Summary
아래 논문은 6 가지 혼합 염 농도에 대한 염분 내성 차이가있는 두 고추 품종의 종자 발아, 묘목 성장 및 생리 학적 지수를 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 후추 품종의 내염성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
발아 단계에서 고추 (Capsicum annuum L.)의 내염성과 생리적 메커니즘을 결정하기 위해 내염성에 큰 차이가있는 Hongtianhu 101 및 Xinxiang 8 품종이 연구 자료로 사용됩니다. Na2CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2,MgCl2, MgSO4 및 Na2SO4의 등가 몰비를 사용하여 유도된 0, 3, 5, 10, 15 및 20g/L의 6가지 혼합염 농도가 사용된다. 그 효과를 결정하기 위해 종자 발아, 묘목 성장 및 생리학의 관련 지수를 측정하고 회원 기능 분석을 사용하여 염분 내성을 종합적으로 평가합니다. 결과는 혼합 염 농도가 증가함에 따라 두 품종의 발아 잠재력, 발아 지수, 발아율, 종자 발아 활력 지수, 뿌리 길이 및 뿌리 신선한 무게가 크게 감소하는 반면 상대 염 비율은 점차 증가하는 것으로 나타났습니다. 배축 길이와 지상의 신선한 무게는 먼저 증가한 다음 감소하는 반면, 말론 디 알데히드 (MDA), 프롤린 (Pro) 함량, 카탈라아제 (CAT), 퍼 옥시 다제 (POD) 및 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 제 (SOD) 활성은 감소 한 다음 증가합니다. Hongtianhu 101 종자의 발아 잠재력, 발아 지수, 발아율, 종자 발아 활력 지수, 뿌리 길이, 뿌리 신선한 무게, MDA 및 Pro 함량 및 CAT 활성은 여기에 사용 된 모든 염 농도에 대해 Xinxiang 8보다 높습니다. 그러나 배축 길이, 지상 신선한 무게 및 상대 염분 비율은 Xinxiang 8보다 Hongtianhu 101에서 더 낮습니다. 염분 내성에 대한 포괄적 인 평가는 두 회원 함수 지수의 총 가중 값이 먼저 증가한 다음 혼합 염 농도가 증가함에 따라 감소한다는 것을 보여줍니다. 회원 기능 값이 가장 높은 5g / L와 비교하여 3g / L, 10g / L 및 15g / L의 염 농도에서 지수는 각각 4.7 % -11.1 %, 25.3 % -28.3 % 및 41.4 % -45.1 % 감소합니다. 이 연구는 내염성 고추의 육종에 대한 이론적 지침과 내염성 및 내염성 재배와 관련된 생리적 메커니즘의 분석을 제공합니다.
Introduction
염분은 전 세계적으로 작물 생산성의 주요 제한 요소입니다1. 현재 세계 관개 토지의 거의 19.5 %와 마른 토지의 2.1 %가 염분의 영향을 받고 있으며 농경지의 약 1 %가 매년 염분 알칼리 토지로 퇴화합니다. 2050 년까지 경작지의 50 %가 염분 2,3의 영향을받을 것으로 예상됩니다. 해안 근처 또는 주변의 자연 암석 풍화 및 염분 빗물과 같은 자연적 요인 외에도 빠른 표면 증발, 낮은 강우량 및 불합리한 농업 관리 방법은 토양 염화 과정을 악화 시켰습니다. 토양 염화는 식물 뿌리의 성장을 억제하고 식물 뿌리에서 잎으로 물과 영양분의 흡수 및 수송을 감소시킵니다. 이러한 억제는 생리적 물 부족, 영양 불균형 및 이온 독성을 초래하여 작물 생산성을 감소시키고 작물 수확량을 완전히 손실시킵니다. 경작지의 염분화는 점차 세계 농업 식량 생산에 영향을 미치는 가장 중요한 비 생물 적 스트레스 요인 중 하나가되고 있습니다4. 소금 스트레스는 농업에 사용할 수있는 경작지를 감소시켜 미래 농산물의 수요와 공급간에 상당한 불균형을 초래할 수 있습니다. 따라서 토양 염분이 작물 성장 및 생리 학적 및 생화학 적 메커니즘에 미치는 영향을 탐구하는 것은 내염성 품종의 육종, 염분 토양의 지속 가능한 이용 및 농산물의 안전성에 도움이됩니다.
후추 (고추 annuum L.)는 높은 영양 및 약용 가치로 인해 전 세계적으로 심어 져 있습니다. 예를 들어, 캡사이신은 후추의 매운 맛을 담당하는 알칼로이드입니다. 캡사이신은 통증 완화, 체중 감소, 심혈관, 위장관 및 호흡기 시스템 개선 및 기타 여러 응용 분야에서 사용할 수 있습니다5. 후추는 또한 생리 활성 물질, 특히 다양한 항산화 화합물(카로티노이드, 페놀, 플라보노이드)과 비타민 C6가 풍부합니다. 현재 고추는 중국에서 재배 면적이 가장 큰 채소 작물로 연간 재배 면적이 1.5 x 106 헥타르 이상으로 중국 전체 채소 재배 면적의 8 % -10 %를 차지합니다. 후추 산업은 중국에서 가장 큰 채소 산업 중 하나가되었으며 가장 높은 생산량을 가지고 있습니다7. 그러나 고추 재배는 종종 다양한 생물학적 (해충 및 곰팡이) 및 비 생물 적 스트레스, 특히 염분 스트레스에 노출되어 종자 발아, 성장 및 발달에 직접적인 부정적인 영향을 미쳐 고추 열매 수확량과 품질을 감소시킵니다8.
종자 발아는 식물과 환경 간의 상호 작용의 첫 단계입니다. 종자 발아는 주변 배지의 변동, 특히 토양 염분 스트레스에 매우 민감하여 생리학 및 신진 대사에 역전 된 영향을 미치고 결국 작물의 정상적인 성장, 발달 및 형태 형성을 방해 할 수 있습니다9. 이전 연구에서는 염분 스트레스 하에서 고추 종자 발아 및 묘목 성장을 광범위하게 조사했습니다. 그러나 대부분의 연구에서는 스트레스 유도를 위한 유일한 염으로 NaCl을 사용했습니다10,11,12. 그러나 토양 염 손상은 주로 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염의 해리에 의해 생성 된 Na +,Ca 2+, Mg2+, Cl-, CO3 2- 및 SO42- 이온 독성으로 인한 것입니다. 이온 간의 시너지 효과와 길항 작용으로 인해 혼합 염과 단일 염이 작물 성장 및 발달에 미치는 영향은 상당히 다를 수 있습니다. 그러나 고추 종자 발아 및 혼합 소금의 성장에 해당하는 특성은 여전히 불분명합니다. 따라서 내염성에 현저한 차이가있는 두 가지 고추 품종이이 연구의 재료로 사용됩니다. 7 가지 염의 등몰 혼합 후 고추 종자 발아, 성장 및 생리 학적 및 생화학 적 지수에 대한 다양한 염분 농도의 영향을 분석하면 염분 스트레스에 대한 고추 종자 발아의 반응 메커니즘을 밝힐 수 있습니다. 또한 강한 고추 묘목을 재배하기위한 이론적 근거를 제공 할뿐만 아니라 식염수 경작지에서 높은 수확량과 고품질 재배를 제공 할 수 있습니다.
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Protocol
참고 : 여기에서는 종자 염 내성 평가를위한 참조 방법으로 사용할 수있는 다양한 혼합 염 스트레스 하에서 고추 종자 발아 및 묘목 성장의 반응 특성 및 내부 메커니즘을 평가하기위한 프로토콜을 제시합니다.
1. 실험 준비
- 내염성이 강한 품종 인 Hongtianhu 101과 내성이 낮은 Xinxiang 8에 대한 작물 종자를 준비하십시오.
- 종자 소독 시약으로 0.2 % KMnO4 용액을 준비하십시오. 먼저 KMnO 4 4.0g의 무게를 측정 한 다음 증류수 2,000mL를 첨가하십시오.
알림: 과망간산 칼륨은 일반적으로 강한 산화로 인해 불안정합니다. 따라서 사용 직전에 준비됩니다. - 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 황산마그네슘 및황산나트륨 13을 포함하는 7가지 염을 사용하여 혼합염을 제조한다. 각각 동일한 몰량을 첨가하고, 이는 각각 혼합염의 총 질량비의 14.8%, 11.7%, 8.2%, 15.5%, 13.3%, 16.7%, 및 19.8%를 연속적으로 차지한다.
- 직경 9cm의 페트리 접시 (일회용)와 여과지 (중간 속도 정성 여과지)를 준비하십시오.
알림: 페트리 접시의 재질은 변경할 수 있습니다. 그러나 페트리 접시와 여과지의 직경은 동일해야합니다.
2. 종자 담그기 및 발아 준비
- 종자 최적화를 위해 Hongtianhu 101 및 Xinxiang 8 종자의 평균 직경이 각각 4.2mm 및 3.7mm 인 각 품종에서 일관된 크기와 전체 입자를 가진 고추 종자를 선택하십시오. 테스트 작업량에 따라 선택한 총 시드 수를 계산합니다.
- 종자 소독을 위해 선택한 고추 종자를 0.2 % KMnO4 용액에 15 분 동안 담근 다음 증류수로 5 회 헹굽니다.
- 종자 담그기의 경우 멸균 된 씨앗을 증류수에 옮기고 24 시간 동안 담가 두십시오. 증류수로 씨앗을 여러 번 헹구고 나중에 사용하기 위해 건조시킵니다.
알림: 다른 작물에 대한 씨앗의 담그는 시간은 다를 수 있습니다.
3. 종자 발아 및 묘목 성장
- 혼합 염의 6가지 농도를 준비합니다: 0(대조군), 3, 5, 10, 15 및 20g/L. 전도도 측정기를 사용하여 염 용액의 전도도를 측정합니다. 용액 전도도 EC 값은 각각 0.092, 3.05, 4.73, 8.33, 11.53 및 15.22ms/cm입니다.
- 종자 준비를 위해 40 개의 고추 씨앗을 두 층의 여과지가있는 페트리 접시에 골고루 놓습니다. 6 개의 실험 처리를 위해 시드를 준비하고 각 처리를 5 회 반복하십시오.
- 종자 발아를 위해 여과지가 촉촉하게 유지되도록 페트리 접시에 6 가지 혼합 소금 농도를 적당량 첨가하십시오. 어둠 속에서 발아를 위해 28 ° C 및 80 % 공기 습도의 공기 인큐베이터에 씨앗을 놓습니다.
- 종자 발아 후, 파종 후 450 일 동안 인큐베이터에서 묘목이 빛 (약 12 Lux의 광도, 12/12h의 광주기)에서 계속 자라도록합니다. 묘목 성장 단계의 온도 및 습도는 발아 단계에서 사용되는 온도와 습도와 동일해야합니다.
- 촉촉한 여과지를 유지하기 위해 12 시간마다 배양 접시에 용액을 보충하고 페트리 접시에 일정한 혼합 염 농도를 유지하기 위해 혼합 염 용액의 해당 농도로 24 시간마다 여과지를 완전히 씻으십시오.
알림: 젖은 종자에 첨가되는 소금 용액의 양은 종자 발아 및 성장 단계에 따라 조정할 수 있습니다. 배양 접시에서 일정한 농도의 소금 용액을 유지하기 위해 많은 방법을 사용할 수 있습니다. 이 실험에 기재된 방법 이외에, 증류수를 중량으로 첨가하는 전략이 사용될 수있다.
4. 지표의 측정 및 계산
- 종자 발아 지수의 결정
- 파종 후 매일 발아율을 결정하고, 방사형 파괴 종자 코트가 발아 마커로 종자 직경 길이의 절반에 도달합니다.
- 다음 공식을 사용하여 발아율, 발아 잠재력, 상대 염분율, 발아 지수 및 종자 발아 활력 지수를 계산합니다.
발아율(%) = (파종 후 7일째 정상 발아종자수/시험종자수) × 100
발아 잠재력 (%) = (파종 후 3 일째에 정상적인 발아 종자 수 / 시험 종자 수) × 100
상대 염율(%) = (대조 발아율 - 처리 발아율)/대조 발아율 × 100
파종 후 7일째의 종자 발아율을 사용하여 계산
발아 지수 (GI) = ∑ [gt / dt]
여기서 Gt는 파종 후 일정 기간 (t)의 종자 발아 수를 나타내고 Dt는 해당 발아 일을 나타냅니다.
종자 발아 활력 지수 (VI) = GI x S
여기서 S는 루트 길이입니다.
- 묘목 성장 지수의 결정
- 파종 후 14 일째에 각 페트리 접시에서 10 개의 대표 묘목을 무작위로 선택하고 뿌리 길이와 배축 길이를 측정합니다.
- 칼을 사용하여 후추 묘목을 방사형과 지상 부분의 두 부분으로 나눕니다. 닦아서 묘목에서 물을 제거하고 묘목의 무게를 별도로 측정하여 신선한 무게를 결정하십시오.
- 고추의 항산화 효소 활성, 말론 디 알데히드 (MDA) 수준 및 프롤린 (Pro) 함량을 다음과 같이 결정하십시오.
- 고추 묘목을 보존하려면 파종 후 14 일째에 각 처리에서 대표적인 전체 고추 묘목 (약 24.0g)을 선택하십시오. 지표수를 제거한 후 즉시 묘목을 액체 질소에 1 분 동안 얼리고 초저온 (-80 ° C)의 냉장고에 보관하십시오.
알림: 초저온 냉장고에 보관된 고추 묘목의 샘플 수는 일부 지표를 다시 테스트해야 하는 경우를 대비하여 충분해야 합니다. - 삼중으로 수집 된 각 처리에서 약 1.0g의 묘목 샘플을 회수합니다. 묘목 샘플을 원심 분리 튜브에 넣고 액체 질소를 첨가 한 다음 연삭 막대를 사용하여 샘플을 분쇄하여 묘목의 생리적 지수를 결정합니다. 결정된 지수와 측정 방식은 다음과 같습니다.
- 각인자에 대해 상용 키트(분광광도계 기반)를 사용하여 묘목 보호 효소 활성(퍼옥시다아제[POD], 카탈라아제[CAT], 슈퍼옥사이드 디스뮤타제[SOD]), 말론디알데히드(MDA) 및 프롤린(Pro) 함량을 결정합니다.
알림: 이전 관찰에서는 15와 20 g / L 혼합 염 농도 사이의 염분 스트레스에 차이가 없음을 보여주었습니다. 결과적으로 5가지 염 농도(0, 3, 5, 10 및 15g/L)만 측정됩니다.
- 고추 묘목을 보존하려면 파종 후 14 일째에 각 처리에서 대표적인 전체 고추 묘목 (약 24.0g)을 선택하십시오. 지표수를 제거한 후 즉시 묘목을 액체 질소에 1 분 동안 얼리고 초저온 (-80 ° C)의 냉장고에 보관하십시오.
- 회원 기능 방법을 사용한 내염능의 종합 평가
참고: 멤버쉽 함수는 염분 손상에 의해 영향을 받는 다양한 생리적 지수를 평가하기 위해 정성적 평가를 정량적 평가(15)로 변환하는 퍼지 수학 방법을 사용한다.- Zhoubin Liu et al.15의 다음 공식을 사용하여 멤버십 함수의 값을 계산합니다.
리 = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
특성이 염분 내성과 음의 상관 관계가 있는 경우 다음을 사용하여 역 멤버쉽 함수를 계산합니다.
리 = 1 - (Xi - Xmin)/(X최대 - Xmin)
각 생리적 지수의 멤버쉽 값을 누적하며, 여기서 Xi는 특정 트레이트의 측정값이고, Xmax와 Xmin은 각각 Xi의 최대값과 최소값이며, Ri는 해당 트레이트의 멤버쉽 값입니다. - 종자 발아 특성 (발아 잠재력, 발아율, 발아 지수 및 종자 발아 활력 지수), 발아 단계에서의 묘목 성장 특성 (뿌리 길이, 배축 길이, 뿌리 신선한 무게 및 지상 신선한 무게), MDA, Pro 및 회원 기능 값 계산을위한 보호 효소 활성 (CAT, POD, SOD). 멤버십 함수 값은 각 지표에서 가져옵니다.
- Zhoubin Liu et al.15의 다음 공식을 사용하여 멤버십 함수의 값을 계산합니다.
- 스프레드시트 및 SPSS 소프트웨어(버전 22.0)를 사용하여 테스트 데이터를 분석 및 처리하고 다중 비교에 LSD(최유의한 차이) 방법을 적용하여 유의한 차이를 식별합니다. Pearson의 상관 분석을 사용하여 복합 염분 응력 하에서 고추의 종자 발아와 묘목 생리학적 지수 간의 상관 관계를 조사합니다.
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Representative Results
종자 발아 특성
혼합 염 농도가 증가함에 따라 Hongtianhu 101 및 Xinxiang 8의 발아 잠재력과 발아 지수가 크게 감소합니다. 두 품종 모두 소금 농도가 0-3g/L에서 급격히 감소하고 소금 농도가 3-20g/L에서 느리고 꾸준히 감소합니다(그림 1A,B). 두 품종의 발아율은 혼합 염 농도가 증가함에 따라 점차 감소하고 품종에 대한 상대 염율은 점차 증가합니다. 3-15g/L의 염 농도에서 발아율과 상대 염분율에는 큰 차이가 없습니다. 그러나 그 차이는 다른 모든 염 농도에서 중요합니다 (그림 1C, D). 두 품종 사이의 염분 내성과 관련하여 혼합 염 농도가 증가하는 Hongtianhu 101 종자의 발아 잠재력, 발아 지수 및 발아율은 Xinxiang 8보다 높지만 상대 염분 비율은 Xinxiang 8보다 낮습니다.
혼합 염 농도가 증가함에 따라 (0-15 g / L) 두 품종의 종자 발아 활력 지수가 크게 감소합니다. 혼합 염 농도가 15g / L 일 때, Hongtianhu 101과 Xinxiang 8의 종자 발아 활력 지수는 대조군에 비해 각각 91.0 % 및 94.6 % 감소합니다. 참고로, 혼합 염 농도가 15에서 20 g / L로 더 증가 할 때 감소는 중요하지 않습니다. Hongtianhu 101의 종자 발아 활력 지수는 각 혼합 염 농도 수준에서 Xinxiang 8의 종자 발아 활력 지수보다 높습니다 (그림 1E).
묘목 성장 특성
혼합 염 농도가 증가함에 따라 (0-15 g / L), Hongtianhu 101 및 Xinxiang 8의 뿌리 길이와 뿌리 신선한 무게가 크게 감소합니다. 혼합 염 농도가 15g / L 일 때, Hongtianhu 101과 Xinxiang 8의 뿌리 길이는 각각 89.4 %와 91.1 % 감소하고, 뿌리 신선한 무게는 대조군에 비해 각각 81.7 %와 71.2 % 감소합니다. 그러나 염 농도가 15-20g/L일 때 두 품종의 뿌리 길이와 뿌리 신선도는 크게 변하지 않습니다(그림 2A,C). Hongtianhu 101의 뿌리 길이와 뿌리 신선한 무게는 일반적으로 혼합 염 수준이 증가하는 Xinxiang 8보다 높으며 농도는 0에서 10g/L 범위입니다.
두 품종의 배축 길이와 지상 신선한 무게는 혼합 염 농도가 증가함에 따라 증가한 다음 감소합니다. 두 지수 모두 5g/L의 염 농도에서 가장 높은 값에 도달합니다. 유사하게, 소금 농도가 15-20 g / L 일 때, 두 품종의 배축 길이와 지상 신선한 무게는 약간 감소합니다. 품종 차이에 따라 Xinxiang 8의 배축 길이와 지상 신선도는 각 염 농도에서 Hongtianhu 101보다 높습니다(그림 2B,D).
막 지질 과산화 및 삼투압 조절 물질 함량
혼합 염 농도가 증가함에 따라 두 품종의 MDA 및 Pro 함량이 감소한 다음 증가합니다. MDA 및 Pro 함량은 각각 5g/L 및 3g/L의 농도에서 가장 낮은 값에 도달합니다(그림 3A,B). MDA 함량은 0-5g/L의 염 농도에서 약간 감소하고 10g/L에서 급격히 증가합니다. 5g/L 처리와 비교하여 10g/L 처리 후 MDA 함량은 59.9%-64.8% 증가한 다음 변경되지 않습니다. Hongtianhu 101의 MDA 함량은 다른 염 농도에서 Xinxiang 8의 MDA 함량보다 높습니다 (그림 3A). 0-3 g / L에서 Pro 함량의 감소는 중요하지 않으며 두 품종간에 거의 차이가 발견되지 않습니다. 염 농도가 3-15g/L일 때 Xinxiang 8의 Pro 함량은 천천히 증가하고 비교적 안정적으로 유지되는 반면 Hongtianhu 101의 Pro 함량은 급격히 증가합니다. 3g/L에 비해 Hongtianhu 101의 Pro 함량은 15g/L에서 440.2% 크게 증가합니다(그림 3B).
보호 효소 활성
혼합 염 농도가 증가함에 따라 Hongtianhu 101 및 Xinxiang 8의 묘목의 CAT, POD 및 SOD 활동이 감소한 다음 증가하며 가장 낮은 값은 3g / L 농도에서 얻어집니다 (그림 4A-C). 두 품종의 CAT 및 POD 활성은 0-5g/L의 염 농도에서 약간 다르며 그 차이는 작습니다. 그 후, 두 품종의 CAT 및 POD 활성은 염 농도가 증가함에 따라 크게 증가합니다. 또한 Hongtianhu 101의 CAT 및 POD 활동은 Xinxiang 8의 CAT 및 POD 활동보다 높으며 그 차이는 점차 증가합니다 (그림 4A, B). 두 품종의 SOD 활성은 0-10g/L의 염 농도에서 약간 변한 다음 빠르게 증가합니다. Xinxiang 8의 SOD 활성은 0-10 g / L의 염 농도에서 Hongtianhu 101보다 높습니다. 나머지 농도의 경우 활성은 Hongtianhu 101보다 낮습니다 (그림 4C).
고추의 종자 발아 지수의 상관 관계 분석 및 염분 스트레스 종합 평가
상관 분석 (표 1)은 묘목 성장 특성 지수에 대한 뿌리 길이 및 뿌리 신선한 무게가 발아 지수 (발아 잠재력, 발아율, 발아 지수, 종자 발아 활력 지수 등)와 유의하게 양의 상관 관계가 있음을 보여줍니다. 그러나 배축 길이, 지상 신선한 무게 및 발아 지수 사이에는 명시적인 관련성이 발견되지 않습니다. 묘목 성장 특성의 지수와 보호 효소 (CAT, POD 및 SOD)의 활성 사이에는 유의 한 음의 상관 관계가 있습니다. 배축 길이와 MDA 및 Pro의 내용물 사이에, 그리고 싹의 신선한 무게와 MDA 함량 사이에도 상당한 음의 상관 관계가 발견됩니다. 종자 발아 활력 지수와 보호 효소 활성 사이의 유의 한 상관 관계를 제외하고, 발아 특성 지수와 묘목 생리 학적 지수 (보호 효소 활성 및 MDA 및 Pro 함량) 사이에는 유의 한 상관 관계가 발견되지 않았다.
복합 염분 응력 하에서 두 고추 품종의 염분 내성은 여러 특성에 대한 회원 함수 방법을 사용하여 평가됩니다. 고추 묘목은 혼합 소금 농도가 0g / L 일 때 염분 스트레스를받지 않기 때문에 회원 함수 값이 계산되지 않습니다. 결과적으로, 염분 스트레스를 이용한 치료만이 회원 기능 분석을 사용하여 평가됩니다. MDA는 고추 묘목의 염분 내성과 음의 상관 관계가있는 것으로 밝혀졌으며 역 회원 함수 방법을 사용하여 계산됩니다. 다른 인덱스는 멤버쉽 함수 메서드를 사용하여 계산됩니다. 표 2 는 혼합 염 농도가 증가함에 따라 두 품종의 각 지수 함수의 총 가중 값이 증가한 다음 감소하여 궁극적으로 5g/L의 염 농도에서 최대값에 도달함을 보여줍니다. 5 g/L 처리와 비교해, 3 g/L, 10 g/L로 얻은 값은, 및 15g/L 염 농도 처리는 각각 4.7%-11.1%, 25.3%-28.3% 및 41.4%-45.1% 감소합니다. 따라서 5g/L, 3g/L, 10g/L 및 15g/L 염분 농도 처리를 받은 고추의 내염성은 각각 최고, 차선책, 불량 및 최악으로 분류할 수 있습니다.
그림 1 : 혼합 소금 농도 증가가 후추의 종자 발아에 미치는 영향. (A), (B), (C), (D) 및 (E)는 각각 복합 염분 스트레스에 대한 고추 종자 발아 잠재력, 발아 지수, 발아율, 상대 염분 비율 및 종자 발아 활력 지수의 반응 특성을 나타냅니다. 그림의 소문자가 다르면 Tukey의 다중 범위 검정 (p < 0.05)으로 분석 된 처리 간의 유의 한 차이를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차(n = 5)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 혼합 염 농도 증가가 종자 발아 및 후추의 형태 학적 지수에 미치는 영향. (A), (B), (C) 및 (D)는 각각 고추 묘목 뿌리 길이, 배축 길이, 뿌리 신선한 무게 및 복합 염분 스트레스에 대한 지상 신선한 무게의 반응 특성을 나타냅니다. 그림의 소문자가 다르면 Tukey의 다중 범위 검정 (p < 0.05)으로 분석 된 처리 간의 유의 한 차이가 있음을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차(n = 5)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 혼합 염 농도 증가가 고추 묘목의 MDA 및 Pro 함량에 미치는 영향. (A) 및 (B)는 각각 복합 염분 응력에 대한 고추 묘목 MDA 및 Pro 함량의 반응 특성을 나타냅니다. 그림의 다른 소문자는 Tukey의 다중 범위 테스트 (p < 0.05)로 분석 된 처리 간의 유의 한 차이를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차(n = 3)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 혼합 염 농도 증가가 고추 묘목의 CAT, POD 및 SOD 활동에 미치는 영향. (A), (B) 및 (C)는 각각 복합 염분 스트레스에 대한 고추 묘목 CAT, POD 및 SOD 활성의 반응 특성을 나타냅니다. 그림의 소문자가 다르면 Tukey의 다중 범위 검정 (p < 0.05)으로 분석 된 처리 간의 유의 한 차이가 있음을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차(n = 3)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 복합 염분 스트레스 하에서 고추 발아와 생리적 지표 간의 상관 관계 분석 (n = 30). Pearson의 상관 분석은 복합 염분 스트레스 하에서 종자 발아와 고추의 묘목 생리 학적 지수 간의 상관 관계를 조사하는 데 사용됩니다. * p < 0.05; ** p < 0.01. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 : 혼합 염분 스트레스 하에서 고추 발아 및 묘목의 생리적 지표의 가중 회원 함수 값. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구 방법은 실험 결과의 정확성에 영향을 미치는 네 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫째, 높은 염 농도 용액에서 용질 함량이 증가하여 혼합 염이 잘 용해되지 않고 물에 용해되기 더 어려운 염화칼슘과 같은 시약의 용해도가 낮기 때문에 계량 된 시약은 모르타르에서 완전히 분쇄해야합니다. 또한, 시약은 용량을 결정하기 전에 초음파를 통해 용해되어야합니다. 둘째, 구성된 소금 용액을 매번 완전히 흔들어 페트리 접시에 첨가하여 사용해야합니다. 셋째, 페트리 접시는 소금 용액을 첨가 한 후 적절한 수층을 유지해야하며 각 페트리 접시의 물 상태는 비교적 일정해야합니다. 마지막으로, 종자 발아 후 조명 조건이 일정해야합니다.
이 연구에서는 선택한 페트리 접시의 직경을 변경하여 단일 페트리 접시의 테스트 시드 수를 조정할 수 있습니다. 다른 재배 지역에서 토양 염분 스트레스의 특정 상황에 따라, 각 단일 소금 첨가의 비율은 지역 토양의 염분 스트레스의 실제 상황과 일관성을 유지하도록 조정 될 수 있습니다. 이 방법은 실용적이지만 작은 씨앗 (예 : 강간, 얼음 식물 및 아마란스) 또는 큰 씨앗 (예 : 칼 콩 및 넓은 콩)의 경우 묘목 길이 및 신선한 무게를 결정할 때 운영상의 어려움 또는 단일 배양 접시에 데이터를 반복 할 수있는 종자가 거의 없기 때문에이 방법을 사용하여 염분 내성을 연구하는 데 어려움이 있습니다.
여기에 설명 된 방법은 다양한 혼합 염 농도에서 종자 발아 특성 및 묘목 성장을 결정하고 내부 생리 효소 활성을 통해 변화 메커니즘을 밝히는 데 사용되며, 이는 종자의 내염성 특성을 객관적으로 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 기술은 다른 작물의 내염성 평가에 대한 기술 참조를 제공할 수 있습니다. 종자 발아 및 묘목 성장은 작물이 염분 스트레스에 가장 민감한 단계입니다. 따라서, 이 방법은 내염성 재배 및 작물 육종을 위한 기준을 효과적으로 제공할 수 있다.
대부분의 작물에서 염분 스트레스는 생물학적 스트레스 하에서 종자 발아 및 묘목 성장을 억제 할 수 있습니다. 이러한 억제는 염수 조건 하에서 염 용액의 삼투압 잠재력을 감소시킴으로써 종수 흡수의 감소에 기인할 수 있다. 소금 이온 스트레스와 독성은 종자 발아 중 보호 효소 (POD, CAT, SOD 등)의 활성과 단백질 대사를 변화시키고 내인성 호르몬 균형을 파괴 할 수 있습니다11,16. Zhani 등은 발아 과정이 주로 발아율 감소와 소금 (NaCl) 스트레스 하에서 발아 연장에 의해 변화되었다고보고했다. 또한, 8g/L 17의 염 농도에서 다양한 품종(10%-50%)의 발아율에서 상당한 차이가 발견되었습니다. 본 연구는 또한 혼합 염 농도가 증가함에 따라 Hongtianhu 101 및 Xinxiang 8의 발아 잠재력, 발아 지수, 발아율 및 종자 발아 활력 지수가 크게 감소하고 상대 염율이 점차 증가한다는 것을 보여줍니다. Patanè et al.에 따르면, 소금 스트레스가 달콤한 수수 종자의 발아 시간을 연장 시켰지만, 염분 스트레스의 증가는 종자의 최종 발아에 악영향을 미쳤다18. 그러나 관련 연구에 따르면 NaCl 처리는 고추 종자 발아 및 성장을 촉진 할 수 있습니다19, 이는 염분 농도 수준의 차이와 관련이있을 수 있습니다.
염분 스트레스 수준을 높이면 고추 묘목의 성장에 큰 영향을 미치며,이 연구를 바탕으로 혼합 소금 농도가 증가함에 따라 두 품종의 뿌리 길이와 뿌리 신선한 무게가 크게 감소했습니다. 이 발견은 Mirosavljević et al.의 발견과 유사하며, 그는 염분 스트레스가 증가함에 따라 뿌리 길이와 뿌리 무게가 감소하고 치료 간의 차이가 유의하다고 제안했습니다20. 이 결과는 뿌리 시스템이 토양 용액과 직접 접촉하는 토양 배지에 배치되었으며 뿌리 길이와 뿌리 무게가 NaCl 삼투압 스트레스에 더 민감하다는 것을 나타냅니다. 뿌리 길이와 뿌리 무게는 염분 스트레스에 대한 식물 반응의 주요 지표입니다. 이 연구에 따르면 염분 농도가 증가함에 따라 지상 부분의 배축 길이와 신선한 무게가 증가한 다음 감소하여 최대 값은 5g/L에 도달합니다. Khan et al.은 또한 염분(NaCl)이 증가함에 따라(0-9ms/cm) 고추의 싹 길이가 먼저 증가한 다음 감소하여 3ms/cm12에서 최상의 성능을 얻을 수 있다고 제안했습니다. 21. 이 연구에서 염분 농도의 전도도는 묘목 배축 길이와 지상 신선한 무게의 값이 가장 높았을 때 4.73ms/cm였으며 이는 Khan et al.21이 보고한 값보다 높습니다. 이 결과는 단일 소금 스트레스에 비해 복합 소금 스트레스에 대한 지상 후추의 높은 내성 때문일 수 있습니다.
염분 스트레스는 작물 성장을 방해 할뿐만 아니라 식물에 심각한 생리적 변화를 일으 킵니다. 염분 스트레스는 활성 산소 종 (ROS)의 수준을 증가시킬 수 있습니다. ROS가 제때 제거되지 않으면 식물 세포막에 심각한 손상을 줄 수 있는 막 지질 과산화 및 산화 스트레스가 발생할 수 있습니다. MDA는 막 지질 과산화의 최종 대사 산물이며 세포 내 MDA 농도는 종종 스트레스 하에서 식물의 손상 정도를 평가하는 지표로 사용됩니다22. 본 연구에서, 혼합 염 농도가 증가함에 따라, 두 품종의 묘목의 MDA 함량은 먼저 감소한 다음 증가한다. 참고로, 감소는 0-5 g / L 범위의 염 농도에서 중요하지 않습니다. 그러나 5-10g/L에서 급격한 증가가 관찰됩니다. 그 후, 값은 변하지 않고 유지되어 고추 종자의 막 지질 과산화물의 정도가 일반적으로 빠르게 증가하고 안정하게 변한다는 것을 나타냅니다. 염분 스트레스는 혼합 염 농도가 10g/L보다 클 때 세포막 투과성에 심각한 영향을 미치는 것으로 추측됩니다. Guzmán-Murillo 등은 NaCl 농도가 증가함에 따라 달콤한 고추 묘목에서 막 지질 과산화물 수준이 감소한 다음 증가하는 유사한 결론을 보고했습니다(0-50nmol/L). 또한, 지질 과산화의 수준은 25 nmol / L NaCl23에서 가장 낮았다.
식물은 염분 스트레스에 대처하기위한 몇 가지 전략을 발전 시켰습니다. 한편으로, 작물은 프롤린과 같은 삼투압 조절 물질을 증가시킴으로써 단백질 안정성 및 막 완전성을 향상시키고, 세포 내 수분의 손실을 감소시킴으로써, 염분 내성을 향상시킨다24. 본 연구에서는 혼합 염 농도가 증가함에 따라 Xinxiang 8 및 Hongtianhu 101 묘목의 Pro 함량이 먼저 감소한 다음 증가합니다. 특히, 감소는 0-3 g / L의 농도에서 유의하지 않으며 두 품종의 차이는 중요하지 않으며 Muchate et al25의 실험 결과와 일치합니다. 내염성이 좋은 Hongtianhu 101 고추 품종의 Pro 함량도 3-15g/L의 소금 농도에서 빠르게 증가합니다. 3g/L에 비해 15g/L의 Pro 함량은 440.2% 크게 증가하는 반면, 일반적인 내염성을 가진 Xinxiang 8의 Pro 함량은 천천히 증가하고 3-15g/L의 염 농도에서 비교적 안정적인 수준을 유지합니다. 염분 스트레스에 의해 유도 된 ROS에 대한 항산화 효소의 소거 효과는 작물 방어 메커니즘의 주요 구성 요소로 입증되었습니다. CAT, POD 및 SOD의 활성은 다양한 염분 스트레스 환경에서 증가하여 염분 내성을 향상시키는 것으로보고되었습니다25,26. Chen et al. NaCl 농도가 증가함에 따라 토마토 종자 발아에서 SOD, POD 및 CAT의 활성이 점진적으로 증가하며 0-50 nmol / L NaCl27로 처리 한 후 각 지수에서 큰 차이가 없음을 보여주었습니다. 이 연구는 또한 혼합 염 농도가 증가함에 따라 Hongtianhu 101 및 Xinxiang 8의 묘목에서 CAT, POD 및 SOD의 활동이 감소한 다음 증가한다는 것을 보여줍니다. 낮은 염 농도 (0-3 g / L)에서는 항산화 효소의 활성이 크게 변하지 않으며 염분 농도가 더 증가하면 염분 내성이 향상됩니다.
염분 스트레스에 대한 작물의 적응성 및 반응 특성은 주로 형태, 구조, 생리 생태학 등에 반영됩니다. 복합 염 응력의 포괄적 인 평가는 여러 특성에 대한 회원 함수 값 방법을 사용하여 수행됩니다. 이 연구는 혼합 염 농도가 증가함에 따라 함수 값의 총 가중 값이 먼저 증가한 다음 감소한다는 것을 보여줍니다. 두 품종은 최대 5g/L에 도달하여 최고의 내염성 효과를 제공합니다. 5g/L 처리와 비교하여 염분 농도 3g/L, 10g/L 및 15g/L로 처리한 후 가중값은 Hongtianhu 101의 경우 각각 4.7%, 25.3% 및 41.4%, Xinxiang 8의 경우 각각 11.1%, 28.3% 및 45.1% 감소합니다. 이러한 발견은 Hongtianhu 101의 염분 내성이 Xinxiang 8의 염분 내성보다 높다는 것을 나타냅니다.
이 연구는 고추 종자 발아 및 생리적 효소 활성에 대한 다양한 농도의 복합 염 스트레스의 영향에 대한 포괄적 인 설명과 다른 작물의 염분 내성에 대한 연구를위한 기술 참고 자료를 제공합니다. 후추 묘목은 시뮬레이션 된 혼합 소금 농도 (0-5g / L)에서 염분 스트레스의 영향을 덜받습니다. 고추의 종자 발아, 방사상 신장 및 묘목 형태 형성은 높은 염분 스트레스 (>5g / L) 하에서 크게 억제되어 고추 묘목에서 심각한 막 지질 과산화를 유발합니다. 작물은 Pro 함량을 높이고 보호 효소 (CAT, POD 및 SOD)의 활성을 향상시켜 염분 스트레스의 부작용을 줄입니다. 소금 스트레스 하에서 Hongtianhu 101 묘목의 프롤린 함량과 보호 효소 활성이 더 높고 막 지질 과산화 정도가 낮으며 종자 발아 및 묘목 성장이 Xinxiang 8보다 더 분명합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 장시성 과학 기술부 (20203BBFL63065)와 장시 교육부 과학 기술 연구 프로젝트 일반 프로젝트 (GJJ211430)의 지원을 받았습니다. 영어 편집을 해주신 Editage (www.editage.cn)님께 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Centrifugal machine | Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China | TGL-16M | |
| Centrifuge tube | None | None | |
| Conductivity meter | Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China | DDSJ-308F | |
| Constant temperature and humidity box | Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China | PSX-280H | |
| Digital display vernier caliper | Deli Group Co., Ltd.,China | DL90150 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China | ME802E/02 | |
| Filter paper | Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China | GB/T1914-2017 | |
| Grinding rod | None | None | |
| Hongtianhu 101 | Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China | 11933955/100147K1-137 | |
| Ice machine | Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China | IM150G | |
| Liquid nitrogen | None | None | |
| Magnesium chloride | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Magnesium sulfate | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Petri dish | Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China | I-000163 | |
| Pocket knife | None | None | |
| Potassium permanganate (KMnO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Pure water equipment | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China | UPT-I-20T | |
| Sodium bicarbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium carbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium chloride | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium sulfate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Test kit | Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China | Spectrophotometer method | |
| Ultra-low temperature freezer | SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd. | MDF-382 | |
| Ultraviolet visible spectrophotometer | Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China | 760CRT | |
| Xinxiang 8 | Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China | GPD Pepper 2017(360013) |
References
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