Este protocolo descreve um método para monitorar a progressão das alterações morfológicas ao longo do tempo no útero em um modelo induzível de câncer de endométrio em camundongos usando imagens ultrassonográficas com correlação com alterações macroscópicas e histológicas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Avaliação Ultrassonográfica Não Invasiva da Progressão do Câncer de Endométrio na Deleção Dirigida por Pax8 dos Supressores Tumorais Arid1a e Pten em Camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os cânceres uterinos podem ser estudados em camundongos devido à facilidade de manuseio e manipulação genética nesses modelos. No entanto, esses estudos são frequentemente limitados a avaliar patologia post-mortem em animais eutanasiados em vários momentos em diferentes coortes, o que aumenta o número de camundongos necessários para um estudo. Imagens de camundongos em estudos longitudinais podem rastrear a progressão da doença em animais individuais, reduzindo o número de camundongos necessários. Os avanços na tecnologia de ultrassom têm permitido a detecção de alterações no nível micrométrico dos tecidos. A ultrassonografia tem sido usada para estudar a maturação dos folículos nos ovários e o crescimento do xenoenxerto, mas não tem sido aplicada às alterações morfológicas no útero de camundongos. Este protocolo examina a justaposição de patologia com comparações de imagens in vivo em um modelo de camundongo com câncer de endométrio induzido. As características observadas pela ultrassonografia foram consistentes com o grau de alteração observado pela patologia macroscópica e histologia. A ultrassonografia mostrou-se altamente preditiva da patologia observada, apoiando a incorporação da ultrassonografia em estudos longitudinais de doenças uterinas, como câncer em camundongos.
Introdução
Camundongos continuam sendo um dos modelos animais mais importantes para distúrbios reprodutivos 1,2,3. Existem vários modelos de roedores geneticamente modificados ou induzidos de câncer de ovário e útero. Esses estudos tipicamente se baseiam em múltiplas coortes eutanasiadas em diferentes momentos para capturar tendências longitudinais em alterações morfológicas e patológicas. Isso impede a capacidade de adquirir dados contínuos sobre o desenvolvimento do câncer em um camundongo individual. Além disso, sem conhecer o estado de progressão da doença individual em camundongos, os estudos de intervenção são baseados em pontos de tempo predeterminados e achados médios de coortes anteriores, em vez de limiares individuais para a detecção de progressão em um animalespecífico4,5. Portanto, abordagens de imagem que permitam a avaliação longitudinal em animais vivos são necessárias para facilitar modelos pré-clínicos para testar novos fármacos ou compostos e acelerar o entendimento da fisiopatologia, além de aumentar o rigor e a reprodutibilidade6.
A ultrassonografia (US) é um método atraente para o monitoramento longitudinal da progressão do câncer uterino de camundongos, pois é relativamente fácil e barato em comparação com outros métodos de imagem, é fácil de realizar e pode ter resolução notável 6,7. Esta modalidade não invasiva pode capturar características à escala de mícrons em camundongos acordados ou com camundongos sob sedação breve usando um exame de 5-10 minutos. A microscopia ultrassônica foi validada como método para medir o desenvolvimento de folículos ovarianos de camundongos 8 e o crescimento de neoplasias implantadas ou induzidas 9,10,11. A US de alta frequência também tem sido utilizada para injeções intrauterinas percutâneas12 e observação de alterações uterinas em ratas ao longo do ciclo estral13. O US de alta frequência pode ser usado com ratos mantidos em plataformas estacionárias especializadas usando um sistema de trilho para segurar o transdutor/sonda para capturar imagens de alta resolução com posição e pressão padronizadas; no entanto, esse equipamento não está disponível em todas as instituições. Os métodos de varredura por transdutor portátil podem ser adotados com equipamentos menos dedicados e usados tanto para diagnósticos clínicos quanto para aplicações de pesquisa em camundongos.
Resta saber se as imagens dos EUA com sondas portáteis de alta frequência poderiam ser usadas para monitorar o desenvolvimento do câncer uterino ao longo de várias semanas. Semelhante aos intestinos, o útero do roedor é uma estrutura de paredes finas e delgadas, que é muito móvel dentro do abdômen e é contígua através de múltiplas profundidades de tecido, tornando a imagem mais desafiadora do que com órgãos relativamente imóveis, como os rins. Este estudo buscou estabelecer a correlação entre os tecidos observados pela ultrassonografia e histopatologia, definir pontos de referência para a localização do útero de camundongos e determinar a viabilidade da avaliação longitudinal do câncer de endométrio. Este estudo apresenta dados que mostram uma correspondência qualitativa entre a aparência das imagens uterinas por US e a histopatologia, bem como imagens seriadas de camundongos ao longo de várias semanas. Esses resultados indicam que o US portátil pode ser usado para monitorar o desenvolvimento do câncer de endométrio em camundongos, criando assim uma oportunidade para coletar dados longitudinais individuais de camundongos para estudar o câncer uterino sem a necessidade de equipamentos dedicados.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos e experimentos envolvendo camundongos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal da Johns Hopkins. Para todos os procedimentos, foram utilizados EPIs adequados, incluindo luvas e aventais de isolamento descartáveis. Precauções foram tomadas ao manusear materiais perfurocortantes, que foram descartados corretamente em recipientes de caixa vermelha de materiais perfurocortantes imediatamente após o uso. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo.
1. Indução de câncer de endométrio em camundongos iPAD (Pten induzível , deleção dupla Arid1a) com doxiciclina
- Manter 10 camundongos transgênicos Pax8-Cre-Arid1a-Pten de dupla deleção (iPAD) (Figura 1) em um fundo genético misto (129S, BALB/C, C57BL/6), conforme descrito anteriormente14.
- Coletar imagens de ultrassom basais (2D) dos ovários, oviduto e útero de cada camundongo antes do tratamento com doxiciclina.
- Fornecer exclusivamente dietas de ração de camundongo contendo doxiciclina (hiclato de doxiciclina a 625 mg/kg de ração) para camundongos iPAD fêmeas por um mínimo de 2 semanas a partir de 7-8 semanas de idade para induzir a deleção gênica.
2. Configuração do equipamento
- Ligue a almofada de aquecimento e cubra com uma almofada absorvente limpa (temperatura alvo: 38 °C).
- Confirme se o vaporizador de isoflurano e o tanque O2 estão adequadamente cheios. Recarregue e substitua se o conteúdo estiver baixo.
- Conecte a câmara de indução, o cone nasal e o sistema de limpeza ao vaporizador.
- Configure o aparelho de ultrassom.
- Selecione um transdutor (sonda) com uma faixa de 32-56 MHz ou até 70 MHz para imagens do útero ou ovário, respectivamente.
- Conecte a sonda e ligue a máquina.
- Após a inicialização do sistema, use o painel de controle para fazer login com as credenciais do usuário e acessar a tela inicial.
- Na tela inicial, vá para a guia Aplicativos e selecione Modo de abdômen do mouse (pequeno).
- Clique em Digitalizar para retornar à tela inicial e aguarde até que uma imagem ao vivo seja exibida.
- Selecione Modo B nas opções na barra de ferramentas à esquerda.
- Clique em Mais controles para exibir ferramentas adicionais para refinamento de imagem, como ganho e profundidade de imagem, ou para ajustar as configurações de aquisição de clipe, como o número de quadros por segundo.
- Quando as configurações de imagem estiverem selecionadas, retorne à tela inicial clicando em Digitalizar.
- Ligue o tanque O2 , direcione o fluxo para a câmara de indução e ajuste a vazão para 1 L/min.
3. Preparação de ratos para triagem por ultrassom, incluindo depilação
- Coloque um rato na câmara de indução. Ajustar o vaporizador de isoflurano para 2%-3% vol/vol para a indução anestésica.
- Determinar a profundidade apropriada da anestesia por uma falta de resposta ao pinçamento dos dedos dos pés e uma frequência respiratória em torno de 1-2 respirações/s.
- Aplique lubrificante oftálmico estéril em cada olho. Retire o pelo do dorso e ventrum entre a última costela e a pelve com cortadores de tamanho adequado.
- Aplicar uma fina camada de creme depilatório nas regiões ventral e dorsal a serem fotografadas (se necessário).
- Coloque o mouse de volta na câmara de indução por aproximadamente 3-5 min para manter a profundidade adequada da anestesia enquanto o creme depilatório trabalha para remover o cabelo. Após ≤4 minutos, limpe suavemente o creme com uma toalha de papel limpa e úmida.
NOTA: A exposição prolongada ao creme depilatório é irritante e pode causar lesões na pele.
4. Injeção intraperitoneal de líquido para aumentar o contraste entre os órgãos
- Aqueça uma seringa de 3-10 mL cheia de solução de fluido isotônico estéril (por exemplo, NaCl 0,9% estéril ou solução de ringers lactato) a 35-40 °C colocando-a entre uma almofada de aquecimento e uma almofada absorvente por vários minutos. Coloque um frasco de gel de ultrassom na almofada de aquecimento se a máquina não tiver um aquecedor.
- Para um rato de 20-25 g, injecte 1-2 ml de solução na cavidade peritoneal.
- Segure o rato pelo scruff em uma das mãos, expondo o ventrum.
- Segure o mouse em um ângulo de ~20°, com o nariz apontado para o chão para direcionar os órgãos cranialmente devido à gravidade.
- Com agulha de pequeno calibre (25 G, 5/8 de comprimento, seringa tuberculínica), punção através da pele e parede abdominal do quadrante direito caudal do abdome.
- Antes da injeção de líquidos, para evitar a injeção na vasculatura ou no trato gastrointestinal, puxe para trás com pressão mínima. Se entrar sangue ou outro material na seringa, remova a agulha. Use uma nova agulha e seringa e tente novamente em uma posição ligeiramente diferente.
- Se o rato acordar durante as injeções, coloque-o de volta na pequena câmara de indução para anestesia com isoflurano a 2%-3% vol/vol.
5. Ultrassonografia por via dorsal
- Posicione o mouse em decúbito ventral sobre a almofada absorvente sobre uma almofada de aquecimento (Figura 2A-C).
- Coloque um cone de nariz de roedor firmemente sobre o nariz e o focinho do rato. Manter a profundidade anestésica com isoflurano administrado através do cone nasal a 1%-2% vol/vol em 100% deO2. Aplique lubrificante oftálmico estéril, conforme necessário, em cada olho.
- Monitore o mouse para uma frequência respiratória regular (1-2/s) e uma falta de resposta de pinça do dedo do pé para indicar se a anestesia precisa ser ajustada.
- Coloque uma pequena quantidade (~0,5-1 mL) de gel de ultrassom pré-aquecido abaxial (lateral) na coluna vertebral de cada lado do camundongo anestesiado, entre a última costela e a pelve.
- Coloque uma pequena quantidade de gel na sonda de ultrassom.
- Coloque a sonda paralela às vértebras com a frente da sonda no lado cranial. Uma marca indicadora está presente na cabeça da sonda para indicar a orientação adequada da sonda. Registre o dia, a hora, a identificação do animal, a orientação da sonda e o lado do animal (direito, esquerdo, dorsal, ventral) para cada novo conjunto de imagens coletadas.
- Com um camundongo em decúbito ventral (pele do dorso tocando a sonda), varrer lentamente a área para o ponto de referência renal (Figura 2B e Figura 3). Com o rim em vista, truxe a sonda caudal para encontrar o ovário - uma estrutura oval a redonda levemente hiperecoica (Figura 4A, B) dentro de um coxim adiposo ovariano muito hiperecoico que é limitado crânio-ventralmente pelo rim e dorso-lateralmente pela parede abdominal dorsal.
OBS: A pressão caudal e lateral ao ovário pode direcionar o ovário para mais perto da parede abdominal e para longe das alças do intestino. O ovário é posicionado anatomicamente contra a parede abdominal dorsal, apenas ventral e lateral aos músculos epaxiais e caudal ao rim. - Ajuste o ganho de sinal usando o controle deslizante na parte inferior da tela de controle para melhorar o contraste da imagem.
- Para melhorar a imagem do rim, aplique pressão com um dedo no abdome contralateral. Varie a pressão e o ângulo de diretamente paralelo à coluna vertebral para ~20° ventral.
- Quando o órgão de interesse estiver à vista, colete um vídeo clicando em Salvar Clipe ou Iniciar Gravação e, em seguida, em Parar Gravação quando concluído para reter imagens em um número predefinido de quadros.
- Salve quadros únicos de uma imagem ao vivo ou gravação com o botão Salvar quadro .
- Para obter imagens do útero, puxe a sonda caudalmente até que o ovário esteja no aspecto mais cranial do campo de visão. Varie a pressão e o ângulo da sonda até que o útero esteja à vista.
- Repita a coleta de vídeos e quadros para cada órgão de interesse.
- Localiza-se o útero longitudinalmente ao longo da parede abdominal dorsal com a musculatura lateral da perna também em vista (Figura 4B).
NOTA: O tamanho do útero e o diâmetro do lúmen podem variar com a fase do estro e o estado da doença. - Monitorar o tecido quanto ao movimento peristáltico para diferenciar as alças intestinais dos cornos estacionários uterinos.
6. Coletar imagens de uma abordagem ventral
- Coloque o camundongo em decúbito dorsal e verifique se a lubrificação ocular é suficiente e se o focinho está firmemente no cone nasal (Figura 2A).
- Aplicar uma pequena quantidade (~0,5-1 mL) de gel de ultrassom pré-aquecido no abdome ventral e aplicar a sonda na linha média apenas cranial do púbis para localizar a bexiga como um marco hipoecoico (Figura 5).
NOTA: Se a bexiga for muito grande e obscurecer a imagem do útero, uma pressão suave pode ser colocada no abdômen inferior para expressar a urina. - Puxe a sonda lateralmente à bexiga para encontrar os cornos uterinos. Aplique uma leve pressão digital de um ou ambos os lados do mouse para trazer os chifres para o campo de visão. Segure a sonda perpendicularmente ao mouse e escaneie ambos os lados do abdômen para capturar vistas transversais (seções transversais) de ambos os chifres. Gire a sonda para capturar visualizações sagitais.
- Após o ultrassom, limpe o mouse de gel com um papel toalha e devolva-o à gaiola para se recuperar. Os ratos estão totalmente acordados em 2-5 min. Quando estiver totalmente acordado e deambulando, devolva o rato ao biotério.
NOTA: Uma almofada de aquecimento em fogo baixo pode ser colocada sob a gaiola para aquecer a gaiola para recuperação. - No ponto final experimental ou humano, eutanasiar o rato. O ideal é eutanasiar o rato na gaiola caseira para reduzir o estresse; alternativamente, coloque o mouse em uma câmara limpa. Forneça CO2 pressurizado a uma taxa de deslocamento de 10%-30% do volume da câmara por minuto. Após aproximadamente 5 min sem respiração visível, verificar óbito por luxação cervical. Proceder à necropsia abdominal para retirada do tumor.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Camundongos transgênicos Pax8-Cre-Arid1a-Pten de dupla deleção (iPAD) foram mantidos em um background genético misto (129S, BALB/C, C57BL/6), como descrito anteriormente14. Todos os camundongos foram alimentados com uma ração de doxiciclina por 2 semanas para induzir Cre recombinase. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, a doxiciclina foi dosada por gavagem14; No entanto, neste estudo, o método de indução alimentar com doxiciclina funcionou eficientement...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo examina a utilidade da ultrassonografia para avaliar alterações morfológicas uterinas na progressão do adenocarcinoma no útero em camundongos. Neste estudo, ao acompanhar a indução do câncer de endométrio em camundongos longitudinalmente, os detalhes anatômicos detectados pela ultrassonografia mostraram-se indicadores de patologia macroscópica e histológica. Isso abre a porta para o uso de estudos longitudinais com um número menor de camundongos monitorados por ultrassom em vários pontos de tempo para acom...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Somos gratos pelo financiamento do NCI Ovarian Cancer SPORE Program P50CA228991, do programa de treinamento de pós-doutorado 5T32OD011089 e do Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. O projeto também foi parcialmente financiado pelos subsídios para despesas correntes para Instituições Privadas de Ensino Superior da Corporação de Promoção e Ajuda Mútua para Escolas Privadas do Japão.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes e Equipamentos Usados para Cuidados com Animais | |||
| Dieta para Roedores (2018, 625 Doxiciclina) | Envigio | TD.01306 | Ração para Camundongos |
| Reagentes e Equipamentos Usados para Imagens de Ultrassom | |||
| 10 mL injetável 0,9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Fluido Isotônico |
| com Suporte de Plástico | Daigger | EF8313 | Almofadas Absorventes |
| Câmaras de Indução de Anestesia | Harvard Apparatus | 75-2029 | Câmara de Indução |
| Kit absorvedor anestésico com recipiente absorvedor, suporte, tubulação e adaptadores | CWE, Inc | 13-20000 | Cone de nariz e tubulação |
| Aquasonic Clear Gel de ultrassom (0,25 litro) | Parker Laboratoies | 08-03 | Gel de ultrassom |
| BD Plastipak Seringa de 3 mL | BD Biosciences | Seringa | de 309657 |
| F / Air Scavenger Recipiente de carvão | OMNICON | 80120 | Sistema de limpeza para anestesia |
| Isoflurano, USP | Vet One | 502017 | Agente de anestesia |
| M1050 Máquina de anestesia | móvel sem reinalação | Vaporizador Anestésico | M1050 |
| MX550S, Transdutor de 25-55 MHz, 15mm, | Transdutor de Ultrassom | VisualSonics | MX550S |
| Nair Hair Aloe & Loção de Depilação de Lanolina - 9.0 oz | Creme Depilador | Nair | |
| Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| Agulha PrecisionGlide 25 G 1" | Biosciences | 305125 | Agulha |
| Pomada Oftálmica Puralube | Colírio Lubrificante | Dechra | 17033-211-38 |
| Vevo 3100 Imaging Sistema | VisualSonics | Vevo 3100 | Máquina de Ultrassom |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Software de Análise de Ultrassom |
| Almofada de Aquecimento de Vinil com tampa, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Almofada de Aquecimento |
| Elementos Wd 2TB Armazenamento Básico | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Armazenamento de Dados |
| < reagentes e equipamentos > fortes usados para imuno-histoquímica< / forte > | |||
| 10% p / v Formalina | Fischer Scientific | SF98-4 | Tampão de fixação de tecido |
| Bloqueador e diluente sem animais, RTU | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Lâminas de Vidro | VWR | 4831-703 | Lâminas de Montagem de Tecido |
| Buffer de Citrato | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Tampão Retrival de Epítopo (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resina para Vedação |
| de Lâminas Vidro de Cobertura de Vedação Dourada | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Forno para derreter substrato Parraffin |
| ImmPACT DAB, peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Substrato de Desenvolvimento de Sinal |
| ImmPRESS HRP Kit de Detecção de Polímero Anti-Coelho IgG de Cabra, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Anticorpo IHC Secundário |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vaporizador de Vegetais para Epítopo Retrival |
| coelho mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Anticorpo IHC primário (1: 1.000) |
| coelho mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Anticorpo IHC primário (1: 100) |
| Scotts Substituto de água da torneira | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" |
| Buffer Tissue Path IV | Fischer Scientific | 22272416 | Fixação de Tecido |
| Trilogia Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Buffer Retrival de Epítopo (ARID1a) |
Referências
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5(2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125(2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238(2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106(2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038(2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717(2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144(2021).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
