Este estudo demonstra a entrega de um traumatismo cranioencefálico repetitivo em camundongos e o implante simultâneo de uma janela craniana para posterior imagem intravital de um EGFP expresso por neurônio usando microscopia de dois fótons.
Artigo de método
Este estudo demonstra a entrega de um traumatismo cranioencefálico repetitivo em camundongos e o implante simultâneo de uma janela craniana para posterior imagem intravital de um EGFP expresso por neurônio usando microscopia de dois fótons.
O objetivo deste protocolo é demonstrar como visualizar longitudinalmente a expressão e localização de uma proteína de interesse dentro de tipos celulares específicos do cérebro de um animal, mediante exposição a estímulos exógenos. Aqui, a administração de um traumatismo cranioencefálico (TCE) fechado e o implante simultâneo de uma janela craniana para subsequentes imagens intravitais longitudinais em camundongos são mostrados. Camundongos são injetados intracranialmente com um vírus adenoassociado (AAV) expressando proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) sob um promotor neuronal específico. Após 2 a 4 semanas, os camundongos são submetidos a um TCE repetitivo usando um dispositivo de queda de peso sobre o local de injeção do AAV. Dentro da mesma sessão cirúrgica, os camundongos são implantados com um cabeçote de metal e, em seguida, uma janela craniana de vidro sobre o local do TCE. A expressão e a localização celular do EGFP são examinadas usando um microscópio de dois fótons na mesma região cerebral exposta a trauma ao longo de meses.
O traumatismo cranioencefálico (TCE), que pode resultar de lesões esportivas, colisões de veículos e combates militares, é um problema de saúde mundial. O TCE pode levar a déficits fisiológicos, cognitivos e comportamentais, além de incapacidade ou mortalidadeao longo da vida 1,2. A gravidade do TCE pode ser classificada em leve, moderada e grave, sendo a grande maioria TCE leve (75%-90%)3. É cada vez mais reconhecido que o TCE, particularmente as ocorrências repetitivas de TCE, pode promover degeneração neuronal e servir como fatores de risco para várias doenças neurodegenerativas, inc....
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Todos os protocolos relacionados aos animais foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicado pelo Comitê do National Research Council (US). Os protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da University of Massachusetts Chan Medical School (UMMS) (Permit Number 202100057). Resumidamente, como mostra o esquema do estudo (Figura 1), o animal recebe uma injeção viral, um TCE, um implante de janela e, em seguida, imagens intravitais em uma sequência temporal.
NOTA: Os termos comerciais foram removidos. Consulte a Tabela de Mater....
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Como prova de conceito para este protocolo, partículas virais expressando AAV-Syn1-EGFP foram injetadas no córtex cerebral de camundongos machos TDP-43 Q331K/Q331K (fundo C57BL/6J)19 com a idade de 3 meses. Nota-se que animais selvagens C57BL/6J também podem ser usados, no entanto, este estudo foi realizado em camundongos TDP-43 Q331K/Q331K porque o laboratório é focado na pesquisa de doenças neurodegenerativas. Uma cirurgia de TCE foi realizada 4 semanas após a injeção de AA.......
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Neste estudo, a injeção de AAV, a administração de TCE e um cabeçote com implante de janela craniana foram combinados para análise de imagem longitudinal de neurônios marcados com EGFP dentro do córtex cerebral de camundongos (camadas IV e V) para observar os efeitos do TCE nos neurônios corticais. Este estudo observa que o local do TCE aqui escolhido, acima do hipocampo, fornece uma superfície relativamente plana e ampla para a implantação da janela craniana. Por outro lado, o crânio é relativamente estreito anteriormen.......
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Não são declarados conflitos de interesse.
Agradecemos ao Dr. Miguel Sena-Esteves, da University of Massachusetts Chan Medical School, por presentear o vírus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, e a Debra Cameron, da University of Massachusetts Chan Medical School, por desenhar o esboço do crânio de camundongos. Agradecemos também aos membros atuais e passados dos laboratórios Bosco, Schafer e Henninger por suas sugestões e apoio. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa (W81XWH202071/PRARP) para DAB, DS e NH.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Escovas aplicadoras de precisão ajustável | Parkell | S379 | |
| BD seringa de insulina | BD | NDC/HRI #08290-3284-38 | 5/16 "x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | incluindo 7,5% de iodopovidona |
| Buprenorfina | PAR Farmacêutica | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolina | HIKMA Farmacêutica | NDC 0143-9924-90 | |
| Prato de mistura de cerâmica | Parkell | SKU: S387 | Para preparação de cimento dentário |
| Aplicadores com ponta de algodão | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalisador | Parkell | S371 | nome completo: "C" Universal TBB Catalisador |
| Pó de cimento dental | Parkell | S396 | Radiopaco L-Powder para C & B Metabond |
| broca dental | Foredom | H.MH-130 | |
| controlador de broca dental | Foredom | HP4-310 | |
| dexametasona | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 broca de carboneto | Microcopy | Lote # C150113 | cabeça Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 broca de carboneto | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 broca de carboneto | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | fabricado sob medida |
| CWE | TC-1000 Mouse | equipado com o instrumento estereotáxico e usado durante a cirurgia | |
| cirúrgica Manta de aquecimento | CVS farmácia | E12107 | dispositivo de aquecimento extra e ser usado após a cirurgia |
| Isoflurano | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Câmara de indução de isoflurano | Vetequip | 89012-688 | câmara de indução para curto |
| Máquina de volatilização de isoflurano | Vetequip | 911103 | |
| Suporte da máquina de volatilização de isoflurano | Vetequip | 901801 | |
| Microscópio cirúrgico Leica | Leica | 10450243 | |
| Pomada oftálmica lubrificante | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Caneta marcadora | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Bomba de microinjeção e seu controlador | World Precision Instruments | micro4 e UMP3 | |
| Seringa de microlitro | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μ Calibre L para seringa e calibre 32 para agulha, 2 pol, estilo de ponta 3 |
| pinças de mosquito | CAROLINA | Item #: 625314 | Aço inoxidável, curvo, 5 pol |
| Agente depilatório | McKesson Corporation | N / A | Nair Hair Aloe & amp Microscópio de Loção de Depilação de Lanolina |
| 1 | Nikon | SMZ745 | Microscópio Nikon para preparação de janela craniana |
| Microscópio 2 | Zeiss | LSM 7 MP | de dois fótons |
| Laser multifotônico | Coherent | Chameleon Ultra II, Modelo: MRU X1, VERDI Laser de 18W | para microscopia de dois fótons |
| Sutura cirúrgica não absorvível | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, com agulha redonda |
| Adesivo óptico Norland 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| Sem-Snag Agulha Titular | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Base rápida líquida | Parkell | S398 | "B" Base rápida para C & B Metabond |
| Tesoura regular 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Tesoura regular 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Vidro de cobertura redondo 1 | Instrumentos Warner | CS-5R Cat# 64-0700 | para 5 mm de diâmetro |
| Vidro de cobertura redondo 2 | Instrumentos Warner | CS-3R Cat# 64-0720 | para 3 mm de diâmetro |
| Anéis | de borrachaOrings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Tesoura de mola 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | ponta reta |
| Tesoura de mola 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | ponta curva |
| Plataforma estereotáxica | KOPF | Modelo 900LS | |
| Super cola | Henkel Item #: Paquímetro cirúrgico 1647358 | ||
| World Precision Instruments | No. 501200 | ||
| Pinça cirúrgica 1 | CIÊNCIAS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA | Catlog# 0508-5/45-PO | estilo 5/45, |
| pinça cirúrgica curva 2 | CIÊNCIAS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA | catlog# 0103-5-PO | estilo 5, |
| pinça cirúrgica reta 3 | CIÊNCIAS | DE MICROSCOPIA ELETRÔNICAcatlog# 72912 | |
| Pinça cirúrgica 4 | CIÊNCIAS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA | Catlog# 0508-5/45-PO | estilo 5/45, curvado |
| Gaze cirúrgica | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Lâmpada cirúrgica | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | também chamada de reticulador UV |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Adesivo de Tecido Vetbond | 3M Número da peça para cuidados com animais | :014006 |
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