Artigo de método

Uma plataforma microfluídica para o estudo do bioentupimento em meios porosos

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DOI:

10.3791/64689

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13 de outubro de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, Institute of Environmental Engineering, ETH Zurich, 2Department Water Resources and Drinking Water, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve uma plataforma microfluídica para estudar o desenvolvimento de biofilme em meios porosos quase-2D, combinando imagens de microscopia de alta resolução com medidas simultâneas de diferença de pressão. A plataforma quantifica a influência do tamanho dos poros e das taxas de fluxo de fluido em meios porosos no bioentupimento.

Resumo

Biofilmes bacterianos são encontrados em diversos meios porosos ambientais e industriais, incluindo solos e membranas de filtração. Os biofilmes crescem sob certas condições de fluxo e podem obstruir os poros, redirecionando assim o fluxo de fluido local. A capacidade dos biofilmes de obstruir os poros, o chamado bioentupimento, pode ter um tremendo efeito sobre a permeabilidade local do meio poroso, criando um acúmulo de pressão no sistema e impactando o fluxo de massa através dele. Para entender a interação entre o crescimento do biofilme e o fluxo de fluido sob diferentes condições físicas (por exemplo, em diferentes velocidades de fluxo e tamanhos de poros), no presente estudo, uma plataforma microfluídica é desenvolvida para visualizar o desenvolvimento do biofilme usando um microscópio sob condições físicas controladas e impostas externamente. O acúmulo de pressão induzido pelo biofilme no meio poroso pode ser medido simultaneamente com o uso de sensores de pressão e, posteriormente, correlacionado com a cobertura superficial do biofilme. A plataforma apresentada fornece uma linha de base para uma abordagem sistemática para investigar o bioentupimento causado por biofilmes em meios porosos sob condições de fluxo e pode ser adaptada para estudar isolados ambientais ou biofilmes multiespécies.

Introdução

Os biofilmes - colônias bacterianas embutidas em uma matriz autosecretada de substâncias extrapoliméricas (EPS) - são onipresentes em meios porosos naturais, como solos e aquíferos1, e aplicações técnicas e médicas, como biorremediação2, filtração de água3 e dispositivos médicos4. A matriz do biofilme é composta por polissacarídeos, fibras proteicas e DNA extracelular5,6 e depende fortemente dos microrganismos, da disponibilidade de nutrientes e das condições ambientais7. No entanto, as funções da matriz são universais; Forma o arcabouço da estrutura do biofilme, protege a comunidade microbiana de estresses mecânicos e químicos e é o grande responsável pelas propriedades reológicas dos biofilmes5.

Em meios porosos, o crescimento de biofilmes pode obstruir os poros, causando o chamado bioentupimento. O desenvolvimento do biofilme é controlado pelo fluxo de fluido e tamanho dos poros, definidos como a distância que separa dois pilares, do meio poroso 8,9,10. Tanto o tamanho dos poros quanto o fluxo de fluido controlam o transporte de nutrientes e as forças de cisalhamento locais. Por sua vez, o biofilme crescente obstrui os poros, afetando a distribuição de velocidade do fluido 11,12,13, o transporte de massa e a condutividade hidráulica do meio poroso 14,15. As mudanças na condutividade hidráulica são refletidas através do aumento da pressão em sistemas confinados16,17,18,19. Os estudos microfluídicos atuais em desenvolvimento de biofilme e bioentupimento concentram-se no estudo do impacto das velocidades de fluxo em geometrias homogêneas16,20 (isto é, com tamanho de poro singular) ou meios porosos heterogêneos12,21,22. No entanto, para desvendar os efeitos das vazões e do tamanho dos poros no desenvolvimento do biofilme e as consequentes mudanças de pressão no meio poroso bioentupido, é necessária uma plataforma experimental altamente controlável e versátil que permita o estudo de diferentes geometrias de meios porosos e condições ambientais em paralelo.

O presente estudo introduz uma plataforma microfluídica que combina medidas de pressão com imagens simultâneas do biofilme em evolução dentro do meio poroso. Devido à sua permeabilidade a gás, biocompatibilidade e flexibilidade no projeto da geometria do canal, um dispositivo microfluídico feito de polidimetilsiloxano (PDMS) é uma ferramenta adequada para estudar o desenvolvimento de biofilme em meios porosos. A microfluídica permite o controle das condições físicas e químicas (por exemplo, fluxo de fluidos e concentração de nutrientes) com alta precisão para mimetizar o ambiente de habitats microbianos23. Além disso, os dispositivos microfluídicos podem ser facilmente fotografados com resolução micrométrica usando um microscópio óptico e acoplados a medições on-line (por exemplo, a pressão local).

Neste trabalho, os experimentos se concentram em estudar o impacto do tamanho dos poros em um meio poroso homogêneo análogo sob condições controladas de escoamento imposto. O fluxo de um meio de cultura é imposto usando uma bomba de seringa, e a diferença de pressão através do canal microfluídico é medida simultaneamente com sensores de pressão. O desenvolvimento do biofilme é iniciado pela semeadura de uma cultura planctônica de Bacillus subtilis no canal microfluídico. Imagens regulares do biofilme em evolução e análise de imagens permitem obter informações resolvidas em escala de poros na cobertura da superfície sob várias condições experimentais. As informações correlacionadas da mudança de pressão e a extensão do bioentupimento fornecem subsídios cruciais para estimativas de permeabilidade de meios porosos bioentupidos.

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Protocolo

1. Preparação do wafer de silício

  1. Projetar as geometrias do canal microfluídico em software de projeto assistido por computador (CAD; ver Tabela de Materiais) e imprimi-lo em um filme transparente para criar a fotomáscara (Figura 1A).
  2. Fabricar o molde mestre por litografia suave (em condições de sala limpa) seguindo os passos abaixo.
    1. Asse a bolacha de silicone a 200 °C por 2 h.
    2. Coloque o wafer no centro de um spin-coater e despeje o fotorresiste SU8 3050 (consulte a Tabela de Materiais) sobre o wafer. Spin coat a 1.700 rpm por 40 s com um tempo de rampa de 10 s/100 rpm.
      NOTA: Os parâmetros de spin-coating foram ajustados para obter uma espessura alvo de 100 μm para o SU8 3050.
    3. Após o processo de spin-coat, leve ao forno de silício a 65 °C por 600 s e 95 °C por 2.700 s. Deixe a bolacha esfriar em temperatura ambiente durante a noite.
      NOTA: O arrefecimento noturno aumenta a aderência do SU8 ao wafer.
    4. Colocar a fotomáscara (passo 1.1) sobre o wafer e expô-lo à luz UV, com uma energia de exposição de 250 mJ/cm2 e um comprimento de onda de 350 nm.
    5. Após a exposição, asse o substrato exposto a 65 °C por 60 s e 95 °C por 300 s.
    6. Desenvolva o wafer de silício para obter o molde mestre mergulhando-o em um copo preenchido com o revelador mrDev600 (consulte Tabela de Materiais). Agite suavemente o copo por 1.800 s para lavar a resistência não polimerizada. Em seguida, lave com salpicos borrifando isopropanol no wafer de silicone e seque ao ar.
    7. Leve ao forno duro o wafer de silicone a 200 °C por 1.800 s.
  3. Silanizar o molde mestre através da deposição de vapor de 20 μL de silano Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) (ver Tabela de Materiais) colocado em uma lâmina de vidro ao lado do molde por 40 min em um dessecador a vácuo, criando uma pressão manométrica de 100 mbar.

2. Fabricação do dispositivo microfluídico

NOTA: O procedimento de fabricação descrito aqui é para um dispositivo microfluídico com um canal microfluídico. No entanto, o mesmo método pode ser aplicado para fabricar um dispositivo microfluídico com múltiplos canais microfluídicos em paralelo.

  1. Misture o elastômero com seu reticulante na proporção de 10:1 (ver Tabela de Materiais) para preparar uma mistura de PDMS. Mexa a mistura até que fique uniformemente misturada e fique opaca devido às bolhas de ar fechadas.
  2. Desgaseifique a mistura em um dessecador a vácuo, criando uma pressão manométrica de 100 mbar até que as bolhas de ar aprisionadas sejam removidas e ela pareça transparente. O tempo necessário para a desgaseificação é tipicamente de 30 min.
  3. Coloque o molde mestre (etapa 1) em uma placa de cultura de células (consulte a Tabela de Materiais). Despeje 20 g da mistura de PDMS sobre o molde mestre para produzir canais com espessura final de 5 mm.
  4. Asse a molde mestra a 70 °C por 2 h.
  5. Corte o PDMS curado ao redor do canal microfluídico (a uma distância de aproximadamente 3 mm) usando uma lâmina e, em seguida, descasque o canal microfluídico PDMS do molde mestre.
  6. Para criar a entrada e saída dos canais microfluídicos, faça orifícios com um punch de biópsia (diâmetro de 1,5 mm) em suas extremidades (topo dos triângulos, ver Figura 1A). Faça um furo adicional no centro do triângulo de entrada para instalar o sensor de pressão mais tarde.
  7. Lave uma lâmina de vidro e o canal microfluídico com uma solução de detergente a 1% disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) durante 5 minutos e, em seguida, enxágue-os com água deionizada. Em seguida, lavar o canal microfluídico do PDMS e a lâmina de vidro com isopropanol. Em seguida, enxágue-os novamente com água deionizada. Secar o canal microfluídico do PDMS e a lâmina de vidro com ar comprimido a 1 bar por 1 min.
    OBS: A estrutura porosa do PDMS deve estar completamente seca para que a colagem seja efetiva.
  8. Coloque a lâmina de vidro e o canal microfluídico num limpador de plasma (ver Tabela de Materiais) e certifique-se de que as superfícies a serem coladas estão viradas para cima. Ligue o limpador de plasma e trate o canal microfluídico e a lâmina de vidro com plasma de ar a um fluxo de ar de 1 SL/h (litro padrão por hora) por 1 min. Ligue o canal microfluídico à lâmina de vidro imediatamente após retirá-los do limpador, colocando-os em contato uns com os outros.
    NOTA: Certifique-se de não tocar nas superfícies tratadas, pois isso pode afetar a colagem. Ao fabricar um dispositivo microfluídico com múltiplos canais microfluídicos, exponha os canais microfluídicos simultaneamente e cole-os em uma única etapa.
  9. Colocar o dispositivo microfluídico ligado numa placa quente a 80 °C durante, pelo menos, 15 minutos.
  10. Armazenar o dispositivo microfluídico em uma placa de cultura de células limpa até o início do experimento.

3. Preparação da suspensão bacteriana

  1. Cultivar uma população de Bacillus subtilis NCIB 3610 20 h antes do início do experimento, inoculando diretamente 3 mL de meio de cultura de caldo nutriente nº 3 (ver Tabela de Materiais) a partir de um estoque congelado de glicerol em um tubo de cultura de 15 mL. Incubar numa incubadora de agitação a 30 °C e 200 rpm durante a noite (durante 16 h).
  2. Fazer um subcultivo a partir da cultura noturna 4 h antes do início do experimento, adicionando 3 μL da cultura noturna em 3 mL de meio de cultura fresco (diluição 1:1.000) em um tubo de cultura de 15 mL. Incubar a subcultura em uma incubadora de agitação a 30 °C a 200 rpm por 3,5-4 h para obter uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de 0,1.

4. Experimento de crescimento de biofilme

  1. Ligue a incubadora da caixa do microscópio 3 h antes do experimento para garantir uma temperatura estável de 25 °C. Monte a bomba de seringa e os sensores de pressão (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Conecte a tubulação de entrada e saída ao dispositivo microfluídico. Introduza directamente uma agulha (com um diâmetro exterior de 0,6 mm) no tubo de entrada para assegurar a ligação entre o tubo e a seringa.
  3. Colocar o dispositivo microfluídico, 30 mL de água deionizada e 30 mL de meio de cultura em um exsicador a vácuo e desgaseificá-los por pelo menos 1 h. Em seguida, puxe lentamente o meio de cultura e a água deionizada em duas seringas separadas de 30 mL.
    NOTA: Esta etapa é crucial para evitar a formação de bolhas no canal durante a lavagem com o meio de cultura.
  4. Monte o dispositivo microfluídico no microscópio e coloque a tubulação de saída em um recipiente de resíduos.
    1. Conecte a seringa cheia de água deionizada ao canal microfluídico através da tubulação microfluídica e injete lentamente a água até que ela saia da saída do sensor de pressão. Encha o sensor de pressão com água e lave todas as bolhas da tubulação que conecta o canal microfluídico e o sensor de pressão. Feche a saída do sensor de pressão com os parafusos dedicados ao sensor de pressão.
      NOTA: O procedimento de enchimento descrito garante que as mudanças de pressão na entrada dos canais microfluídicos serão registradas com precisão. Ao executar um experimento com vários canais microfluídicos, conecte cada canal a uma seringa separada para garantir condições de fluxo iguais em todos os canais.
  5. Encha o restante do canal microfluídico com a água deionizada.
  6. Coloque um filtro de 1,2 μm (ver Tabela de Materiais) na seringa do meio de cultura. Em seguida, remova a seringa de água e conecte cuidadosamente a seringa do meio de cultura à tubulação microfluídica de entrada. Monte a seringa na bomba da seringa e lave o canal com o meio de cultura a uma taxa de fluxo de 2 mL/h por 1 h.
    NOTA: O filtro impede que as células bacterianas entrem na seringa durante o carregamento. A lavagem do canal microfluídico com o meio de cultura removerá as bolhas remanescentes na estrutura porosa.
  7. Ajuste a bomba de seringa na vazão desejada (aqui 1 mL/h) durante o experimento e ajuste a leitura de pressão dos sensores de pressão para zero.
    NOTA: Definindo a leitura de pressão inicial para zero, somente a diferença de pressão causada pelo desenvolvimento do biofilme durante o experimento será medida.
  8. Pipetar 1 mL da cultura bacteriana em um OD600 de 0,1 em um frasco de centrífuga de 1,5 mL. Coloque a cultura bacteriana no canal microfluídico colocando o tubo de saída no frasco da centrífuga. Depois de esperar por 5 min para remover quaisquer bolhas de ar potenciais da saída dos tubos, retirar 150 μL de solução bacteriana a uma taxa de fluxo de 1 mL/h, até que o canal microfluídico seja preenchido com a cultura bacteriana.
  9. Retire cuidadosamente o filtro da seringa do meio de cultura e coloque a saída no recipiente de resíduos. Deixar as células bacterianas em condições de fluxo zero no canal microfluídico por 3 h para permitir sua fixação superficial no meio poroso.
    NOTA: Deixar as células bacterianas em condições de fluxo zero por 3 h foi otimizado para a fixação da cepa bacteriana utilizada, garantindo uma cultura bacteriana bem oxigenada. Outras cepas bacterianas podem exigir mais ou menos tempo.
  10. Para iniciar o experimento, inicie o fluxo ajustando a bomba de seringa para a vazão desejada (aqui 1 mL/h) e inicie a leitura da pressão em 1 Hz.
  11. Adquira imagens do biofilme em crescimento no intervalo de tempo, configuração óptica e ampliação desejados.
    OBS: No presente estudo, imagens em aumento de 4x no modo de campo claro em 18 posições abrangendo todo o domínio do meio poroso foram adquiridas a cada 6 min durante 24 h.

5. Análise das imagens

  1. Reconstruir todo o meio poroso a partir das sequências de imagens gravadas costurando as imagens das 18 posições utilizando um software de análise de imagens (ver Tabela de Materiais) e um algoritmo de costura24.
  2. Salve as sequências de imagens costuradas como uma sequência de imagens singulares.
    Observação : se os arquivos são muito grandes, neste ponto, as imagens podem ser redimensionadas e binned para um tamanho razoável para processamento posterior.
  3. Crie uma máscara dos pilares do meio poroso para removê-los da análise.
  4. Remova o fundo das imagens dividindo-as pelo fundo com a imagem obtida em t = 0 h (Figura 2A) e binarize as imagens em um limiar adequado para segmentar o biofilme (Figura 2B).
  5. Calcular a saturação do biofilme calculando a área coberta pelo biofilme (número de pixels atribuídos ao biofilme) em comparação com a área vazia do domínio poroso (Figura 3).

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Resultados

Para o presente estudo, um dispositivo microfluídico com três canais microfluídicos paralelos com diferentes tamanhos de poros foi utilizado (Figura 1) para estudar sistematicamente a formação de biofilme em meios porosos. O processo de formação do biofilme foi visualizado por microscopia de campo claro. As células bacterianas e o biofilme apareceram nas imagens como pixels mais escuros (Figura 2). Além disso, observou-se um processo gradual de entupimento; Dura...

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Discussão

Análogos de meios porosos microfluídicos acoplados a sensores de pressão fornecem uma ferramenta adequada para estudar o desenvolvimento de biofilme em meios porosos. A versatilidade no projeto do meio microfluídico poroso, especificamente na disposição dos pilares, incluindo diâmetro, formas irregulares e tamanho de poros, permite a investigação de muitas geometrias. Essas geometrias variam de poros simples a obstáculos altamente complexos e irregularmente dispostos que imitam diferentes meios porosos naturais (por exem...

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Divulgações

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio da 179834 de subvenção SNSF PRIMA (para E.S.), financiamento discricionário da ETH (para R.S.), ETH Zurich Research Grant (para R.S. e J.J.M.) e financiamento discricionário da Eawag (para J.J.M.). Os autores agradecem a Roberto Pioli pela ilustração do arranjo experimental na Figura 1B e Ela Burmeister pela preparação do wafer de silicone.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtro de Seringa Acrodisc 25 mm, 1.2 µ m Versapor MembranaPall CorporationPN41901.2 µ m filtros
BD Seringa de 10 mL (Luer-Lock)BD300912usado para encher o canal com água deionizada
Caixa IncubadoraLife Imaging Servicesusado para ter uma temperatura estável durante o experimento de crescimento de biofilme
Medidor de densidade celular CO8000WPA medidor de biowaveOD
Frasco de centrífugaEppendorf301200861,5 mL
CETONI Base 120CETONI GmbHde seringa
CorelCADCorelDRAWutilizado para conceber as geometrias dos canais microfluídicos
Tubos de cultura (14 mL, estéreis)greiner bio-oneTubos de cultura
Estufa de secagem, VENTI-LineVWRForno para curar a
solução de detergenteHandyMigros
Quente placa com controle de temperaturaVRWpara curar a ligação PDMS-vidro após tratamento com plasma
ImageJFIJI Software de análise de imagem
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick)EppendorfIncubator
Isopropanol (> 99,8%)Sigma Aldrich67-63-0
Tubo de transferência MasterflexMasterflexHV-06419-050,020'' ID, 0,06''
OD Micro Slides, Simples, 75 x 60 mmCorning2947-75X50Corning
Sensor de pressão microfluídica (1 bar)ElveflowSensores de pressão
Perfurador de biópsia Miltex, diâmetro 1,5 mmIntegraPerfurador para fazer os furos de entrada e saída do canal microfluídico
desenvolvedor mrDev600Microresist
Nikon Eclipse Ti2Nikon InstrumentsMicroscópio
Caldo de nutrientes n° Seringa Omnifix 3Sigma Aldrich
com Luer-LockSeringas B.Braunde diferentes volumes
Câmara de plasma ZeptoDiener ElectronicZEPTO-1 usado para ligar o plasma o PDMS e a lâmina de vidro
Toalhetes de precisão (Kimtech Science)Kimberly ClarkKCP-7552para secar a lâmina de vidro
BalançaVWR-CH611-2605usada para pesar a relação entre o elastômero e o agente de reticulação
Wafer de silício (10 cm)Silicon Materials Inc. N//Phos < 100> 1-10 e ômega; cm
Spincoater, Módulo de rotação SM150Sawatec
SU8 3050 FotorresistenteKayakuam
Sü ss MA6 Alinhador de máscaraSUSS MicroTec Groupusado para alinhar a máscara de cromo-vidro
Sylgard 184Dow Corningkit de elastômero de silicone; agente de cura
Techni Etch Cr01Technic
Technic Placa de cultura de tecidos 150TPP93150
Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctil) silanoSigma Aldrich SigmaAldrichusado para silanizar o wafer de silicano
Veeco Dektak 6 MVeecoProfilometer
bomba Software PDMS

Referências

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