Summary
Detta protokoll beskriver ett in vitro-migrationsexperiment som är lämpligt för funktionell analys av molekylerna som är involverade i in vivo-migrationen av neurala vapenceller till den hyaluronanrika extracellulära matrisen.
Abstract
Neurala vapenceller (NCC) är högvandrande celler som härrör från neuralrörets dorsala region. Utvandringen av NCC från neuralröret är en viktig process för NCC-produktion och deras efterföljande migration mot målplatser. Migrationsvägen för NCC, inklusive de omgivande neuralrörsvävnaderna, involverar hyaluronan (HA) -rik extracellulär matris. För att modellera NCC-migration till dessa HA-rika omgivande vävnader från neuralröret etablerades i denna studie en blandad substratmigrationsanalys bestående av HA (genomsnittlig molekylvikt: 1 200-1 400 kDa) och kollagen typ I (Col1). Denna migrationsanalys visar att NCC-cellinjeceller, O9-1, är högvandrande på det blandade substratet och att HA-beläggningen bryts ned vid platsen för fokala adherenser under migreringsförloppet. Denna in vitro-modell kan vara användbar för vidare utforskning av den mekanistiska grunden som är involverad i NCC-migration. Detta protokoll är också tillämpligt för att utvärdera olika substrat som ställningar för att studera NCC-migration.
Introduction
Neurala vapenceller (NCC) är en multipotent cellpopulation som är närvarande i utvecklande embryon, och de härstammar från neuralplattgränsen under neurulation. De bidrar till bildandet av en mängd olika vävnader, inklusive det perifera nervsystemet, hjärt-kärlsystemet, kraniofaciala vävnader och skelettet1. Efter induktion och NCC-specifikation vid nervplattgränsen emigrerar NCC från neuroepitelet och migrerar mot NCC-härledda vävnadsställen1.
Hyaluronan (HA) är en icke-sulfaterad glykosaminoglykan som distribueras i en mängd olika vävnader som en komponent i den extracellulära matrisen (ECM). Betydelsen av HA i embryoutveckling har visats i modellsystem genom ablation av gener som är ansvariga för hyaluronans metabolism. Till exempel visade sig mutationer i hyaluronansyntasgener (Has1 och Has2) i Xenopus leda till NCC-migrationsdefekter och kraniofacial missbildning2. Dessutom har de HA-bindande proteoglykanerna, aggrecan och versican, rapporterats ha hämmande effekter på NCC-migration3. Hos möss leder Has2-ablation till allvarliga defekter i endokardiell kuddebildning, vilket resulterar i mid-gestation (E9.5-10) dödlighet 4,5,6.
Transmembranprotein 2 (Tmem2), ett hyaluronidas på cellytan, har nyligen visat sig spela en avgörande roll för att främja integrinmedierad adhesion och migration av cancerceller genom att avlägsna matrisassocierad HA vid adhesionsställena 7,8. Mer nyligen har Inubushi et al.9 visat att en brist på Tmem2 leder till allvarliga kraniofaciala defekter på grund av avvikelser i NCC-utvandring/migration och överlevnad. I föregående studie9 analyserades Tmem2-uttryck under NCC-bildning och migration. Tmem2-uttryck observerades vid delamineringen av NCC och vid emigrerande Sox9-positiva NCC (figur 1). Dessutom, med användning av Tmem2-utarmade O9-1-celler från mus, visade studien att in vitro-uttrycket av Tmem2 var avgörande för att O9-1-cellerna skulle bilda fokala adherenser och för deras migration till HA-innehållande substrat (figur 2 och figur 3)9.
Dessa resultat indikerar starkt att Tmem2 också är viktigt för NCC-adhesion och migration genom HA-rik ECM. Den molekylära mekanismen för NCC-adhesion och migration inom HA-rich ECM är dock fortfarande oklar. Det är därför nödvändigt att etablera ett experimentellt system för in vitro-odling för att fullt ut utforska NCC-adhesion och migration inom HA-rik ECM.
Av de många metoder som används vid testning av cellmigration är cellsårstängningsbaserad analys en enkel metod som ofta används inom fysiologi och onkologi10. Detta tillvägagångssätt är användbart på grund av dess relevans för in vivo-fenotypen och är effektivt för att bestämma rollerna för läkemedel och kemoattractants under cellmigration11. Det är möjligt att utvärdera migrationsförmågan hos både helcellsmassor och enskilda celler genom att mäta cellgapavstånden över tid11. I detta manuskript introduceras en modifierad in vitro sårstängningsbaserad analys för att modellera NCC-migration till HA-rika vävnader som omger neuralröret. Denna procedur är också tillämplig för att studera olika ECM-komponenter (dvs. kollagener, fibronektin och laminin) för att analysera ECM-ställningens roll i NCC-migration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer godkändes av djuretikkommittén vid Osaka University Graduate School of Dentistry.
1. Odling av muskraniala neurala vapenceller
OBS: Den neurala kamcellinjen som användes i denna studie består av O9-1-celler, ursprungligen härledda från Wnt1-Cre; R26R-GFP-uttryckande celler isolerade från E8.5-musembryon12 (se diskussion). Metoden som beskrivs här för odling av O9-1-celler följer ett tidigare etablerat protokoll13.
- Förbered den matrisbelagda plattan med basalmembran.
- Tina basalmembranmatrisen (se materialförteckning) på is. Späd matrisen 1:50 i kyld 1x PBS och håll på is.
- Belägg en 10 cm odlingsplatta med 10 ml av den utspädda basalmembranmatrislösningen. Inkubera plattan vid rumstemperatur i 1 timme och aspirera matrisen före användning.
- Tvätta plattan 3x med 2 ml PBS.
- Kultur O9-1-celler på basalmembranets matrisbelagda platta.
- Värm hela embryonala stamcellsmediet (ES) (se materialförteckningen) i ett vattenbad vid 37 °C.
- Blanda försiktigt O9-1-cellsuspensionen (se Materialförteckning) och räkna antalet celler med hjälp av en automatiserad cellräknare (se Materialförteckning). Justera cellkoncentrationen till 1,1 × 106/ml med komplett ES-cellmedium.
- Tillsätt 8 ml förvärmt komplett ES-cellmedium till den matrisbelagda 10 cm odlingsplattan och frö O9-1-cellerna vid 1,1 x 106 celler / platta. Inkubera vid 37 °C i en 5 % CO2 fuktad inkubator.
- Nästa dag, ersätt mediet med färskt komplett ES-cellmedium (förvärmt till 37 °C). Byt ut med färskt medium var 2-3: e dag därefter.
OBS: När cellerna är ungefär 80% konfluenta (3-4 dagar efter plätering) kan de dissocieras med 0,25% trypsin-EDTA och passeras vidare eller frysas för senare användning. Representativa bilder av O9-1-celler visas i figur 1. - Tvätta odlingsplattan med 2 ml 1x PBS före trypsinisering. Tillsätt 2 ml förvärmd 0,25% trypsin-EDTA och inkubera i 5 min vid 37 °C. Kontrollera om det finns fullständig cellavlossning; Knacka försiktigt på sidan av plattan ett par gånger om det behövs.
- Tillsätt 2 ml förvärmt komplett ES-cellmedium till odlingsplattan och överför de dissocierade cellerna till ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera röret vid 300 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten utan att störa cellpelleten. Tillsätt sedan 2 ml förvärmt komplett ES-cellmedium till röret och resuspendera cellerna noggrant genom pipettering. Frö cellerna på en ny odlingsplatta med önskad celldensitet.
- Alternativt kan man bereda en fryst cellstam genom att tillsätta 1 ml cellfrysningsmedium innehållande 10 % dimetylsulfoxid (DMSO) till röret i stället för ett fullständigt ES-cellmedium och grundligt suspendera cellerna. Överför cellsuspensionen till kryorör och förvara vid −80 °C.
2. Beredning av den HA/Col1-belagda skålen
OBS: Den ursprungliga metoden att belägga HA/Col1 på glasbottenskålar föreslogs av Irie et al.7.
- Tillsätt försiktigt 50 μl outspädd trietoxisilan till en 3,5 cm glasbottenskål (se Materialtabell). Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur (RT) och skydda mot ljus.
OBS: Inkubationen med trietoxisilan bör inte överstiga 5 minuter. Detta kan påverka beläggningseffektiviteten och producera oönskade produkter. - Tvätta skålen snabbt 3x med 2 ml destillerat vatten. Tillsätt 50 μL 0,25% glutaraldehyd, utspädd 100x i PBS, per maträtt och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Tvätta snabbt 4x med 2 ml PBS. Täck sedan diskarna med 300 μL kollagen typ I i 0,2 N ättiksyra vid rumstemperatur i 1 timme.
- Tvätta snabbt 3x med 2 ml PBS. Tillsätt 300 μL 200 μg/ml fluoresceinaminmärkt natriumhyaluronat-H2 (FAHA-H2) (utspätt i PBS) till varje skål och inkubera över natten vid rumstemperatur. Tvätta igen 3x med 2 ml PBS. Efter aspirering av PBS, lufttorka plattan i 5 minuter på en ren bänk.
FAHA-H2 är ett fluoresceinaminmärkt natriumhyaluronat med en genomsnittlig molekylvikt som sträcker sig från 1 200-1 600 KDa. HA med lämplig molekylvikt kan användas enligt forskningsdesignen.
3. Migrationsanalys på den HA/Col1-belagda skålen
OBS: En sårförslutningsbaserad analys med definierade 500 μm cellfria luckor i Col1 / HA-substrat utfördes med 2-brunnsodlingsinsatser (se materialtabell). O9-1-cellerna uttrycker Tmem2, vilket krävs för vidhäftning och nedbrytning av HA i det extracellulära utrymmet9 (figur 2 och figur 3).
- Efter torkning av den belagda glasbottenskålen, fäst 2-brunnskulturinsatserna på diskarna och fyll insatserna externt med 1 ml PBS.
- Frö O9-1-cellerna i brunnarna vid 1 x 104 celler i 100 μL av Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) innehållande 2% fetalt bovint serum (FBS) per insats. Odla cellerna i 2 dagar vid 37 °C i en 5% CO2 fuktad inkubator.
- Ta försiktigt bort insatserna från de belagda glasbottenskålarna med pincett. Tvätta de belagda glasbottenskålarna försiktigt med 2 ml 1x PBS för att ta bort cellerna och cellskräpet. Tillsätt 2 ml färsk DMEM innehållande 2% FBS i odlingsrätterna.
- Ta faskontrastbilder nu som startpunkt med ett allt-i-ett-fluorescensmikroskop i svartvitt läge med högupplösta inställningar (förstärkning vid 6 dB, ingen binning). Objektivlinser med förstoringar på 4x till 20x användes för avbildning i denna studie (se materialtabell).
Ta faskontrastbilder med motsvarande skalstreck och spara dem i TIFF-format. - Odla cellerna i ytterligare 48 timmar vid 37 °C och 5 %CO2. Ta faskontrastbilder vid 24 timmar och 48 timmar i kultur med allt-i-ett-fluorescensmikroskopet.
- Fixera cellerna vid 48 timmar med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minuter vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C. Tvätta sedan disken 3x i 5 minuter vardera med 1 ml färsk PBS.
- Placera ett täckglas med monteringsmedium (se Materialförteckning) för ytterligare morfologisk observation.
OBS: Diskarna kan avbildas omedelbart eller förvaras i upp till 2 månader vid 4 °C. - Valfritt: Immunmärk cellerna för proteiner av intresse.
OBS: Ett protokoll för att detektera fokal adhesion (FA) -komplexet med hjälp av en mus-härledd monoklonal anti-vinculin-antikropp (se materialförteckning) beskrivs här som ett exempel.- Inkubera disken (från steg 3.6) med 0,5 ml blockerande buffert (5% normalt getserum i PBS) i 60 minuter.
OBS: Välj en lämplig blockerande buffert för den primära antikroppen. En typisk blockerande buffert skulle vara 5% normalt serum från samma art som den sekundära antikroppen som används. - Bered den utspädda primära antikroppen i antikroppsspädningsbuffert (1 % normalt getserum i PBS). Inkubera disken med 0,5 ml utspädd primär antikropp över natten vid 4 °C.
OBS: Välj lämplig antikroppsutspädningsbuffert. Typiskt används antikroppen vid en spädning på 1:50-1:200. - Skölj 3x i 5 minuter vardera med 2 ml PBS. Bered den utspädda sekundära antimusantikroppen från get i antikroppsutspädningsbufferten (1 % normalt getserum i PBS). Inkubera diskarna med 0,5 ml utspädd sekundär antikropp i 1-3 timmar vid rumstemperatur.
OBS: Vanligtvis används den sekundära antikroppen vid en spädning på 1: 500-1: 1 000. DAPI kan användas för färgning av kärnorna. - Skölj 3x med 2 ml PBS i 5 minuter varje gång. Placera täckglaset med 50 μL monteringsmedium.
OBS: Diskarna kan avbildas med allt-i-ett-fluorescensmikroskopet med ett GFP-filter (excitation: 470/40, emission: 525/50) och ett TexasRed-filter (excitation: 560/40, emission: 630/75) i svartvitt läge med högupplösta inställningar (förstärkning vid 6 dB, ingen binning). Objektivlinser med förstoringar på 4x till 20x användes för avbildning i denna studie.
OBS: Glaset kan förvaras i upp till 2 månader vid 4 °C.
- Inkubera disken (från steg 3.6) med 0,5 ml blockerande buffert (5% normalt getserum i PBS) i 60 minuter.
4. Analys av data
- Öppna programvaran ImageJ 1.51s. I ImageJ-fönstret väljer du Arkiv > Öppna från menyraden för att öppna den sparade bildfilen.
- För att ställa in mätskalan, rita en linje med samma avstånd som skalstapeln. Gå till Analysera > Ange skala och skriv in det kända avståndet och radenheterna i lämpliga rutor i fönstret Ange skala .
- Rita en rak linje mellan cellgapet och tryck på Analysera > mått för att överföra värdena till ett datafönster. Mät minst fem olika positioner i varje prov och beräkna medelvärdet av avstånden för att erhålla representativa provdata. Utför de statistiska analyserna med lämplig programvara (se Materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En migrationsanalys utfördes på blandade substrat bestående av Col1 och högmolekylvikt HA (genomsnittlig molekylvikt: 1 200-1 400 kDa) med hjälp av det protokoll som beskrivs här. O9-1-celler vid gränsen för gapet visade sig lätt migrera till det HA-rika gapet (figur 4). Immunfärgning för en FA-markör, vinculin14, bekräftade att O9-1-cellerna bildade fokala vidhäftningar (FA) vid platserna för HA-nedbrytning (figur 5).
Figur 1: TMEM2-uttryck i NCC. Tvärsnitt av neuralröret hos Tmem2-FLAG KI-embryon vid E9.0. (A) Sektioner på kranial- och bålnivå i neuralröret dubbelmärktes för TMEM2-FLAG-proteinet och HA. TMEM2-uttryck observerades i neuralplattan och gränsregionen för neuralröret (fyllda pilspetsar), medan dessa platser saknade HA-färgning (öppna pilspetsar). (B) Dubbelmärkning av nervkamcellerna för TMEM2-FLAG och Sox9. Tvärsnitt av E9.0-neuralröret färgades för TMEM2-FLAG och Sox9. Sox9-positiva pre-migrerande och emigrerande NCC vid kanten av neuralröret uttryckte högt TMEM2. Förkortning: nt = neuralrör. Skalstänger: (A) 300 μm; b) 100 μm. Anpassad med tillstånd från Inubushi et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Nedbrytning av HA med TMEM2 i O9-1-celler. (A) Representativa bilder av Tmem2-utarmade och kontroll-O9-1-celler odlade på en vanlig odlingsskål (vänster). (B) Uttryck av Tmem2 i dessa celler utvärderades med qPCR, med Gapdh som en intern kontroll för normalisering (stapeldiagram). Medel ± SD (n = 5) visas som horisontella staplar. p < 0,001 genom oparad Students t-test. Skalstång, 5,0 μm. (C) Cellbaserad hyaluronidasanalys. Tmem2-utarmade och kontroll-O9-1-celler odlades i 48 timmar på glastäckglas belagda med fluoresceinerad HA (FA-HA). HA-nedbrytande aktivitet avslöjas som mörka områden i den fluorescerande bakgrunden. Nivån av HA-nedbrytning jämfördes också kvantitativt mellan Tmem2-utarmade och kontroll-O9-1-celler som beskrivs i Material och metoder (stapeldiagram). Data representerar medelvärde ± SD av fluorescensintensiteten under en cell i förhållande till den i det cellfria området (n > 50 celler per tillstånd poolat från tre oberoende experiment). p < 0,001 genom oparad Students t-test. Antagen med tillstånd från Inubushi et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Nedbrytning av substratbunden HA vid FA i O9-1-celler. Cellbaserade hyaluronidasanalyser utfördes i 16 timmar och celler färgades för vinkulin. I kontroll O9-1-celler sker HA-nedbrytning i vinkulinpositiva FA. I Tmem2-utarmade O9-1-celler minskar HA-nedbrytningen och FA-bildningen kraftigt. Antalet FA per cell jämfördes kvantitativt mellan Tmem2-utarmade och kontroll-O9-1-celler (stapeldiagram). Data representerar medelvärde ± SD (n >30 celler per tillstånd poolade från tre oberoende experiment). p < 0,001 genom oparad Students t-test. Antagen med tillstånd från Inubushi et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa bilder av O9-1-cellmigration till ett cellfritt gap på blandade Col1 / HA-substrat. (A) Den övre panelen visar luckorna i början av experimentet (dag 0). De nedre panelerna visar gapbilder efter 24 h (dag 1) eller 48 h (dag 2) inkubation. Skalstapel = 150 μm. (B) Ett stapeldiagram som visar den kvantitativa analysen av cellmigration. Data representerar medelvärdet ± SD för gapområdet som täcks av migrerande celler i förhållande till området för det ursprungliga gapet (n = 5 per tillstånd). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 genom oparad Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Nedbrytning av HA i de blandade Col1/HA-substraten vid FA i O9-1-celler. O9-1-celler odlade på blandade substrat bestående av Col1 / HA immunmärktes med anti-vinculin-antikropp (röd). De mörka fläckarna/strecken representerar HA-nedbrytningsaktivitet i FAHA-H2-substratet (grönt). Platserna för HA-nedbrytning och fokala vidhäftningar (vinculin) samlokaliserades på de blandade substraten (pilspetsar). Skalstapel = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika ECM-komponenter reglerar NCC-utvandring/migrering. Till exempel reglerar HA positivt NCC-migrering 2,15. Intressant nog belyste en studie baserad på genetiska musmodeller av Tmem2, ett hyaluronidas på cellytan, kravet på HA-nedbrytning vid NCC-migration9. Kollagener finns också rikligt i ECM som omger neuralröret16. Dekorin, en liten leucinrik proteoglykan, har visat sig reglera NCC-migration under neural utveckling17. Andra ECM-komponenter, inklusive laminin och fibronektin, påverkar NCC-vidhäftning och migration18. ECM-komponenternas specifika roller i NCC-migreringen är dock fortfarande okända.
In vitro-modellen som beskrivs här syftar till att undersöka beteendet hos migrerande NCC som stöter på HA-rik ECM. Vi valde 2D, snarare än 3D, substrat på grund av svårigheterna att framställa sammansatta kollagen-HA-geler med enhetliga geleringsegenskaper. I ett 2D-odlingssystem skiljer sig de rumsliga gradienterna för de lösliga faktorkoncentrationerna och styvheterna hos de extracellulära matrissubstraten från de för levande vävnad19. Ur denna synvinkel har ett 3D-odlingssystem stora fördelar och kan ge djupare insikter i cellmigrationsmekanismer20,21. I detta sammanhang är inrättandet av ett 3D-analyssystem att föredra, om tillämpligt. Denna in vitro-experimentella modell kan vara tillämplig för att undersöka NCC-migrationsbeteende som svar på olika ECM-komponenter. Detta skulle möjliggöra en bättre förståelse av den mekanistiska grunden för NCC-migration, som styr embryomorfogenes.
O9-1-cellerna som användes i denna studie uttrycker stabilt stamcellsmarkörer (CD44, Sca-1 och Bmi1) och neurala vapenmarkörer (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, Crabp1, Epha2 och Itgb1). Under icke-differentierande odlingsförhållanden upprätthåller O9-1-celler multipotenta stamcellsliknande egenskaper. O9-1-celler har potential att differentieras till flera celltyper, inklusive osteoblaster, kondrocyter, glattmuskelceller och gliaceller under specifika odlingsförhållanden12. Därför är O9-1-celler ett användbart verktyg för att undersöka de molekylära egenskaperna hos kranial NCC-migration och differentiering. Användningen av primära NCC (t.ex. från embryonala neuralrör från kyckling eller mus) istället för O9-1-celler kommer dock att ge mer detaljerade data för att underlätta en bättre förståelse av arten av NCC-migration.
I den sårstängningsbaserade migrationsanalysen kommer NCC också att föröka sig och ökningen av cellantalet kommer också att bidra till expansionen av cellpopulationen till gapområdet22. För att minimera spridningen under sårläkningsanalys är serumsvält den vanligaste metoden istället för att använda farmakologiska medel23. Effekterna av serumsvält bör dock testas i varje celltyp.
Det mest kritiska steget i detta protokoll är att tillsätta den kovalenta beläggningen av HA till glasbottenskålarna. Ytbehandling av glas med silanreagens används för analys av fokala vidhäftningar till ECM-substrat24. Trietoxisilan är en organisk kiselförening som innehåller många fria aminogrupper som kan binda till fria hydroxylgrupper på kiseldioxidglasytor25. En teknik utvecklades och optimerades i denna studie för att producera ett tunt, stabilt silanskikt på en kiselglasyta med trietoxisilan. Aminen i den trietoxisilanbelagda glasytan kan binda karboxylgrupperna på HA, vilket följaktligen kemiskt immobiliserar HA på glasytan8. Med denna metod är det emellertid inte möjligt att binda andra proteinbaserade ECM-substrat till glasytan. Därför användes glutaraldehyd här för att kemiskt immobilisera typ I-kollagenet genom aminkoppling till aldehyden. I synnerhet kan otillräcklig HA-beläggning leda till avlägsnande av HA-beläggningen även utan enzymatisk nedbrytning (t.ex. genom verkan av mekanisk kraft under celladhesion och migration). Beläggning med ECM-substrat i stället för kollagen typ I är möjlig, förutsatt att substraten har amingrupper. Det kan dock finnas begränsningar i att kovalent belägga ECM på glasbottenskålar på grund av substratets kemiska egenskaper; Således kan försök och fel krävas.
Även om det inte är en perfekt modell för att efterlikna NCC-migration till den HA-rika ECM som omger neuralröret, kan detta in vitro-migrationsexperiment vara användbart för funktionell analys av molekylerna som är involverade i NCC-migration in vivo . Dessutom kan denna in vitro-analys vara användbar för terapeutisk läkemedelsscreening för att påskynda eller förhindra HA-nedbrytning , liksom migrering av andra celltyper, inklusive hudfibroblaster och keratinocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren förklarar att det inte finns några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Jag uttrycker stort erkännande till Fumitoshi Irie och Yu Yamaguchi för deras uppmuntran och vänliga förslag för att etablera denna metod. Detta arbete stöddes av bidrag till vetenskapliga forskningsprogram från Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 till TI, #20H03896 till TI). Den ursprungliga metoden för beläggning av HA på glassubstrat och in situ HA-nedbrytningsanalyser på substraten beskrevs i Yamamoto et al. (2017) 8, medan metoden för beredning av HA/Col1 blandade substrat beskrevs i Irie et al. (2021) 7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
