Cultura de Longo Prazo de Caenorhabditis elegans Individuais em Meio Sólido para Monitoramento Longitudinal de Fluorescência e Intervenções Aversivas

Luis Espejo; Bradford Hull; Leah M. Chang; Destiny DeNicola; Samuel Freitas; Vanessa Silbar; Anne Haskins; Emily A. Turner; George  L. Sutphin

doi:10.3791/64682

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Artigo de método

Cultura de Longo Prazo de Caenorhabditis elegans Individuais em Meio Sólido para Monitoramento Longitudinal de Fluorescência e Intervenções Aversivas

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DOI:

10.3791/64682

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2 de dezembro de 2022

Luis Espejo^*¹ , Bradford Hull^*¹ , Leah M. Chang¹ , Destiny DeNicola¹ , Samuel Freitas¹ , Vanessa Silbar¹ , Anne Haskins¹ , Emily A. Turner¹ , George L. Sutphin¹

¹Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para cultura de isolados de nematoides individuais em meio sólido para rastreamento de parâmetros fisiológicos ao longo da vida e quantificação de fluorescência. Este sistema de cultura inclui uma barreira de ácido palmítico ao redor de poços de verme único para evitar a fuga de animais, permitindo o uso de intervenções aversivas, incluindo bactérias patogênicas e estressores químicos.

Resumo

Caenorhabditis elegans são amplamente utilizados para estudar a biologia do envelhecimento. A prática padrão em estudos de envelhecimento de C. elegans é cultivar grupos de vermes em meios de crescimento de nematoides sólidos (NGM), permitindo a coleta eficiente de dados em nível populacional para sobrevivência e outros fenótipos fisiológicos, e amostragem periódica de subpopulações para quantificação de biomarcadores fluorescentes. As limitações dessa abordagem são a incapacidade de (1) acompanhar vermes individuais ao longo do tempo para desenvolver trajetórias etárias para fenótipos de interesse e (2) monitorar biomarcadores fluorescentes diretamente no contexto do ambiente de cultura. Abordagens de cultura alternativa usam cultura líquida ou microfluídica para monitorar animais individuais ao longo do tempo, em alguns casos incluindo quantificação de fluorescência, com a compensação de que o ambiente de cultura é contextualmente distinto do NGM sólido. O WorMotel é um dispositivo multipoço microfabricado previamente descrito para o cultivo de vermes isolados em NGM sólido. Cada verme é mantido em um poço contendo NGM sólido cercado por um fosso preenchido com sulfato de cobre, um repelente de contato para C. elegans, permitindo o monitoramento longitudinal de animais individuais. Achamos o sulfato de cobre insuficiente para evitar que vermes fujam quando submetidos a intervenções aversivas comuns em pesquisas sobre envelhecimento, incluindo restrição alimentar, bactérias patogênicas e agentes químicos que induzem estresse celular. Os dispositivos multipoços também são moldados a partir de polidimetilsiloxano, que produz artefatos de alto fundo em imagens de fluorescência. Este protocolo descreve uma nova abordagem para o cultivo de lombrigas isoladas em NGM sólido usando microbandejas de poliestireno disponíveis comercialmente, originalmente projetadas para tipagem de antígenos leucocitários humanos (HLA), permitindo a medição da sobrevivência, fenótipos fisiológicos e fluorescência ao longo da vida. Uma barreira de ácido palmítico impede que os vermes fujam, mesmo na presença de condições aversivas. Cada placa pode cultivar até 96 animais e se adapta facilmente a uma variedade de condições, incluindo restrição alimentar, RNAi e aditivos químicos, e é compatível com sistemas automatizados para coletar dados de vida útil e atividade.

Introdução

C. elegans é um poderoso organismo modelo para pesquisas em genética, biologia celular e biologia molecular, pois são facilmente cultivadas em laboratório, têm curto tempo de geração e vida útil, compartilham alto grau de homologia proteica com mamíferos e possuem estrutura corporal transparente que permite a visualização in vivo de proteínas fluorescentes e corantes¹. Como resultado do uso de longa data de C. elegans como um sistema modelo principal em uma variedade de campos, incluindo biologia do desenvolvimento e envelhecimento, seu crescimento e desenvolvimento são bem compreendidos, seu genoma foi totalmente seq....