O estabelecimento da gravidez é um processo dinâmico que envolve o crosstalk embrionário e uterino complexo. As contribuições precisas do ambiente uterino materno para esses processos permanecem como uma área ativa de investigação. Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para ajudar no projeto de modelos animais in vivo para abordar essas questões de pesquisa.
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Artigo de método
Métodos para o Estudo das Contribuições Uterinas para o Estabelecimento da Gestação em Modelo de Camundongo Ovariectomizado
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Para que a gravidez seja estabelecida, um blastocisto viável deve interagir com sucesso com um revestimento uterino receptivo (endométrio) para facilitar a implantação e a formação da placenta e permitir a gravidez contínua. As limitações ao sucesso da gestação causadas por defeitos embrionários são bem conhecidas e foram amplamente superadas nas últimas décadas com o surgimento da fertilização in vitro (FIV) e das tecnologias de reprodução assistida. No entanto, até o momento, o campo não superou as limitações causadas por um endométrio inadequadamente receptivo, resultando em taxas de sucesso de FIV estagnadas. As funções ovariana e endometrial estão intimamente interligadas, pois os hormônios produzidos pelo ovário são responsáveis pela ciclicidade menstrual do endométrio. Como tal, ao usar modelos de roedores de gravidez, pode ser difícil determinar se um resultado observado é devido a um déficit ovariano ou uterino. Para superar isso, um modelo de camundongo ovariectomizado foi desenvolvido com transferência embrionária ou decidualização artificial para permitir o estudo de contribuições uterino-específicas para a gravidez. Este artigo fornecerá instruções sobre como realizar ooforectomia e oferecerá insights sobre várias técnicas para fornecer hormônios exógenos para apoiar a decidualização artificial bem-sucedida ou gravidez após a transferência de embriões de doadoras saudáveis. Essas técnicas incluem injeção subcutânea, pastilhas de liberação lenta e minibombas osmóticas. As principais vantagens e desvantagens de cada método serão discutidas, permitindo que os pesquisadores escolham o melhor desenho de estudo para sua pergunta de pesquisa específica.
Introdução
Com o crescente uso de tecnologias de reprodução assistida nas últimas décadas, muitas barreiras à concepção foram superadas, permitindo que muitos casais constituíssem família apesar dos problemas de fertilidade1. Déficits de ovócitos ou espermatozoides muitas vezes podem ser contornados usando fertilização in vitro ou injeção intracitoplasmática de espermatozoides; No entanto, questões relacionadas ao útero e à receptividade endometrial permanecem uma "caixa preta" elusiva do potencial reprodutivo2.
A gravidez é estabelecida quando um embrião de alta qualidade interage com sucesso c....
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Protocolo
Todos os animais foram alojados em instalações de alta barreira com temperatura controlada (Monash University Animal Research Laboratory), com livre acesso à água e ração e ciclo claro-escuro de 12 horas. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a aprovação do comitê de ética da Monash Animal Research Platform (#21908, 17971) e realizados de acordo com o National Health and Medical Research Council Code of Practice for the care and use of animals.
1. Preparo cirúrgico
- Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, gazes e toalhas de papel necessários para os procedimentos em um ciclo de produtos duros/se....
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Resultados
Um modelo bem caracterizado de decidualização artificial é descrito neste artigo de protocolo (Figura 1A). Aqui, camundongos fêmeas adultas jovens (8 semanas de idade) foram submetidos à ooforectomia cirúrgica, conforme descrito na seção 1 e na seção 2. Os camundongos foram então descansados por 2 semanas para garantir que os hormônios ovarianos endógenos se dissipassem antes de serem suportados com hormônios exógenos, conforme descrito nas seções 3-7 e seção 9. A decid.......
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Discussão
Este artigo fornece instruções passo a passo sobre como realizar OVX e fornecer hormônios exógenos para estudos focados na compreensão das contribuições uterinas para a gravidez e fertilidade. Dois protocolos detalhados são fornecidos sobre duas aplicações experimentais desses métodos, incluindo a realização de transferência de embriões e indução de decidualização artificial.
Embora a realização da OVX possa ser um desafio inicial - especialmente para pesquisadores iniciantes em modelos de roe.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros ou outros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi possível através do Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo do Estado Vitoriano e do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Governo Australiano (NHMRC) IRIISS. Este trabalho foi apoiado pela Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant to A.L.W. (Winship-PAG18-0343) para acessar a Monash Reproductive Services Platform. A A.L.W. é apoiada pelo financiamento DECRA DE21010037 do Australian Research Council (ARC). J.N.H. e L.R.A. são apoiados por uma bolsa do Programa de Treinamento em Pesquisa do Governo Australiano. A L.R.A. é apoiada por uma Bolsa de Excelência de Pós-Graduação Monash. K.J.H. é....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bombas mini osmóticas ALZET 1002 | BioScientific | 1002 | Fornece 0,25 µ L/h por 14 dias. Utilizar para a secção 7 (Procedimento experimental - Transferência de embriões). |
| Bombas mini osmóticas ALZET 1003D | BioScientific | 1003D | Fornece 1 µ L/h por 14 dias. Use para a seção 8 (Procedimento experimental - Decidualização artificial). |
| Clipes ALZET Reflex de 7 mm | BioScientific | 0009971 | Os clipes Reflex ou os clipes Michel podem ser usados para o fechamento de feridas, dependendo da preferência |
| Aplicador de clipes ALZET Reflex | BioScientific | 0009974 | Os clipes Reflex ou os clipes Michel podem ser usados para o fechamento de feridas, dependendo da preferência |
| Removedor de clipes ALZET Reflex | BioScientific | 0009976 | Os clipes Reflex ou Michel podem ser usados para o fechamento da ferida, dependendo da preferência |
| Injeção de bupivicaína | Pfizer | NA | Stock 0,5%. Use a 0,05% em solução salina |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Constituinte ativo 0,5 mg / mL. Use 3,5 mL por garrafa de água de gaiola de 400 mL ou conforme prescrito pelo veterinário da sua instituição. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Selante multiuso | Dow Corning | 732 | |
| Dispositivo de transferência de embriões não cirúrgico (NSET) | ParaTechs | 60010 | Contém espéculo de 6 mm. Apenas para uso único. |
| Progesterona | Sigma | P0130 | Solúvel em etanol. Use para seção 3 (Preparação hormonal - injeção subcutânea) e seção 4 (Preparação hormonal - pellets de liberação lenta) |
| Progesterona | Sigma | P7556 | Solúvel em água. Use para a seção 5 (Preparação hormonal - mini bombas osmóticas) |
| Pomada refrescante para os olhos | Allergan | NA | 42,5% p / v parafina líquida, 57,3% p / v parafina branca macia |
| Rimadyl Carprofeno | Zoetis | NA | Stock 50 mg / mL. Use a 1 mg / ml (para dose de 5 mg / kg) |
| Tubo de borracha | Dow Corning | 508-008 | Lavado em etanol 100% e cortado em pedaços de 1 cm. Diâmetro interno 1,57 mm ± 0,23 mm; diâmetro externo 3,18 mm ± 0,23 mm; parede 0,81 mm. |
| Suturas de | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk do óleo de sésamo tamanho 3-0 | Covidien | GS-832 |
Referências
- Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
- Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming....
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Reimpressões e permissões
