Microdissecção e Visualização por Microscopia Eletrônica de Varredura de Montagem Completa do Plexo Coroide de Camundongos

Summary

O plexo coroide (PC), um tecido pouco estudado em neurociência, desempenha um papel fundamental na saúde e doença do sistema nervoso central. Este protocolo descreve uma técnica de microdissecção para isolamento do CP e o uso de microscopia eletrônica de varredura para obter uma visão global de sua estrutura celular.

Abstract

O plexo coroide (PC), uma estrutura altamente vascularizada que se projeta para os ventrículos do cérebro, é um dos tecidos mais pouco estudados na neurociência. Como está ficando cada vez mais claro que essa minúscula estrutura desempenha um papel crucial na saúde e na doença do sistema nervoso central (SNC), é de extrema importância dissecar adequadamente o PC para fora dos ventrículos cerebrais de uma forma que permita o processamento a jusante, desde a análise funcional até a estrutural. Aqui é descrito o isolamento da PC lateral e do quarto ventrículo cerebral de camundongos sem a necessidade de ferramentas ou equipamentos especializados. Essa técnica de isolamento preserva a viabilidade, a função e a estrutura das células dentro do PC. Devido à sua alta vascularização, o PC pode ser visualizado flutuando dentro das cavidades ventriculares do cérebro usando um microscópio binocular. Entretanto, a perfusão transcárdica necessária para análise a jusante pode dificultar a identificação do tecido do PC. Dependendo das etapas de processamento adicionais (por exemplo, análise de RNA e proteínas), isso pode ser resolvido visualizando o CP via perfusão transcárdica com azul de bromofenol. Após o isolamento, o PC pode ser processado usando várias técnicas, incluindo análise de RNA, proteína ou célula única, para obter maior compreensão sobre a função dessa estrutura cerebral especial. Aqui, a microscopia eletrônica de varredura (MEV) em todo o CP de montagem é usada para obter uma visão geral da estrutura.

Introduction

Barreiras apertadas separam o sistema nervoso central (SNC) da periferia, incluindo a barreira hematoencefálica (BHE) e a barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (LCR). Essas barreiras protegem o SNC contra insultos externos e garantem um microambiente equilibrado e controlado ^1,2,3. Embora a BHE tenha sido extensivamente estudada ao longo do tempo, a barreira sangue-LCR localizada no plexo coroide (CP) só ganhou crescente interesse de pesquisa durante a última década. Esta última barreira pode ser encontrada nos quatro ventrículos cerebrais (Figura 1A<....

Protocol

Todos os experimentos com animais descritos neste estudo foram conduzidos de acordo com a legislação nacional (Lei belga 14/08/1986 e 22/12/2003, Decreto Real Belga 06/04/2010) e europeia (Diretivas UE 2010/63/UE, 86/609/CEE). Todos os experimentos em camundongos e protocolos em animais foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Ghent (números de licença LA1400091 e EC 2017-026).

1. Preparo

1. Anestésicos: Preparar um anestésico terminal. Por exemplo, uma solução de pentobarbital sódico (≥100 mg/kg) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pode ser preparada.
2. Solução de perfusão transcárdi....

Results

O protocolo descrito facilita o isolamento eficiente do CP dos ventrículos lateral (Figura 2A-C) e quarto (Figura 2D-F) do cérebro de camundongos. Após o isolamento de todo o cérebro, fórceps são usados para hemisseccionalmente o cérebro e identificar os CPs flutuando nos ventrículos laterais. A PC do quarto ventrículo pode ser isolada do lado cerebelar do cérebro. A perfusão com azul de bromofe.......

Discussion

Aqui é descrito um método para isolar o plexo coroide (PC) do ventrículo lateral e do quarto ventrículo de um cérebro de camundongo. Todo esse método de montagem do CP facilita análises posteriores utilizando um repertório de técnicas para obter uma visão completa da morfologia, composição celular, transcriptoma, proteoma e secretoma do CP. Tais análises são cruciais para obter uma melhor compreensão dessa notável estrutura que se projeta dos ventrículos do cérebro. Esse conhecimento é de imenso interesse de pesquisa, po.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
26G x 1/2 agulha	Henke Sass Wolf	4710004512
Montagens de amostra de alumínio	EM Sciences	75220
Tampão de cacodilato	EM Sciences	11652
Lâminas cirúrgicas de aço carbono	Swann-Morton	0210	tamanho: 0,45 mm x 12 mm
Abas adesivas de carbono -12 mm	EM Sciences	77825-12
Secador de ponto crítico	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	Zeiss		SEM sistema
Fórceps	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Glutaraldeído	EM Sciences	16220
Heparina	Sigma-Aldrich	H-3125
Ismatec Reglo ICC Bomba peristáltica digital 2 canais	Metrohm Belgium N.V	CPA-7800160
Tetróxido de ósmio	EM Sciences	19170
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platina	Quorum	Q150T ES	PBS sem Ca++ Mg++ ou vermelho de fenol;
pentobarbital de sódio	Kela NV	514
Cesta de espécimes em aço inoxidável	EM Sciences	70190-01
Stemi DV4 Microscópio estéreo	Zeiss
Tesoura cirúrgica	Fine Science Tools GmbH	Rolamento 91460-11