimento 25, atividade 14,19 e tempo de vida.
  3. Microscopia fluorescente: Realizar imagens fluorescentes em poços individuais manualmente ou com um sistema de plataforma motorizada. As bandejas de poço único são compatíveis com adaptadores de placa multipoço padrão. O sinal-ruído é minimizado se o aparelho for colocado em uma caixa de parede preta.
    NOTA: Como os vermes são fotografados enquanto permanecem livres para rastrear, esse sistema de cultura é adequado para imagens de baixa resolução para capturar fluorescência de corpo inteiro e localização de tecido áspero de fluoróforos. Imagens de alta resolução e alta magnificação geralmente requerem que os animais sejam imobilizados para evitar movimentos. Embora deva ser possível aplicar topicamente um agente paralisante (por exemplo, azida sódica ou levamisol) em cada poço e prosseguir com imagens de maior resolução, isso impediria medições repetidas do mesmo verme em pontos de tempo posteriores. O sistema de cultura, como descrito, também não se destina a ser invertido, o que impede o uso de sistemas de microscópio invertido.
    1. Se o campo brilhante não estiver sendo utilizado para medir a vida útil e apenas a fluorescência estiver sendo capturada, meça a vida útil manualmente. Deixar a luz azul (usada para excitação GFP) no verme por 5 s fará com que o animal se mova. Se o animal não se moveu dentro de 5 s, considere o animal como morto.

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Resultados

O ambiente de cultura de worm único baseado em microbandeja descrito aqui pode ser usado para monitorar uma variedade de fenótipos, incluindo expectativa de vida e tempo de saúde, atividade e movimento, forma do corpo e geometria de rastejamento, e a expressão de biomarcadores fluorescentes transgenicamente expressos em animais individuais ao longo do tempo. O sistema de cultura de microbandejas é compatível com a análise da vida útil por meio de pontuação manual ou coleta de imagens e análise de imagens a jusante. Tal c...

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Discussão

Aqui, descrevemos um novo sistema de cultura que adapta microbandejas, originalmente desenvolvido para ensaios de tipagem de tecido de antígenos leucocitários humanos, para permitir o isolamento e caracterização de C. elegans únicos ao longo do tempo em um ambiente de meio sólido que é contextualmente semelhante ao NGM à base de ágar que é o padrão na pesquisa de C. elegans. Esse sistema é compatível com uma variedade de intervenções, incluindo restrição alimentar, tratamento medicamentoso exógeno, des...

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Divulgações

Os autores afirmam não ter conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NIH R35GM133588 para G.L.S., uma bolsa de treinamento NIHT32GM008659 para L.E., um Prêmio Catalisador da Academia Nacional de Medicina dos Estados Unidos para G.L.S. e o Fundo de Iniciativa de Tecnologia e Pesquisa do Estado do Arizona administrado pelo Conselho de Regentes do Arizona.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Inserções terasaki impressas em 3DEmpresa de impressão personalizadaRobot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		Impressão FDM, tamanho do bico 0,6 mm usando PLA padrão mais filamento
AirClean sistemas AC624LF capela de fluxo laminar verticalFisher Scientific36-100-4376
Bacto peptonaThermo Scientific211677
CaCl2 Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2Cepa selvagem
CarbenicilinaGoldbioC-103-25
ColesterolICN Biomedicals Inc101380
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Alimento padrão de laboratório para C. elegans
EtanolMilliporeex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR Research ProductsInternational F10705-1.0
Cristais de água hidratantes M2 Polymer TechnologiesTipoS Polímero super absorvente Tipo S
Isopropil ß-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KimwipesKimTech34155Toalhetes de tarefa
LB Caldo, LennoxBD Difco240230
Câmera monocromática Leica K5 sCMOSLeica Microsystems11547112
Leica M205 FCA Microscópio Estéreo FluorescenteLeica Microsystems10450826
Agarose de baixo ponto de fusãoProducts InternationalA20070-250.0
MgSO4 Fisher ChemicalM-8900
NaClBiorreagentes FisherBP358-1
Nunc OmniTray Placa de Poço ÚnicoThermo Scientific264728
NistatinaSigmaN1538
Ácido palmíticoAcros orgânicos129700010
Toalhas de papelCoastwide Professional365374
Parafilm MParafilm16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075UV crosslinker
Bandejas Terasaki (Lambda)Uma Lambda151431
Thermolyne Dri-bathThermolyneDB28125
Tween Thermo ScientificJ20605-AP
Research

Referências

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