In vivo Entrega de Genes em Células Epiteliais Mamárias de Camundongos Através de Injeção Intraductal Mamária

As células epiteliais das glândulas mamárias desempenham um papel importante na função dessas glândulas e são a principal célula de origem do câncer de mama. Estudos da biologia da glândula mamária e tumorigênese frequentemente necessitam da entrega de gene(s) de interesse nessas células. Cada glândula mamária de camundongo compreende uma árvore ductal revestida por células epiteliais com uma única abertura na ponta do mamilo. Essa estrutura torna as células epiteliais mamárias facilmente acessíveis aos vetores virais, que podem ser liberados para a luz de uma árvore ductal por injeção intraductal¹.

A técnica de injeção intraductal mamária foi originalmente utilizada para animais muito maiores, como cabras, coelhos e ratos¹. Para um animal muito menor, como camundongos, a injeção intraductal precisa de muitas ferramentas delicadas e mais práticas dos operadores. Existem duas abordagens para injeção intraductal em camundongos. Uma delas é a injeção de teto¹. Outra é a injeção direta do ducto primário da glândula mamária #3 ou #4 após exposição cirúrgica¹. Como a primeira é não invasiva e mais rápida uma vez que o operador tenha sido bem treinado, essa técnica é mais comumente usada e será descrita em detalhes neste artigo.

Em comparação com os modelos tradicionais de camundongos transgênicos amplamente utilizados, nos quais o gene de interesse é introduzido na fase de ovos fertilizados por microinjeção ^2,3,4, a liberação gênica pelo método de injeção intraductal de vírus apresenta muitas vantagens, incluindo: (1) evita o demorado processo de confecção de uma linhagem de camundongo transgênico para cada gene de interesse; (2) evita possíveis prejuízos no desenvolvimento normal das glândulas mamárias impostos pelo gene de interesse; (3) introduz o gene de interesse em qualquer momento desejado após o nascimento; (4) pode facilmente co-introduzir mais de um gene de interesse; (5) mimetiza melhor o processo tumorigênico natural, pois as células infectadas e, portanto, portadoras de oncogenes são circundadas por células normais; e (6) em combinação com a tecnologia TVA (tumor virus A, uma proteína de superfície celular aviária e receptor para vetor RCAS de retrovírus)⁵, o gene de interesse pode ser introduzido em uma população celular específica para estudar a origem celular da tumorigênese e conduzir ensaios de rastreamento de linhagem celular nas glândulas mamárias ^{6,7,8, 9º}.

Quaisquer vetores derivados de retrovírus¹⁰, lentivírus 11,12^, adenovírus¹³ e vírus associado a adenovírus (AAV)¹⁴ podem ser usados para liberação intraductal de materiais genéticos. Vetores de retrovírus e lentivírus integram-se ao genoma do hospedeiro permanentemente; assim, introduzem genes de interesse de forma estável nas células epiteliais mamárias. Enquanto o lentivírus pode se integrar ao genoma de qualquer célula que encontre¹⁵, a integração genômica eficiente do retrovírus necessita da proliferação das células-alvo¹⁶. Os vetores adenoviral e AAV não se integram ao genoma das células infectadas e, portanto, expressam apenas transitoriamente o gene de interesse^17,18. Essa característica pode ser uma vantagem quando o gene de interesse precisa ser expresso por apenas um curto período de tempo, como Cre, para excluir um gene supressor de tumor floxed.

Lentivírus, adenovírus e AAV infectam quaisquer células de camundongo que encontrarem. Mas como o epitélio luminal é amplamente isolado da camada basal subjacente, que é separada do estroma pela membrana basal, a injeção intraductal limita a infecção em grande parte às células epiteliais luminais, a célula primária de origem do câncer de mama. Dentro dessa camada epitelial luminal, existem também subtipos celulares distintos, incluindo células-tronco, células progenitoras e vários grupos de células diferenciadas. Para infectar subgrupos celulares específicos dentro da população de células luminais, pode ser usada a tecnologia TVA, com a qual vetores RCAS derivados do vírus da leucose aviária^5,10 ou vetores lentivirais pseudotipados¹¹ infectam seletivamente as células que expressam TVA em camundongos portadores de um transgene tva sob o controle de um promotor específico do tipo celular, como um promotor ativo apenas em células-tronco 6 ou certos progenitores ^{6, 7} ou células alveolares⁸ ou células ativas da via Wnt⁹.

Este protocolo apresenta a técnica de introdução de genes de interesse em células epiteliais mamárias através da injeção intraductal de um vetor viral. A detecção da expressão dos genes introduzidos e as lesões e tumores hiperplásicos resultantes são então demonstrados.

Todos os procedimentos com camundongos foram realizados de acordo com o protocolo de animais aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Para o presente estudo, camundongos fêmeas com 9-12 semanas de idade FVB/N ou MMTV-tva foram usados. Os camundongos foram obtidos comercialmente ou de fabricação própria (ver Tabela de Materiais). Foram utilizados os vírus Lenti-EGFP (FUCGW) e RCAS-Erbb2 (Neu). A preparação e a determinação dos títulos virais foram realizadas seguindo os relatos previamente publicados^10,12.

1. Preparação da seringa

1. Corte as agulhas do cubo de metal de 33 G (ver Tabela de Materiais) com aproximadamente 1 cm de comprimento. Armazenar as agulhas e a seringa de 50 μL em álcool a 70% após a autoclavagem.
2. Retire seringas e agulhas do álcool. Empurre o álcool restante para fora da seringa e da agulha. Desmonte a seringa para secagem ao ar em uma bancada absorvente autoclavada.
3. Monte a seringa após a secagem.

2. Preparação do vírus

1. Retire um ou vários tubos de estoque viral, conforme necessário, do freezer de -80 °C e descongele o vírus no gelo.
   NOTA: Dependendo do número de células a serem infectadas, o vírus pode precisar ser diluído em títulos pretendidos usando 1x PBS neste momento.
2. Adicione azul de bromofenol mergulhando a ponta da pipeta a uma profundidade de 1 cm no pó azul de bromofenol (ver Tabela de Materiais). Em seguida, traga a quantidade de vestígio anexado de azul de bromofenol para a suspensão do vírus.
   NOTA: Para o presente estudo, o estoque viral é geralmente de 200 μL por tubo, de modo que a concentração final do corante é de aproximadamente 0,2% (0,2 μg/100 μL). O azul de bromofenol deve ser esterilizado com radiação de micro-ondas por 45 segundos a uma potência de 1250 W (ver Tabela de Materiais). Certifique-se de realizar todo o procedimento em um ambiente estéril.
3. Misture o azul de bromofenol com a solução de vírus pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
4. Coloque o vírus no gelo e leve o balde de gelo para o biotério.

3. Preparo dos animais

1. Anestesiar uma fêmea de camundongo por injeção intraperitoneal de 2 μL/g de anestésico (37,6 mg/mL de cetamina, 1,92 mg/mL de xilazina e 0,38 mg/mL de acepromazina, ver Tabela de Materiais). Verifique a profundidade da anestesia com uma pinça no dedo do pé. Aplique pomada nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   NOTA: O rato não deve responder à pinça dos dedos dos pés sob boa anestesia. O isoflurano também pode ser usado para anestesiar os camundongos.
2. Coloque o mouse em decúbito dorsal em uma almofada quente e prenda os quatro membros ao banco usando fita adesiva.
3. Identificar um mamilo (ou mais) a ser injetado (o número 4 é preferido para o presente estudo). Exponha aparando o cabelo ao redor usando uma tesoura.
4. Aplique álcool 70% e cotonetes iodóforos na área do mamilo em três rodadas para limpar e expor o mamilo.

4. Injeção intraductal de vírus

NOTA: Uma lâmpada de aumento pode ser usada para ajudar a visualizar a abertura do mamilo.

1. Transeccionar a ponta distal de um mamilo usando um par de tesouras estéreis de mola de microdissecação, até que uma pequena abertura ductal central possa ser vista sob uma lâmpada de aumento (ver Tabela de Materiais).
2. Coloque 10 μL da mistura vírus/azul de bromofenol na seringa.
   NOTA: Lenti-EGFP (FUCGW) e RCAS-Erbb2 (Neu) são usados nesta demonstração.
3. Introduza cuidadosamente a agulha na abertura do mamilo com a ajuda da lâmpada de lupa. A orientação da agulha é ligeiramente ajustada de medial para lateral para alinhar com o ducto principal.
4. Injete todos os 10 μL do vírus na árvore do duto.
   NOTA: Os ductos sob a pele devem ficar azuis, se a injeção for bem-sucedida. Qualquer resistência ou o aparecimento de uma mudança de cor localizada indica a falha da injeção.
5. Coloque o mouse em um aquecedor de slides definido a 45 °C até que o mouse acorde completamente (~30-60 min).

5. Detecção de células infectadas por estereomicroscópio fluorescente

1. Três a cinco dias após a injeção do vírus portador de GFP ou outros genes fluorescentes, eutanasiar o camundongo com sobredosagem com 4 uL/g de anestésico (37,6 mg/mL de cetamina, 1,92 mg/mL de xilazina e 0,38 mg/mL de acepromazina).
2. Abra a cavidade torácica. Cortar a pele ao longo da linha média ventral e ao longo dos membros superiores e inferiores usando uma tesoura. Levante a pele e exponha as glândulas mamárias.
3. Remova a glândula mamária injetada da pele usando um par de pinças e tesouras. Além disso, remova uma glândula não injetada como controle.
4. Coloque as glândulas mamárias em lâminas de vidro e espalhe as glândulas para sua forma original.
5. Observe e visualize as glândulas sob um estereomicroscópio fluorescente.

Dados representativos são apresentados aqui para demonstrar o sucesso da injeção intraductal, a infecção viral bem-sucedida e o impacto dos genes liberados na tumorigênese mamária. A quantidade de vírus injetada deve ser adaptada ao objetivo de cada experimento. Para ilustrar o quão extensivamente a árvore do ducto mamário pode ser infectada, uma grande quantidade de genes portadores de vírus que podem ser imageados, como GFP, precisa ser usada. Por outro lado, para mimetizar a tumorigênese espontânea natural, uma pequena quantidade de vírus carregando um oncogene deve ser usada para que apenas algumas células sejam infectadas e evoluam para lesões pré-cancerosas e, eventualmente, câncer invasivo, em um campo da glândula mamária completamente normal.

O sucesso da injeção intraductal pode ser imediatamente confirmado pela exposição da glândula mamária e observação de uma árvore ductal azul (Figura 1). Dois a cinco dias após a injeção do vírus Lenti-EGFP (FUCGW) (~106 UIs)12, a infecção das células epiteliais mamárias pode ser avaliada por preparo de montagem total seguido de observação em estereomicroscópio fluorescente (Figura 2). Alternativamente, para a análise por citometria de fluxo das proteínas fluorescentes ou marcadores de superfície celular produzidos pelo vírus 6,7,19, as glândulas infectadas e não infectadas (como controles negativos) podem ser coletadas e processadas em uma suspensão unicelular para que a taxa de infecção viral possa ser estimada (Figura 3). Outro método para testar/quantificar a infecção viral é fixar as glândulas controle infectadas e não infectadas usando paraformaldeído (ou formalina) a 4%, processá-las em blocos embebidos em parafina e corar os cortes resultantes para os produtos gênicos produzidos viralmente e etiquetas de epítopos, como HA e FLAG20,21.

Se as células infectadas por vírus se expandirão e formarão lesões pré-cancerosas e, em seguida, tumores, depende da potência do(s) oncogene(s) liberado(s) e da quantidade de vírus injetada. Para um oncogene potente como o PyMT e a SRA ativada, lesões precoces se formam em poucos dias, e os tumores aparecem em poucas semanas10 (Bu et al., observações não publicadas). O ERBB2 ativado leva a lesões pré-cancerosas em poucas semanas e tumores em poucos meses 10,22,23 (Figura 4), enquanto o PIK3CA ativado leva a tumores com latência mediana de aproximadamente 5meses24. Por outro lado, Wnt1 causa tumores de forma bastante lenta: apenas cerca de 20% dos camundongos infectados desenvolveram tumores após 20 meses21.

Figura 1: Árvore ductal mamária injetada com sucesso. A imagem foi capturada imediatamente após a injeção intraductal da glândula mamária número 4 de uma fêmea de camundongo FVB/N com 9 semanas de idade. A seta indica a localização do mamilo número 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Detecção de células infectadas por estereomicroscopia fluorescente. (A) Uma glândula contralateral não injetada é usada como controle. (B) Imagem captada em estereomicroscópio fluorescente mostra a árvore do ducto mamário infectada. A glândula mamária número 3 de um camundongo FVB/N de 10 semanas de idade foi injetada intraductalmente com o vírus Lenti-EGFP (FUCGW) (~106 UIs). A glândula mamária injetada foi coletada 5 dias após a injeção. Barra de escala: 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Quantificação de células infectadas por citometria de fluxo para EGFP produzido por lentivírus. O canal de ficoeritrina (PE) foi utilizado para revelar o sinal autofluorescente. As glândulas mamárias não injetadas contralaterais foram utilizadas como controle negativo. As glândulas mamárias injetadas de uma fêmea de camundongo FVB/N de 12 semanas de idade foram coletadas 2,5 dias após a injeção intraductal de Lenti-EGFP (~106 UIs/glândula) e processadas em uma suspensão unicelular. A suspensão unicelular foi então analisada por citometria de fluxo para detectar as células positivas para GFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Confirmação imuno-histoquímica do produto oncogênico expresso pelo vírus em uma lesão precoce e um tumor. (A) Uma glândula mamária #4 contendo lesão precoce foi coletada 14 dias após a injeção intraductal de 10a 6 UIs de RCAS-Neu (HA) em camundongos MMTV-tva. A coloração imunoistoquímica foi utilizada para detectar o HA Tag. (B) Um tumor foi coletado 1 ano após a injeção intraductal de 10a 4 UIs de RCAS-Neu (HA) em uma glândula #4 de camundongos MMTV-tva. Idade do rato na injeção: 12 semanas. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ambos os autores declaram não haver conflitos de interesse.