Artigo de método

Determinação de limites térmicos para zooplâncton usando um bloco de calor

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DOI:

10.3791/64762

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18 de novembro de 2022

 ,  , 
1Biology Department, Swarthmore College

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo ilustra o uso de componentes comercialmente disponíveis para gerar um gradiente térmico estável e linear. Tal gradiente pode então ser usado para determinar o limite térmico superior de organismos planctônicos, particularmente larvas de invertebrados.

Resumo

Limites térmicos e amplitude têm sido amplamente utilizados para prever a distribuição de espécies. À medida que a temperatura global continua a subir, entender como o limite térmico muda com a aclimatação e como ele varia entre os estágios da vida e as populações é vital para determinar a vulnerabilidade das espécies ao aquecimento futuro. A maioria dos organismos marinhos tem ciclos de vida complexos que incluem estágios planctônicos iniciais. Embora quantificar o limite térmico desses pequenos estágios iniciais de desenvolvimento (dezenas a centenas de mícrons) ajude a identificar gargalos de desenvolvimento, esse processo pode ser desafiador devido ao pequeno tamanho dos organismos-alvo, à grande necessidade de espaço de bancada e ao alto custo inicial de fabricação. Aqui, uma configuração voltada para pequenos volumes (mL a dezenas de mL) é apresentada. Esta configuração combina componentes comercialmente disponíveis para gerar um gradiente térmico estável e linear. As especificações de produção da configuração, bem como os procedimentos para introduzir e enumerar indivíduos vivos versus mortos e calcular a temperatura letal, também são apresentados.

Introdução

A tolerância térmica é fundamental para a sobrevivência e função dos organismos 1,2. À medida que o planeta continua a aquecer devido às emissões antropogénicas de carbono, está a ser dada cada vez mais atenção à determinação e aplicação de limites térmicos3. Vários desfechos, como mortalidade, falha no desenvolvimento e perda de mobilidade, têm sido utilizados para determinar os limites térmicos superiores e inferiores4. Esses limites térmicos são frequentemente considerados um proxy para o nicho térmico de um organismo. Essas informações, por sua vez, são utilizadas para identificar espécies mais vulneráveis ao aquecimento global, bem como prever a distribuição futura de espécies e as interações resultantes das espécies 3,5,6,7. No entanto, determinar limites térmicos, especialmente para pequenos organismos planctônicos, pode ser um desafio.

Para organismos planctônicos, particularmente os estágios larvais de invertebrados marinhos, o limite térmico pode ser determinado através da exposição crônica. A exposição crônica é alcançada pela criação de larvas a várias temperaturas ao longo de dias a semanas e pela determinação da temperatura na qual a sobrevivência larval e/ou a taxa de desenvolvimento reduzem 8,9,10. No entanto, esta abordagem é bastante demorada e requer grandes incubadoras e experiência na criação de larvas (ver referência11 para uma boa introdução à cultura de larvas de invertebrados marinhos).

Alternativamente, a exposição aguda ao estresse térmico pode ser usada para determinar os limites térmicos. Muitas vezes, essa abordagem de determinação envolve a colocação de pequenos frascos com larvas em banhos secos com temperatura controlada 12,13,14, alavancando funções de gradiente térmico em termocicladores de PCR 15,16 ou colocando frascos de vidro/tubos de microcentrífuga ao longo de um gradiente térmico gerado pelo aquecimento e resfriamento aplicados nas extremidades de grandes blocos de alumínio com orifícios nos quais os frascos se encaixam confortavelmente 17, 18,19. Banhos secos típicos geram uma única temperatura; portanto, várias unidades devem ser operadas simultaneamente para avaliar o desempenho em uma faixa de temperaturas. Os termocicladores geram um gradiente, mas acomodam apenas um pequeno volume de amostra (120 μL) e requerem manipulações cuidadosas. Semelhante aos termocicladores, grandes blocos de alumínio criam gradientes de temperatura lineares e estáveis. Ambas as abordagens podem ser acopladas à regressão logística ou probit para calcular a temperatura letal para 50% por cento da população (LT50)12,20,21. No entanto, os blocos de alumínio utilizados tinham ~ 100 cm de comprimento; esse tamanho demanda um grande espaço de laboratório e acesso a fresadoras especializadas em controle numérico por computador para perfurar os furos. Juntamente com o uso de dois banhos de água de grau de pesquisa para manter a temperatura alvo, o custo financeiro de montagem da configuração é alto.

Portanto, este trabalho tem como objetivo desenvolver um meio alternativo para gerar um gradiente de temperatura estável e linear com peças comercialmente disponíveis. Tal produto deve ter uma pegada pequena e deve ser capaz de ser facilmente utilizado para experiências de exposição ao stress térmico agudo para organismos planctónicos. Este protocolo é desenvolvido com zooplâncton que tem <1 mm de tamanho como organismos-alvo e, assim, foi otimizado para o uso de um tubo microcentrífugo de 1,5 ou 2 mL. Organismos de estudo maiores exigirão recipientes maiores do que os tubos de microcentrífuga de 1,5 mL usados e furos ampliados nos blocos de alumínio.

Além de tornar o aparato experimental mais acessível, este trabalho visa simplificar o pipeline de processamento de dados. Embora o software estatístico comercial forneça rotinas para calcular o LT50 usando regressão logística ou probit, o custo de licenciamento não é trivial. Portanto, um script fácil de usar que se baseia no programa estatístico de código aberto R22 tornaria a análise de dados mais acessível.

Este protocolo mostra como um bloco de calor compacto pode ser fabricado com peças comercialmente disponíveis e ser aplicado para expor o zooplâncton (larvas do Dendraster excentricus) ao estresse térmico agudo para determinar seu limite térmico superior.

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Protocolo

1. Fabricação do bloco de calor

  1. Ligue o aquecedor de tiras de 120 V e 100 W ao reostato (ver Tabela de Materiais).
  2. Prepare o bloco de alumínio de 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 pol x 5 pol x 2 pol) perfurando 60 furos em uma grade de 6 x 10 (consulte Tabela de Materiais). Certifique-se de que os orifícios estão espaçados 2 cm de centro para centro em ambas as direções. Cada um deve ter 1,1 cm de diâmetro e 4,2 cm de profundidade (Figura 1).
    NOTA: Execute a perfuração em uma fresadora ou prensa de perfuração com brocas de aço de alta velocidade. O elemento de aquecimento e o elemento de resfriamento foram escolhidos para cobrir o máximo possível da superfície de contato das superfícies de 15,2 cm x 5 cm.
  3. Faça dois furos adicionais em uma das superfícies de 20,3 cm x 5 cm entre a 1ª e a 2ª coluna e a9ª e 10ª colunas, combinando o tamanho das sondas controladoras de temperatura (consulte Tabela de Materiais).
  4. Construa uma caixa a partir de folhas de acrílico transparente de 1,2 cm (0,5 pol.) (ver Tabela de Materiais) para manter os elementos no lugar e isolar o bloco de calor completo. Use duas camadas de acrílico para isolar a parte de trás do elemento de aquecimento (Figura 1).
  5. Na montagem final, aplique pasta térmica (consulte Tabela de Materiais) para maximizar a condutância térmica do elemento de aquecimento para o bloco e do bloco para o elemento de resfriamento.

2. Determinação das definições de gradiente térmico

  1. Conecte o resfriador de banho-maria/aquário com a tubulação Tygon (consulte Tabela de materiais). Isole a tubulação com isolamento de tubo de espuma, conforme necessário.
  2. Insira a sonda do termostato nos orifícios na lateral do bloco de alumínio. Certifique-se de que a sonda 1 esteja posicionada perto do elemento de aquecimento.
  3. Colocar tubos de microcentrífuga cheios até a borda (1,5 mL) com água da torneira em todos os orifícios fresados (60 tubos no total).
  4. Ligue o controlador de temperatura e ajuste a temperatura de aquecimento de parada da sonda de 1 a 35-37 °C e da sonda de 2 a 21,5-22,5 °C.
    NOTA: O termostato proposto tem duas tomadas que operam de forma independente; apenas a sonda 1 é usada para regular a temperatura quente neste caso de uso específico. Portanto, defina a temperatura da sonda 2 para a temperatura de extremidade baixa.
  5. Gire o reostato para ligar o elemento de aquecimento e defina-o como médio.
  6. Ligue o banho de água/refrigerador do aquário e ajuste a temperatura do chiller para 15 °C.
  7. Verifique se o bloco está quente em uma extremidade e esfriar na outra após 10 min.
    CUIDADO: As extremidades expostas do elemento de aquecimento podem estar quentes; não os toque.
  8. Verifique a temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando um termopar com um eletrodo do tipo K (consulte a Tabela de Materiais) a cada 10 minutos depois. A temperatura se estabilizará após ~60 min e aparecerá linear (Figura 2).
  9. Ajuste os valores dos pontos de extremidade alterando as configurações do controlador de temperatura e do banho-maria, conforme necessário.

3. Exposição térmica e enumeração viva: morta

NOTA: A etapa 2 pode ser omitida quando as configurações desejadas para o gradiente de temperatura forem determinadas.

  1. Ligue o banho-maria de recirculação e o aquecedor e ajuste-os a 15 °C e 37 °C, respectivamente, para gerar um gradiente de temperatura de 19,5 °C a 37 °C.
  2. Para garantir que o gradiente térmico seja linear, coloque tubos de microcentrífuga cheios até a borda (1,5 mL) com água da torneira em todos os orifícios fresados (60 tubos no total).
  3. Deixe o bloco de calor atingir a temperatura definida esperando 45-60 min. Verifique a temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando um termopar com um eletrodo do tipo K para ver se atingiu a temperatura esperada. Observe essas temperaturas.
  4. Se os organismos do estudo tiverem >500 μm de tamanho e puderem ser facilmente transferidos de um recipiente para outro (por exemplo, um copépode), encha um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 750 μL de água do mar filtrada de 0,45 μm. Alternativamente, se os organismos do estudo forem pequenos, encha um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 250 μL de 0,45 μm de água do mar filtrada.
    NOTA: Para os dados representativos, foram utilizadas larvas do dólar de areia excêntricos de Dendraster , que são 2, 4 e 6 dias pós-adubação, (ver Tabela de Materiais). O tamanho médio (± S.D., n = 15 para cada idade) desses indivíduos foi de 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm e 292 ± 14 μm, respectivamente. Dado que essas larvas podem ser facilmente concentradas (etapa 3.5), os tubos de microcentrífuga foram preenchidos com 750 μL de água do mar filtrada.
  5. Concentrar a cultura dos organismos de estudo com filtragem reversa (ou seja, colocar a malha no recipiente que contém os organismos de estudo e remover a água através do topo da malha), de modo que os organismos de estudo permaneçam no fundo do copo11.
    NOTA: Uma malha de nylon de 30 μm foi utilizada para os dólares de areia larval estudados (ver Tabela de Materiais).
  6. Lave a amostra animal concentrada com água do mar filtrada (por exemplo, ao cultivar com alimentos de algas ou outros produtos químicos). Repetir a filtragem inversa mais uma vez para concentrar a amostra animal.
  7. Coloque um número conhecido de organismos individuais nos tubos de microcentrífuga meio cheios. Conte os pequenos organismos planctônicos sob um microscópio de dissecação (ver Tabela de Materiais) e transfira-os com pipetas Pasteur de vidro.
    NOTA: O número de organismos a serem colocados depende do tamanho; para larvas de areia de tamanho ~200 μm, 20 indivíduos por tubo de microcentrífuga foram apropriados.
    CUIDADO: As pipetas de vidro são mais desejáveis do que as pipetas de plástico, pois alguns organismos planctônicos são hidrofóbicos e aderem às superfícies plásticas.
  8. Adicionar 0,45 μm de água do mar filtrada aos tubos de microcentrífuga contendo animais até que o volume final seja de 1 ml.
  9. Para permitir que os organismos se aqueçam gradualmente até a temperatura experimental desejada, coloque os tubos de microcentrífuga com animais, preparados na etapa 3.7, no bloco de calor a partir da extremidade fria. Coloque pares de tubos de microcentrífuga em cada fileira (12 tubos no total).
  10. Aguarde 10 min.
  11. Mover os pares de tubos de microcentrífuga inseridos no passo 3.9 para os furos perfurados adjacentes com temperaturas mais quentes. Coloque pares adicionais de tubos de microcentrífuga em cada fileira na extremidade fria. Cada fileira terá agora quatro tubos. Aguarde mais 10 min.
  12. Continue a adicionar tubos de microcentrífuga com animais, mudando suas posições da extremidade mais fria para a extremidade mais quente em pares. Aguarde 10 minutos entre cada turno até que o bloco de calor esteja completamente cheio.
    NOTA: As etapas 3.9-3.12 são consideradas uma fase de aumento para aumentar a temperatura experimentada pelos organismos do estudo gradualmente.
  13. Deixar os animais incubarem à temperatura designada durante 2 h. Esta etapa é a fase de exposição constante à temperatura do experimento.
    1. Verifique a temperatura dos tubos de microcentrífuga com um termopar a cada hora se o período de incubação exceder 2 h.
      NOTA: Ajustar o tempo de incubação com base nas necessidades experimentais. Se a incubação for superior a 2 h, verifique a temperatura dos tubos em intervalos de tempo regulares com um termopar em caso de falha imprevista do equipamento. Para minimizar a perturbação dos organismos do estudo, coloque aleatoriamente seis ou mais tubos de microcentrífuga preenchidos apenas com água do mar filtrada no bloco para monitoramento da temperatura.
  14. No final do período de incubação, meça a temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando um termopar com um eletrodo do tipo K. Observe essas temperaturas.
  15. Retire todos os 60 tubos de microcentrífuga com animais e coloque-os em suportes pré-rotulados.
  16. Incubar os tubos (passo 3.14) à temperatura predeterminada, como a temperatura de criação, durante 1 h, que é o período de recuperação.
    NOTA: O período de recuperação pode ser específico da espécie. Para a larva de dólar de areia, a temperatura de criação foi de 18 °C e, assim, a amostra foi colocada em câmara ambiental. Consulte a literatura relevante e/ou conduza um experimento experimental para garantir que a contagem de mortos:vivos não tenha sido afetada pela duração do período de recuperação. Nos dados representativos, o número de animais vivos após 1 h foi o mesmo que após 12 ou 24 h de recuperação.
  17. Para enumerar a proporção de organismo em estudo que está vivo após a exposição térmica, transfira o conteúdo de um tubo de microcentrífuga individual para uma placa de Petri de 35 mm usando uma pipeta de vidro.
  18. Observe e observe o número relativo de indivíduos que ainda estão ativos (vivos) e aqueles que capturaram a natação ou se dissolveram (mortos) sob um microscópio de dissecação. Certifique-se de que o número total de indivíduos observados seja igual ao número de indivíduos colocados nos tubos na etapa 3.7. Verifique o lado dos tubos de microcentrífuga e da placa de Petri para indivíduos se os números não corresponderem.

4. Cálculo do LT50

  1. Gere uma tabela de dados em formato CSV com pelo menos os seguintes cabeçalhos: variável de agrupamento de interesse, temperatura do tubo em °C, número de indivíduos vivos e número de indivíduos mortos.
    NOTA: Para os dados representativos, a variável de agrupamento de interesse é substituída por idade, uma vez que o objetivo é comparar entre as faixas etárias.
  2. Para ajustar os dados com regressão logística, use um modelo linear generalizado com distribuição binomial. O Arquivo de Codificação Suplementar 1 mostra um exemplo de script de exemplo usando o software de código aberto R22.
  3. Para determinar o limite térmico superior mediano (LT 50), calcule o valor preditor (ou seja, temperatura) no qual50% dos indivíduos sobreviveram. O Arquivo de Codificação Suplementar 2 mostra um script de exemplo usando a função dose.p do MASS23 em R22.

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Resultados

O objetivo deste protocolo é determinar o limite térmico superior do zooplâncton. Para isso, é necessário um gradiente térmico estável e linear. A configuração proposta foi capaz de gerar um gradiente térmico variando de 14 °C a 40 °C, ajustando a temperatura do banho-maria para 8 °C e o aquecedor para 39 °C (Figura 2A). O gradiente de temperatura pode ser estreitado e deslocado alterando os valores de ponto de extremidade. Um gradiente térmico com uma faixa mais estreita (19 °C a 37 °C) tam...

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Discussão

Este protocolo fornece uma abordagem acessível e personalizável para determinar os limites térmicos de pequenos organismos de plâncton através da exposição térmica aguda. O design de 10 furos e os endpoints de temperatura flexíveis, controlados pelo banho-maria na extremidade inferior e pelo aquecedor na extremidade superior, permitem determinar o LT50 com precisão. Usando essa abordagem, uma diferença no limite térmico que é de <1 °C pôde ser detectada (Figura 3). Essa abordagem ...

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Divulgações

Os autores não têm conflito de interesses a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pelo Fundo de Pesquisa da Faculdade do Swarthmore College [KC] e pela Robert Reynolds e Lucinda Lewis '70 Summer Research Fellowship para BJ.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,45 µ filtro de membrana mVWR74300-042
½ ” Chapa acrílicaMcMaster-Carr8560K266Usado para construir uma caixa estriada com isolamento suficiente.
Seringa de 1 mLVWR76290-420
2 Canais 7 Tipos de Termopar DataloggerOmega EngineeringHH506APode ser substituído por qualquer termômetro que caiba dentro de um tubo de microcentrífuga
Pipeta automática Ranin 
Aquecedor de Tira de Montagem com Parafuso e Grampo
com Bainha de Aço Inoxidável 430, 120V AC, 1-1/2" de Largura, 100W		para Mar McMaster-Carr3619K32
PentairCM2BUse para fazer água do mar artificial 
Denraster excentricusM-Rep Dólares de areia da Califórnia
Microscópio de dissecação Nikon SMZ645
DIYhz Bloco de Resfriamento de Água de Alumínio, Sistema de Dissipador de Calor de Refrigerador de Água Líquida para PC Computador CPU Gráficos Radiador Cabeça Endotérmica Prata (40 mm x 120 mm x 12 mm)AmazonConecta-se ao banho-maria e é usado para resfriar uma extremidade do bloco.
Chapa de Alumínio Fundido MIC6 Fácil de Usinar 2" de espessura 8" x 8" McMaster-Carr86825K953Maquinado a 2" x 6" x 8" com 60 furos igualmente espaçados (11 mm de diâmetro, 42 mm de profundidade) com dois furos adicionais perfurados num lado para sondas de termostato.
Isolamento de tubo de espuma de polietileno flexível econômicoMcMaster-Carr4530K121Cobre a tubulação de plástico entre o resfriador e o bloco para reduzir a perda de calor. Pode ser omitido se a faixa de temperatura estiver próxima da temperatura ambiente 
EVERSECU 72w 110-240v Resfriador de Água para Aquário Aquecedor/Resfriador Controlador de Temperatura para Peixes Tanque de Camarão Tanque de Recife de Coral Marinho Abaixo de 20 L/30 L Resfriadorde Aquário AmazonPode ser usado no lugar do banho-maria de grau laboratorial 
Exemplo com dólar de areia larval
GENNEL 100 g Pasta de graxa composta condutora térmica de silicone de prata para GPU CPU IC LED Fornos de resfriamentoAmazonMelhora a condutância térmica entre o bloco e os elementos de aquecimento e resfriamento.
Controlador de Temperatura do Termostato de Répteis WiFi Inkbird com 2 Sondas e 2 Tomadas, Termostato de Tapete de Calor para Répteis IPT-2CH (Máx. 250 W por Tomada)AmazonMonitora extremidades quentes e frias. Mantém a extremidade quente na faixa
Circuladores Refrigerados a Ar Lauda Ecoline SilverVWR89202-386Pode ser substituído por um resfriador de aquário 
Tubos de microcentrífugaVWR76019-014Se forem utilizados animais maiores, os frascos de escanilação (VWR 66022-004) são uma boa alternativa.
Filtro de malha Nitex Feito por contaCola quente usada para anexar malha Nitex a tubulação de PVC de 1/2" 
Pipeta PasteurVWR14673-010
Cloreto de potássio (0,35 M) Millpore-SigmaP3911-500G
R. The R Project for Statistical Computing
Agulha de seringaVWR89219-346Dependendo do tamanho do organismo alvo gague 14 e 16 podem ser usados
Tygon Tubing McMaster-Carr5233K65Ajuste para combinar com o chiller e o bloco usados 
O Reostato de Temperatura Repti da Zoo MedChewy.comClassificado para 150 W e reconectado para alimentar diretamente o elemento de aquecimento. Usado para controlar a taxa de saída de calor
Mistura de Bioensaio de Cristal própria Software estatístico

Referências

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