É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Preparação de Suspensão de Célula Única do Intestino de Tilápia do Nilo para Sequenciamento de Célula Única

2.5K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/64688

⸱

10 de fevereiro de 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery, Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science, Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, demonstramos a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia para sequenciamento unicelular.

Resumo

A tilápia-do-nilo é uma das espécies de peixes de água doce mais cultivadas em todo o mundo e é um modelo de pesquisa amplamente utilizado para estudos de peixes de aquicultura. A preparação de suspensões unicelulares de alta qualidade é essencial para estudos em nível de célula única, como RNA de célula única ou sequenciamento genômico. No entanto, não existe um protocolo pronto para uso para espécies de peixes de aquicultura, particularmente para o intestino da tilápia. As enzimas de dissociação efetivas variam dependendo do tipo de tecido. Portanto, otimizar o protocolo de dissociação tecidual selecionando a enzima ou combinação enzimática apropriada para obter células viáveis suficientes com o mínimo de dano é essencial. Este estudo ilustra um protocolo otimizado para preparar uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia do Nilo com uma combinação enzimática de colagenase/dispase. Esta combinação é altamente eficaz para dissociação com a utilização de albumina de soro bovino e DNase para reduzir a agregação celular após a digestão. A produção celular satisfaz os requisitos para sequenciamento unicelular, com 90% de viabilidade celular e alta concentração celular. Este protocolo também pode ser modificado para preparar uma suspensão unicelular do intestino de outras espécies de peixes. Esta pesquisa fornece um protocolo de referência eficiente e reduz a necessidade de ensaios adicionais na preparação de suspensões unicelulares para espécies de peixes de aquicultura.

Introdução

As células são as unidades fundamentais dos organismos. Comparados a estudos de tecidos volumosos, estudos em nível de célula única podem refletir a heterogeneidade celular e fornecer informações de maior resolução1. Nos últimos anos, pesquisadores têm aplicado tecnologias de sequenciamento unicelular para estudos genômicos, transcriptomas, epigenomas ou multi-ômicos em nível unicelular em mamíferos, peixes-zebra e outros organismos modelo e relatado grandes avanços 2,3,4,5,6,7 . Embora a maioria dos estudos tenha se concentrado em organismos-modelo, há poucos protocolos de referência ou kits comerciais de dissociação para sequenciamento unicelular em espécies econômicas de peixes, o que limita a aplicação do sequenciamento unicelular em pesquisas aquícolas. Portanto, o desenvolvimento de protocolos de dissociação tecidual que produzam suspensões unicelulares de alta qualidade com alta viabilidade celular e integridade de ácidos nucleicos é crucial.

A otimização do protocolo de dissociação tecidual com a combinação enzimática ou enzimática apropriada para obter células viáveis suficientes com o mínimo de dano é essencial. A enzima mais eficaz para a dissociação tecidual varia de acordo com o tipo de tecido. Em mamíferos, várias enzimas têm sido utilizadas para preparar suspensões unicelulares para tecidos sólidos de mamíferos, incluindo colagenase, dispase, tripsina, papaína, elastase, hialuronidase, liberase, accutase e tripLE 8,9. A digestão de tripsina combinada com ruptura mecânica tem sido comumente utilizada para dissociar tecidos para cultura celular em peixes 10,11,12,13,14. A tripsina também tem sido usada ou adicionada ao coquetel de digestão para dissociação tecidual no intestino de ratos15 e tecido branquial de peixe-zebra16. No entanto, por várias razões, a tripsina não é a melhor opção para o sequenciamento unicelular. A tripsina isolada é geralmente ineficaz para a dissociação tecidual. Adicionalmente, a tripsina induz quebras de fitas de DNA 17,18 e degradação de RNA19.

A papaína degrada as proteínas que compõem as tight junctions entre as células. Em células nervosas e musculares lisas de mamíferos, a papaína é mais eficiente e menos destrutiva que outras proteases20,21. Entretanto, assim como a tripsina, a papaína resulta na agregação celular induzida pelo DNA livre devido à lise celular que ocorre durante a digestão enzimática9. A elastase decompõe a elastina, que é tipicamente encontrada na pele, pulmões, ligamentos, tendões e tecidos vasculares22. É frequentemente usado em combinação com colagenase, dispase ou tripsina para dissociar o tecido pulmonar8. A hialuronidase cliva as ligações glicosídicas do hialuronano, contribuindo para a digestão da matriz extracelular em vários tecidos conjuntivos e pele 9,23.

Em geral, colagenase e dispase são boas opções para a quebra da matriz extracelular. Eles têm sido utilizados na dissociação dos intestinos de humanos, camundongos e peixes-zebra24,25,26,27. A colagenase destrói a ligação peptídica no colágeno, promove a digestão da matriz extracelular e libera as células em suspensão, e, assim, a colagenase é frequentemente utilizada para dissociação de tecidos sólidos humanos e de camundongos, inclusive para o fígado 28,29, baço30, pâncreas31 e intestino 25. Dispase é uma protease que hidrolisa as ligações peptídicas N-terminais de resíduos de aminoácidos apolares e é mais suave que a colagenase. Cliva os componentes da matriz extracelular, como fibronectina, colágeno tipo IV e, em menor grau, colágeno tipo I, sem afetar as junções célula-célula. Dispase é usado separadamente ou com outras enzimas para dissociação tecidual, como intestino25,32, cérebro33, fígado34, etc. Além disso, coquetéis de digestão comercialmente disponíveis, incluindo liberase, accutase e triple, também são boas alternativas para a dissociação de tecidos sólidos, especialmente para pele, fígado e rins 8,9.

A tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) pertence à família Cichlidae da ordem Perciformes. É uma das espécies de peixes de água doce mais cultivadas em áreas tropicais e subtropicais, com uma produção anual de 4,5 milhões de toneladas em 202235. É uma das espécies de peixes de aquicultura mais bem estudadas com um genoma bem anotado. A tilápia-do-nilo é um modelo de pesquisa ideal para espécies de peixes aquícolas devido ao seu curto tempo de geração, facilidade de criação e adaptabilidade a uma ampla gama de ambientes de criação. O intestino é de grande interesse de pesquisa, pois é o órgão da digestão e absorção da nutrição, metabolismo e imunidade das mucosas. O intestino é o habitat das populações microbianas e é um tecido imune essencial36. É imunologicamente ativo devido à presença de numerosos tipos de células imunes, incluindo macrófagos, células B, granulócitos e células T.

No presente estudo, desenvolvemos um protocolo para preparar uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino da tilápia do Nilo para facilitar estudos em nível unicelular em espécies de peixes de aquicultura. De acordo com as características dessas enzimas tecido-específicas e trabalhos preliminares, a colagenase/dispase é apropriada para dissociar o tecido intestinal da tilápia. O último tipo enzimático a ser considerado no preparo de suspensões unicelulares é a DNase-I, que impede a agregação celular degradando o DNA livre liberado pela lise de células mortas durante a digestão enzimática sem iniciar vias apoptóticas9 e aumenta o rendimento de células vivas36. Além disso, a albumina de soro bovino (BSA) é adicionada ao tampão de lavagem para reduzir a aglomeração celular e melhorar a viabilidade celular. Várias empresas de reagentes descrevem a BSA como um estabilizador enzimático. A adição de BSA 0,04%-1% ao PBS (phosphate-buffered saline) tem sido utilizada para desenvolver uma solução de lavagem para o preparo de suspensões de sequenciamento unicelular sem efeitos adversos38. A adição de uma baixa proporção de BSA poderia ajudar a manter a viabilidade celular e evitar a agregação livre induzida por DNA de células devido à lise celular. Este protocolo também pode fornecer uma referência valiosa para o desenvolvimento de protocolos de dissociação celular do intestino de outras espécies de peixes de aquicultura.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os protocolos em animais durante este estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Hainan (número do protocolo: HNUAUCC-2022-00063; Data de aprovação: 03/03/2022). Uma lista dos equipamentos e insumos utilizados neste experimento pode ser encontrada na Tabela de Materiais. Um resumo do protocolo atual é ilustrado na Figura 1.

1. Preparo do peixe

  1. Obter tilápia do Nilo com 6 meses de idade com peso corporal médio de 100 g de fonte confiável. Selecione peixes que estejam livres de quaisquer sinais de doença.
  2. Pare de alimentar os peixes 24 h antes de prosseguir para a próxima etapa.
    OBS: O jejum de peixes reduz o volume do conteúdo intestinal e facilita o preparo dos segmentos intestinais.
  3. Enxágue o peixe em água estéril bem aerada por 15 minutos para lavar as bactérias soltas na superfície corporal.
  4. Eutanasiar os peixes com 300 mg/L de metanossulfonato de tricaína (MS-222) por cerca de 10 min até que todo o movimento pare.

2. Preparação dos reagentes

  1. Preparar solução salina tamponada com fosfato BSA-Dulbecco a 0,08% (BSA-DPBS, para lavagem e resussão celular). Dissolver 0,08 g de BSA (0,8% p/v) em 100 mL de 1x DPBS. Conservar a 4 °C e pré-arrefecer no gelo quando utilizado.
    NOTA: A adição de BSA é benéfica para minimizar a aglomeração celular. A razão BSA pode ser aumentada de 0,04% para 1% de acordo com as condições de aglomeração celular.
  2. Preparar o reagente de dissociação enzimática celular.
    1. Diluir a colagenase/dispase com 1x PBS até uma concentração final de 1 mg/mL (0,1 U/mL colagenase e 0,8 U/mL dispase). Certifique-se de que o PBS e não o DPBS sejam usados.
      NOTA: PBS fornece os íons de cálcio necessários para que a enzima funcione corretamente. DPBS não deve ser usado nesta etapa porque é Ca 2+/Mg2+ livre. Além disso, a colagenase tipo I é utilizada no protocolo atual.
    2. Filtrar a diluição através de um filtro de membrana estéril de 0,22 μm.
    3. Preparar um reagente de dissociação celular composto por um volume de 95% de solução de colagenase/dispase e um volume de 5% de soro fetal bovino (SFB).
      NOTA: O reagente de dissociação deve ser renovado sempre que for utilizado. Usando 5% FBS ajuda a manter a viabilidade celular durante a digestão.
  3. Prepare a solução de azul de tripano.
    1. Tome a solução de azul de tripano do frigorífico a 4 °C e mantenha-a a 15-20 °C durante alguns minutos antes de utilizar para evitar precipitação.
    2. Filtrar a solução através de uma membrana estéril de 0,22 μm.

3. Preparação do equipamento

  1. Pré-resfriar a centrífuga refrigerada a 4 °C antes de usar.
  2. Obter tubos de centrífuga estéreis de 1,5 mL sem RNase, tubos cônicos de 50 mL, pipetas e pontas de vidro de furo largo, filtros de membrana, filtros de células e todos os tubos e pontas de baixa retenção.
  3. Pipetas de vidro de autoclave e ferramentas de dissecção, incluindo pinças, tesouras e bisturis, e pré-tratá-las com a solução de remoção de RNase para prevenir os efeitos adversos da RNase para RNA-seq de célula única.

4. Dissecção tecidual e dissociação celular

  1. Coloque o peixe eutanasiado no gelo para dissecção. Assepticamente, colete 3-4 cm da seção média do intestino e excise o máximo de gordura e mesentério possível. Remova cuidadosamente a gordura aderida à superfície intestinal e a camada de mucosa clara elástica e maleável com pinças.
    NOTA: A gordura e o mesentério estão ligados à superfície externa do intestino.
  2. Remova o máximo de gordura possível para evitar seus efeitos adversos no protocolo de dissociação. Usando uma seringa, lave suavemente os fragmentos com PBS gelado estéril várias vezes para lavar o conteúdo intestinal e o muco. Evite manuseio áspero.
  3. Disseque o segmento do intestino em pequenos pedaços e transfira-os para um tubo de 1,5 mL preenchido com 1 mL de PBS gelado.
  4. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante delicadamente e substitua por 1 mL de BSA-DPBS 0,08% gelado. Ressuspender os fragmentos de tecido por aspiração suave usando uma pipeta de vidro. Repita esta etapa duas vezes.
  5. Remover o sobrenadante e digerir os fragmentos de tecido usando 1 mL do reagente de dissociação enzimática (950 μL de solução de colagenase/dispase e 50 μL de SFB) em banho-maria a 37 °C por 30-60 min.
    1. Além disso, adicionar 5 μL de inibidor de RNase (40 U/μL na solução reserva) ao reagente de dissociação se as amostras estiverem preparadas para o sequenciamento de RNA de célula única.
      NOTA: A concentração final da mistura colagenase/dispase é de 1 mg/mL, incluindo colagenase a 0,1 U/mL e dispase a 0,8 U/mL.
  6. Inverta manualmente o tubo em intervalos de 5 min durante o banho de água de 30-60 min.
    NOTA: O tempo exato de incubação varia de acordo com os tecidos utilizados. Verifique o progresso da dissociação sob um microscópio até que nenhum tecido volumoso seja visto. Coloque 10 μL da suspensão celular em uma lâmina de vidro com uma pipeta e examine-a ao microscópio. Aumente o tempo de digestão se as células não estiverem completamente dissociadas.
  7. Gire os tubos a 300 × g por 5 min a 4 °C e remova suavemente o reagente de dissociação enzimática celular usando pontas largas. Adicione 1 mL de BSA-DPBS 0,08% gelado e pipete suavemente as células para cima e para baixo usando uma pipeta de vidro de furo largo por 1 min.
    1. Repita esta etapa duas vezes.
      NOTA: A pipetagem para cima e para baixo deve ser realizada com cuidado usando pontas de furo largo e baixa retenção para evitar a ruptura celular.
  8. Pré-umedeça um filtro celular de 40 μm com BSA-DPBS a 0,08% e coloque-o em um tubo cônico de 50 mL. Passe a suspensão da célula através do filtro. Bata e enxágue com um DPBS adicional de 200 μL e recolha a suspensão no fundo do tubo.
  9. Transfira a suspensão para um tubo de 1,5 mL. Adicionar 5 μL de DNase I (1 U/μL) e incubar durante 15 min a 15-20 °C. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
  10. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet de células em 400 μL de DPBS gelado (Ca 2+/Mg2+ livre). Pipetar suavemente para cima e para baixo com pontas largas para misturar as células. Repita esta etapa duas vezes.

5. Coloração e exame microscópico

  1. Para a coloração, misturar a suspensão celular com solução de azul de tripano a 0,4% na proporção de 1:1. Incubar durante 3 minutos à temperatura ambiente.
  2. Adicione 5-10 μL da mistura em um hemocitômetro e examine ao microscópio.
    NOTA: As células viáveis terão citoplasma não corado, enquanto as células mortas terão um citoplasma azul (Figura 2).
  3. Conte as células viáveis e mortas em três campos diferentes sob o microscópio. Calcule a porcentagem de viabilidade celular dividindo o número de células viáveis pelo número total de células em um campo.
    NOTA: A viabilidade celular deve ser superior a 85% e a concentração celular não deve ser inferior a 1 x 105-1 x 107/mL. O fundo da suspensão celular deve estar limpo, sem aglomerações, fragmentos ou impurezas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Este protocolo descreve a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia-do-nilo para sequenciamento unicelular (Figura 1). Esta pesquisa mostra que a mistura colagenase/dispase tem um bom efeito de dissociação e é leve para o tecido intestinal. A seleção da enzima de digestão ideal é essencial para preparar uma suspensão de célula única de alta qualidade. No trabalho preliminar, as eficiências de dissociação de várias enzimas comumente usadas foram comparad...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este protocolo descreve a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia do Nilo. Antes da dissociação, a remoção de gordura e mesentério do intestino é necessária, particularmente para intestinos de peixes carnívoros com muita gordura. Usar uma seringa em vez de raspagem dura para lavar o conteúdo intestinal reduz os danos mecânicos às células. Para garantir a viabilidade celular, também é essencial manter a temperatura em 20 °C ou abaixo para as etapas de dissecção e enxágue do tecido....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer o apoio da Fundação Provincial de Ciências Naturais de Hainan da China (NO. 320QN211) e do Programa de Fundo de Pesquisa do Laboratório Chave da Província de Guangdong de Controle de Doenças de Animais Aquáticos e Cultura Saudável da China (NO. PBEA2021ZD01).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0.22-μ m Filtro estérilSolarbio Life SciencesSLGV033RBÉ usado para filtrar e esterilizar a solução enzimática.
40-μ m Filtro de CélulasF8200Solarbio Life Sciencesé aplicado para eliminar pedaços de tecido não digeridos.
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichSRE0098Powder; diluir 0,04 g BSA com 100 mL 1 &vezes; DPBS para preparar 0,04% BSA-DPBS lavagem bffer. Armazene a 2 - 8 °C.
Colagenase IISangon BiotechA004202Diluir com PBS até uma concentração final de 1 mg/mL.
Colagenase/dispaseRoche10269638-001Diluir com PBS até uma concentração final de 1 mg/mL.
DiluaSigma-AldrichD4818com PBS até uma concentração final de 1 mg / mL.
DNase ISigma-AldrichAMPD1DNase I ajuda a reduzir a aglomeração celular.
Solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco, Ca2+/Mg2+-freeSolarbio Life SciencesE607009-0500Armazene em temperatura ambiente.
ElastaseSangon BiotechA600438Diluir com PBS até uma concentração final de 0,5 mg/mL.
Soro fetal bovino (FBS)Gibco16000-044Serum, utilizado em volume de 5% em solução de desinfecção.
Invertido  MicroscópioLeicaqTOWER3GÉ usado para examinar a viabilidade celular.
LiberaseRoche5401119001Diluir com PBS até uma concentração final de 0,25 mg / mL.
Tilpia do Nilo (Oreochromis niloticus)ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.NAPeixes saudáveis sem sinais de doença (Peso corporal médio: 100 g). 
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Solarbio Life SciencesP1020Armazenar em temperatura ambiente.
Centrífuga RefrigeradaEppendorf5424É usada para girar o tecido e o peteto celular.
Inibidor de RNaseNEBM0314LInibir a atividade da RNase
Reagente RNase-Be-Gone de fase sólidaSangon BiotechB644201-0050É usado para remover a RNase de ferramentas como tesouras de dissecação e pipetas de vidro. Armazene em temperatura ambiente.
Tricaine methanesulfonate (MS-222)Sigma-AldrichE10521Para eutanásia de peixes. 
Trypan BlueInvitrogenC0040É usado para colorir células mortas.
TripsinaSangon BiotechE607001Diluir com PBS até uma concentração final de 1 mg / mL.
O Filtro de Células da

Referências

  1. Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
  2. He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
  3. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
  4. Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
  5. Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
  6. Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
  7. Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
  9. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
  10. Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
  11. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159(2018).
  12. Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
  13. Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
  14. Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
  15. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  16. Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144(2022).
  17. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36(2010).
  18. Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
  19. Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
  20. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  21. Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
  22. Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
  23. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
  24. Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
  25. Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
  26. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
  27. Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
  28. Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
  29. Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
  30. Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355(2021).
  31. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  32. Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  33. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30(2016).
  34. Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961(2022).
  35. FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).
  36. Beck, B. H., Peatman, E. Mucosal Health in Aquaculture. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).
  37. Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
  38. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144(2020).
  39. Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
  40. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130(2020).
  41. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  42. Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
  43. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Dissociação TecidualCollagenase DispaseViabilidade CelularEspécies de Peixes de AquiculturaDigestão EnzimáticaCoador de CélulasColoração com Azul Trypan
Preparação de Suspensão de Célula Única do Intestino de Tilápia do Nilo para Sequenciamento de Célula Única
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.