É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Métodos para o Estudo das Contribuições Uterinas para o Estabelecimento da Gestação em Modelo de Camundongo Ovariectomizado

2.8K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/64763

⸱

7 de abril de 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O estabelecimento da gravidez é um processo dinâmico que envolve o crosstalk embrionário e uterino complexo. As contribuições precisas do ambiente uterino materno para esses processos permanecem como uma área ativa de investigação. Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para ajudar no projeto de modelos animais in vivo para abordar essas questões de pesquisa.

Resumo

Para que a gravidez seja estabelecida, um blastocisto viável deve interagir com sucesso com um revestimento uterino receptivo (endométrio) para facilitar a implantação e a formação da placenta e permitir a gravidez contínua. As limitações ao sucesso da gestação causadas por defeitos embrionários são bem conhecidas e foram amplamente superadas nas últimas décadas com o surgimento da fertilização in vitro (FIV) e das tecnologias de reprodução assistida. No entanto, até o momento, o campo não superou as limitações causadas por um endométrio inadequadamente receptivo, resultando em taxas de sucesso de FIV estagnadas. As funções ovariana e endometrial estão intimamente interligadas, pois os hormônios produzidos pelo ovário são responsáveis pela ciclicidade menstrual do endométrio. Como tal, ao usar modelos de roedores de gravidez, pode ser difícil determinar se um resultado observado é devido a um déficit ovariano ou uterino. Para superar isso, um modelo de camundongo ovariectomizado foi desenvolvido com transferência embrionária ou decidualização artificial para permitir o estudo de contribuições uterino-específicas para a gravidez. Este artigo fornecerá instruções sobre como realizar ooforectomia e oferecerá insights sobre várias técnicas para fornecer hormônios exógenos para apoiar a decidualização artificial bem-sucedida ou gravidez após a transferência de embriões de doadoras saudáveis. Essas técnicas incluem injeção subcutânea, pastilhas de liberação lenta e minibombas osmóticas. As principais vantagens e desvantagens de cada método serão discutidas, permitindo que os pesquisadores escolham o melhor desenho de estudo para sua pergunta de pesquisa específica.

Introdução

Com o crescente uso de tecnologias de reprodução assistida nas últimas décadas, muitas barreiras à concepção foram superadas, permitindo que muitos casais constituíssem família apesar dos problemas de fertilidade1. Déficits de ovócitos ou espermatozoides muitas vezes podem ser contornados usando fertilização in vitro ou injeção intracitoplasmática de espermatozoides; No entanto, questões relacionadas ao útero e à receptividade endometrial permanecem uma "caixa preta" elusiva do potencial reprodutivo2.

A gravidez é estabelecida quando um embrião de alta qualidade interage com sucesso com um endométrio receptivo (revestimento uterino). As chances de sucesso da gravidez em qualquer ciclo menstrual são baixas, em torno de 30%3,4. Das que são bem-sucedidas, apenas 50%-60% avançam para além de 20 semanas de gestação, sendo a falha de implantação responsável por 75% das gestações que não atingem 20 semanas3. Apesar desses números remontam ao final da década de 1990, o campo ainda não superou as limitações causadas por um endométrio inadequadamente receptivo. Isso resultou em taxas de sucesso de FIV estagnadas e, às vezes, declinantes nos últimos anos 5,6.

Mulheres com infertilidade inexplicável muitas vezes têm uma janela deslocada de receptividade ou são incapazes de alcançar a receptividade por razões desconhecidas. Recentemente, foi desenvolvido o arranjo de receptividade endometrial, que avalia a expressão de centenas de genes com o objetivo de adequar o momento da transferência embrionária à janela de receptividade do indivíduo 7,8,9. No entanto, o campo ainda carece de uma compreensão da patogênese das complicações da gravidez que se manifestam após o processo de implantação ser concluído.

O sistema reprodutor feminino é altamente dinâmico e sob rígido controle hormonal. O eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (HPG) controla a liberação do hormônio luteinizante e do hormônio folículo-estimulante, que regulam aspectos do ciclo ovariano, incluindo a maturação dos folículos e a atividade de estrogênio e progesterona. Por sua vez, o ciclo menstrual uterino é regulado por estrógenos e progesterona10,11. Assim, o estudo dos mecanismos biológicos uterinos é complicado pela influência ovariana. Por exemplo, ao estudar como as terapias contra o câncer podem afetar o útero, pode ser difícil distinguir se qualquer fenótipo uterino observado (como perda gestacional ou acíclica menstrual) é o resultado de um insulto direto ao útero ou um efeito consequente de danos aos ovários.

Para compreender de forma abrangente a fertilidade, as contribuições uterinas para a gravidez devem ser caracterizadas. É importante ressaltar que esse entendimento deve ir além da função uterina sob controle ovariano. Isso não pode ser estudado em humanos; portanto, modelos animais são frequentemente empregados. Como tal, a ooforectomia (OVX) é comumente usada para permitir que os pesquisadores regulem os ciclos estrais dos roedores (análogos ao ciclo menstrual), fornecendo hormônios exogenamente. Além disso, a OVX permite que as respostas uterinas sejam estudadas independentemente da influência ovariana12. No entanto, se os hormônios não forem fornecidos imediatamente pós-OVX, um fenótipo de menopausa ocorrerá, o que precisa ser cuidadosamente considerado pelos pesquisadores.

A OVX é frequentemente utilizada em modelos de roedores13,14,15,16,17 e é relativamente fácil de ser realizada após treinamento adequado. Os métodos variam dependendo se o ovário sozinho ou o ovário e o oviduto são removidos, bem como dependendo da idade do animal (animais adultos, cicladores têm ovários maiores com um corpo lúteo visível em sua superfície, o que significa que seus ovários são mais fáceis de visualizar). Da mesma forma, existem muitos métodos de suplementação hormonal, incluindo injeções subcutâneas14, pastilhas de liberação lenta 15, minibombas osmóticas18 e enxerto ovariano.

Neste artigo, instruções detalhadas são fornecidas sobre como realizar ooforectomia e preparar três tipos de suplementação hormonal, incluindo injeções subcutâneas, pastilhas de liberação lenta e mini bombas osmóticas. Dois protocolos detalhados são fornecidos para desfechos experimentais que se beneficiam da OVX seguida de suplementação hormonal exógena (transferência embrionária e decidualização artificial). Este artigo discute os pontos fortes e fracos de cada abordagem com o objetivo de orientar os pesquisadores sobre como realizar estudos para isolar os impactos sobre o útero, especificamente nos campos de pesquisa da gravidez e fertilidade.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os animais foram alojados em instalações de alta barreira com temperatura controlada (Monash University Animal Research Laboratory), com livre acesso à água e ração e ciclo claro-escuro de 12 horas. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a aprovação do comitê de ética da Monash Animal Research Platform (#21908, 17971) e realizados de acordo com o National Health and Medical Research Council Code of Practice for the care and use of animals.

1. Preparo cirúrgico

  1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, gazes e toalhas de papel necessários para os procedimentos em um ciclo de produtos duros/secos a 121 °C com um tempo de espera de 30 min e um tempo de secagem de 30 min.
  2. Coloque uma bancada estéril para o espaço de trabalho cirúrgico e prepare analgésicos.
    1. Diluir o carprofeno em solução salina estéril para 1 mg/ml e diluir a bupivacaína em solução salina estéril para solução a 0,5% (p/v).
    2. Adicionar 3,5 ml de meloxicam a uma garrafa de água de gaiola de 400 ml.
  3. Pré-aqueça a(s) almofada(s) térmica(s) para as gaiolas de recuperação e configure lâmpadas de calor para iluminar indiretamente os animais em recuperação.
  4. Certifique-se de que todos os EPIs apropriados sejam usados, incluindo uma rede de cabelo, máscara facial, avental e luvas.
  5. Pratique uma boa técnica estéril, incluindo pulverizar regularmente as luvas com etanol e deixá-las evaporar antes de manusear o animal ou ferramentas cirúrgicas para evitar a contaminação por etanol.

2. Realização de ooforectomia

  1. Usando um aparelho de anestesia a gás com isoflurano, pré-encha a caixa de indução por 3-5 min a isoflurano a 5% com a taxa de fluxo ajustada para 4 L/min.
  2. Coloque o rato dentro da caixa de indução e, uma vez inconsciente, mova-o para o cone nasal e reduza a taxa de fluxo para 0,4 L/min, com o vaporizador de isoflurano regulado para ~2,5%.
    NOTA: A porcentagem de isoflurano usada para o restante do procedimento varia com base na cepa do camundongo, idade e exposição a tratamentos (por exemplo, quimioterapia) e deve ser ajustada com base em uma avaliação rigorosa dos padrões respiratórios de cada animal. Os padrões respiratórios devem permanecer como respirações abdominais regulares. Respirações torácicas rápidas podem indicar que um plano cirúrgico profundo não foi alcançado ou mantido; Neste caso, ajuste a porcentagem do vaporizador de isoflurano conforme necessário.
  3. Aplique o lubrificante ocular generosamente, apertando o tubo e esfregando suavemente o olho.
  4. Faça a barba em uma pequena área (2 cm x 2 cm) na e abaixo do palpite da coluna.
  5. Administrar 5 mg/kg de carprofeno a partir de uma solução diluída de 1 mg/ml por via subcutânea no pescoço.
  6. Teste a profundidade da anestesia com o reflexo de pinça do dedo do pé apertando o dedo posterior do mouse. Se não houver reação de pinça do dedo do pé, o animal fica no plano cirúrgico profundo e o procedimento pode continuar.
  7. Aplique betadina na área cirúrgica e cubra com um pano cirúrgico (uma gaze com uma janela de 2 cm x 2 cm recortada).
  8. Usando pinças dentadas de rato, puxe a pele no ângulo das costas para cima e faça uma incisão longitudinal de ~5 mm.
    NOTA: Uma incisão de pele nesta altura no dorso do animal é melhor para a colocação de clipes cirúrgicos para reduzir a chance de o animal remover os clipes e exigir reparos do clipe.
  9. Usando pinças rombas, proceda à dissecação romba da pele para longe da camada muscular subjacente, movendo-se para baixo e para um lado em direção ao rim.
  10. Identifique visualmente o rim, ovário e coxim gorduroso ovariano através da parede muscular.
    NOTA: O rim aparecerá uma cor vermelha escura, a almofada de gordura aparecerá branco brilhante e, se visível, o ovário parecerá um pequeno ponto rosa dentro da almofada de gordura.
  11. Usando pinças, agarre e levante a camada muscular. Faça uma incisão de ~0,5-1 cm com tesoura cirúrgica afiada. Continue segurando a parede muscular com pinças e troque de tesoura para pinça romba para puxar o coxim de gordura ovariana através da incisão.
  12. Usando um porta-agulha curvo, pinça sob o ovário e oviduto na extremidade distal do corno uterino.
    NOTA: Alternativamente, o ovário sozinho pode ser removido, deixando o oviduto intacto. No entanto, um microscópio dissecante é necessário para visualizar com precisão a distinção entre o ovário e o oviduto.
  13. Retire o ovário com uma tesoura ou bisturi. Continue a clampar por 30 s para evitar sangramento excessivo.
  14. Retire a braçadeira e passe com gaze estéril, se necessário.
  15. Para fechar a incisão da parede muscular, use pinça para levantar o topo da incisão para que a incisão se prenda naturalmente.
  16. Use suturas de seda (tamanho 3-0) para fechar a incisão da parede muscular com um nó do cirurgião.
  17. Aplicar duas a três gotas de bupivacaína topicamente usando uma seringa de 1 mL sem agulha acoplada e repetir os passos 2,9-2,17 do outro lado.
  18. Para fechar a incisão da pele, use gaze para secar a área de excesso de bupivacaína e pressione os dois lados da pele juntos.
  19. Aplicar de um a dois clipes cirúrgicos de 7 mm, permitindo espaço para inchaço como parte do processo de cicatrização.
  20. Mova o mouse para uma gaiola de recuperação e monitore de perto por 15 minutos.
    OBS: Os animais devem acordar rapidamente; Certifique-se de monitorar a respiração de perto para padrões respiratórios torácicos normais.

3. Preparação hormonal: Injeção subcutânea

  1. Faça uma solução-mãe de 1 mg/mL de estradiol.
    1. Pesar 0,001 g (1 mg) de pó de estradiol em um tubo estéril de 1,5 mL.
    2. Adicione 1 mL de etanol a 100% ao tubo e o vórtice por alguns segundos.
      NOTA: O etanol permanecerá límpido com manchas visíveis de pó de estradiol.
    3. Envolva o tubo com filme para evitar qualquer evaporação de etanol.
    4. Embrulhe o tubo em papel alumínio e coloque-o em um balancim durante a noite para dissolver completamente o pó de estradiol.
    5. Diluir este estoque de 1 mg/mL em óleo de gergelim até a concentração final desejada.
      NOTA: Doses de 100 ng por 3 dias são necessárias para priming antes da decidualização artificial, e doses baixas adicionais de 25 ng são necessárias quando a progesterona é administrada. Isto é para combater a alça de feedback que controla a expressão do receptor de progesterona. Para a transferência de embriões, são necessárias duas doses de 100 ng no dia 1 e no dia 3 antes da transferência de embriões no dia 4. No momento da transferência embrionária, uma dose baixa de 25 ng também é necessária.
    6. Retirar a quantidade necessária de estradiol no óleo para uma seringa de 1 mL e, em seguida, anexar uma ponta de agulha de 26 G.
    7. Injetar a dose adequada por via subcutânea (no scruff ou flanco; 100 ng/100 μL ou 25 ng/100 μL para priming antes da transferência de embriões ou decidualização artificial ou no momento da transferência de embriões) com a frequência necessária.
      NOTA: O óleo é muito viscoso, por isso certifique-se de injetar lentamente e pausar por alguns segundos antes de remover a agulha. Isso minimizará a quantidade de óleo que vaza para fora do local da injeção.
  2. Fazer uma solução-mãe de 200 mg/mL de progesterona.
    1. Pesar 0,4 g (400 mg) de pó de progesterona em um tubo estéril de 5 mL.
    2. Adicione 2 mL de etanol a 100% ao tubo e vórtice por alguns segundos.
      NOTA: O etanol ficará de cor branca.
    3. Repita as etapas 3.1.3-3.1.4.
    4. Diluir o estoque de 200 mg/mL em óleo de gergelim até a concentração final desejada.
      NOTA: Doses de 2 mg por dia são necessárias para apoiar a transferência de embriões.
    5. Injetar a dose apropriada (por exemplo, 2 mg/100 μL por dia para apoiar a gravidez) por via subcutânea, como nos passos 3.1.6-3.1.7.

4. Preparação hormonal: Pellets de liberação lenta

  1. Coloque uma folha sobre a superfície de um fluxo laminar ou capa de biossegurança classe II.
  2. Coloque todo o equipamento (luvas, placas de Petri, seringas de 1 mL, pinça fina) no capô e ligue o UV por 20 min.
    NOTA: Não ligue o UV com o selante dentro da coifa, pois ele irá se ajustar.
  3. Lave a tubulação de silastic em etanol 100% e deixe secar ao ar na coifa. Depois de seco, marque ~1 cm de comprimento ao longo da tubulação e corte com bisturi.
  4. Retire o êmbolo de uma seringa e esprema ~200 μL de selante. Substitua o êmbolo e deprima uma pequena quantidade de selante para fora da seringa.
  5. Aplique uma pequena quantidade de selante em uma das extremidades da tubulação e alise com um dedo enluvado.
  6. Deixe secar durante a noite ou por 20-30 min em luz UV dentro do exaustor.
  7. Despeje uma quantidade adequada de progesterona em uma placa de Petri esterilizada. Usando pinças, coloque pellets no pó de progesterona para preencher o pellet.
    1. Bata a extremidade selada do pellet na superfície do capô para condensar a progesterona para baixo. Alternativamente, use a extremidade da pinça esterilizada para encher a progesterona. Deixe espaço suficiente para mais selante.
  8. Selar a extremidade aberta com selante, conforme descrito nos passos 3.4-3.5.
  9. Embrulhe a placa de Petri que contém os pellets de progesterona em papel alumínio para protegê-la da luz.
  10. Ativar os pellets durante um mínimo de 72 h antes da inserção subcutânea incubando em FCS descascado de carvão a 1% (cs-FCS: PBS) a 37 °C.
    NOTA: Os pellets podem ser feitos a granel com uma única extremidade selada com antecedência. No entanto, a progesterona fresca deve ser usada para preenchê-los cada vez. Certifique-se de que os pellets pré-fabricados sejam esterilizados por UV antes do enchimento com progesterona. Os pellets secretarão ~500 μg/dia por 6-10 dias, o que é suporte suficiente para decidualização artificial e procedimentos de transferência de embriões, embora uma injeção adicional de baixa dose de estrogênio possa ser necessária para manter a atividade do receptor de progesterona além de 4-5 dias. Além de 10 dias, uma pastilha de progesterona de reposição pode ser necessária.

5. Preparação hormonal: mini bombas osmóticas

  1. Preparar progesterona na concentração desejada em uma solução aquosa e selecionar o modelo apropriado de mini bomba osmótica (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Para a secção 7 (procedimento experimental: transferência de embriões), é necessária a administração de 2 mg/dia durante 12 dias. Portanto, dissolva 28 mg de progesterona em ~100 μL de água estéril por animal (siga as instruções do fabricante para o volume específico). Podem ser necessárias diluições em série. Para a seção 8 (procedimento experimental: decidualização artificial), é necessária a administração de 500 μg por dia durante 3 dias. Portanto, dissolva 1.500 μg de progesterona em ~100 μL de água estéril por animal. Prepare uma solução extra para contabilizar o volume perdido durante o procedimento de enchimento.
  2. Configure o equipamento (luvas, lenços umedecidos com fiapos baixos, placas de Petri, soro fisiológico estéril, seringas de 1 mL, barcos de pesagem pequenos, papel alumínio e balanças com precisão de 0,01 g) dentro de uma capa de biossegurança classe II e, em seguida, ligue o UV por 20 minutos.
  3. Introduza a solução hormonal numa seringa de 1 ml e, em seguida, fixe um tubo de enchimento estéril, certificando-se cuidadosamente de que não existem bolhas de ar.
  4. Pesar a bomba e seu moderador de fluxo dentro de um barco de pesagem estéril.
  5. Insira o tubo de enchimento através da abertura na parte superior da bomba até que ele não possa ir mais longe.
  6. Segurando a bomba na vertical, empurre lentamente o êmbolo da seringa para encher o tubo.
    NOTA: O enchimento rápido deve ser evitado, pois isso pode introduzir bolhas de ar na bomba.
  7. Quando a solução transbordar da parte superior da bomba, remova suavemente o tubo de enchimento e limpe o excesso de solução com um lenço estéril de fiapos baixos.
  8. Insira o moderador de fluxo através da abertura na parte superior da bomba até que ele não possa ir mais longe. Uma vez totalmente dentro, pressione firmemente a bomba e o moderador de fluxo juntos.
  9. Pese a bomba cheia com o moderador de fluxo no lugar.
    NOTA: A diferença de peso obtida a partir dos passos 5.3 e 5.8 dará o peso líquido da solução carregada (ou seja, um aumento de 0,1 g = 100 μL de solução adicionada).
  10. Coloque a bomba cheia em uma placa de Petri estéril cheia de soro fisiológico estéril.
  11. Depois que todas as bombas estiverem cheias, envolva a placa de Petri em papel alumínio e coloque-a dentro de uma incubadora de 37 °C para preparar por pelo menos 4-6 h (ou até estar pronta para uso).

6. Procedimento cirúrgico: Inserção de pastilhas de hormônio subcutâneo e mini bombas

  1. Preparar a área conforme seção 1 (preparação cirúrgica).
  2. Anestesiar os animais conforme os passos 2.1-2.3.
  3. Faça a barba de uma pequena área no pescoço (~1 cm x 1 cm).
  4. Administrar 5 mg/kg de carprofeno a partir de uma solução diluída de 1 mg/ml por via subcutânea no flanco da perna.
  5. Teste para o reflexo de pinça do dedo do pé. Se não houver reflexo, o animal fica no plano cirúrgico profundo, e o procedimento pode começar.
  6. Aplique betadina na área cirúrgica e cubra-a com um pano cirúrgico (uma gaze com uma janela de 2 cm x 2 cm recortada).
  7. Usando pinças dentadas de rato, puxe a pele no pescoço (a meio caminho entre o verdadeiro scruff e o palpite das costas) para cima e faça uma incisão longitudinal de ~5 mm.
  8. Usando pinças rombas, disseque a pele para longe da camada muscular subjacente em uma direção descendente.
    OBS: Para inserção da mini bomba osmótica, crie uma bolsa ao longo de um dos lados do animal para que a bomba não restrinja o movimento do animal ou pressione contra o local da incisão.
  9. Uma vez que o espaço suficiente tenha sido feito para a pastilha de hormônio ou mini bomba, use pinças estéreis para pegar o pellet ou mini bomba e insira-o na bolsa subcutânea feita com dissecção romba.
  10. Para fechar a incisão da pele, certifique-se de que o pellet ou minibomba esteja longe o suficiente no bolso para que os clipes cirúrgicos não o danifiquem.
  11. Aplicar topicamente a bupivacaína conforme passo 2.17.
  12. Feche a ferida com um clipe cirúrgico. Mova o mouse para uma gaiola de recuperação e monitore de perto por 15 minutos. Como se trata de um procedimento curto, os animais devem ser deambulados em poucos minutos.

7. Procedimento experimental: Transferência de embriões

  1. Para animais ovariectomizados, hormônio-prime 3 dias antes da transferência embrionária por injeção subcutânea de 100 ng/100 μL de estradiol (passo 3.1).
  2. Um dia antes da transferência embrionária, os animais receberam uma injeção subcutânea de 2 mg/100 μL de acetato de medroxiprogesterona (passo 3.2).
  3. Preparar a área conforme seção 1 (preparação cirúrgica).
  4. Anestesiar os animais conforme os passos 2.1-2.3.
  5. Inicie o procedimento de acordo com as etapas 2.4-2.10.
  6. Sob um microscópio dissecante, crie um ponto de injeção intrauterino com uma ponta de agulha de 26 G.
  7. Pipetar cinco blastocistos em uma gota de meio M2 e, em seguida, transferi-los para o corno uterino.
  8. Para fechar a incisão da parede muscular, levante o topo da incisão usando pinças para que a incisão se prenda naturalmente.
  9. Usando suturas de seda, feche o local da parede muscular com um nó do cirurgião. Aplicar gotas de bupivacaína topicamente.
  10. Repita as etapas 7.5-7.8 do outro lado.
  11. Para fechar a incisão da pele, use gaze para secar a área de excesso de bupivacaína e pressione os dois lados da pele juntos.
  12. Aplique de um a dois clipes cirúrgicos, deixando espaço para inchaço como parte do processo de cicatrização.
    NOTA: Se os animais são ovariectomizados, hormônios exógenos são necessários no momento da transferência embrionária. Injetar progesterona (2 mg) por via subcutânea ou inserir uma pastilha de progesterona subcutânea ou uma mini bomba osmótica. Para combater o excesso de progesterona, uma injeção subcutânea de baixa dose (25 ng/100 μL) de estrogênio é necessária no momento da transferência embrionária.
  13. Leve cuidadosamente o mouse para uma gaiola de recuperação e monitore de perto por 15 minutos.
    OBS: Os animais devem acordar rapidamente; Certifique-se de monitorar a respiração de perto para padrões respiratórios torácicos normais.

8. Procedimento experimental: Decalidualização artificial

  1. Primer hormônio-os animais com 100 ng/100 μL de estradiol no dia 1, dia 2 e dia 3, conforme seção 3 (preparação hormonal: injeção subcutânea) 8 dias antes da decidualização artificial.
  2. Primer hormônio-os animais com 5 ng/100 μL de estradiol no dia 7, dia 8 e dia 9, conforme seção 3 (preparação hormonal: injeção subcutânea) 2 dias antes da decidualização artificial.
    NOTA: A injeção final deve ocorrer no mínimo 3 h (e no máximo 4 h) antes do procedimento de decidualização artificial.
  3. Animais com pastilha subcutânea de progesterona ou mini bomba osmótica (500 μg/dia), conforme seção 4, seção 5 e seção 8, 2 dias antes da decidualização artificial.
  4. Preparar a área conforme seção 1 (preparação cirúrgica).
  5. Anestesiar os animais conforme os passos 2.1-2.2.
  6. Teste a profundidade da anestesia com o reflexo de pinça dos dedos. Se não houver reação de pinça do dedo do pé, o animal fica no plano cirúrgico profundo e o procedimento pode continuar.
  7. Coloque o rato em decúbito ventral, levante a cauda e insira lentamente um espéculo de 6 mm de diâmetro na vagina.
  8. Mantendo o nariz do animal no cone anestésico nasal, coloque a parte inferior do corpo do animal entre o primeiro e o segundo dedos da mão não dominante. Use o polegar para empurrar suavemente a cauda para cima para manter a abertura vaginal à vista.
  9. Transfira 20 μL de óleo de gergelim para um corno uterino usando uma ponta de transferência de embriões não cirúrgica (conectada a uma pipeta de 20 μL).
    1. Mantendo o nível da pipeta com a abertura vaginal, insira a ponta na vagina e através do colo do útero no corno uterino. Uma vez que a ponta está no corno uterino, pressione suavemente a ponta contra a superfície endometrial (se usar a técnica de manipulação acima, esse movimento será sentido contra o segundo dedo) e expulse lentamente o óleo.
      NOTA: Mantenha o êmbolo da pipeta pressionado, aguarde 10 s para garantir que todo o óleo se dispersou e remova lentamente a ponta de transferência, mantendo o êmbolo pressionado.
  10. Remova o espéculo da vagina.
  11. Leve cuidadosamente o mouse até a gaiola de recuperação e monitore de perto por 15 minutos.
    OBS: Os animais devem acordar rapidamente. Monitore sua respiração de perto para padrões respiratórios torácicos normais.
  12. Limitar o manuseio dos animais e mantê-los em ambiente silencioso por 96 h após o procedimento.
    NOTA: Ruídos altos ou mudanças abruptas em seu ciclo claro e escuro afetarão o sucesso do procedimento. No momento da dissecção tecidual, a extensão do sucesso da decidualização pode ser medida como uma razão entre o peso uterino e o peso corporal. O procedimento de decidualização artificial tem uma taxa de sucesso de 80%. Portanto, exclua os animais que não conseguem decifrar e leve isso em consideração ao selecionar tamanhos de amostra para os experimentos.

9. Procedimento cirúrgico: Recuperação pós-cirúrgica, monitorização e reparos de clipes

  1. Permita que os animais recuperem almofadas térmicas semiligadas e semiligadas durante a noite antes de devolvê-los à sua gaiola de origem.
  2. Monitorar os animais diariamente por 5 dias pós-operatórios, prestando muita atenção ao local da ferida em busca de sinais de infecção.
  3. Execute o reparo do clipe, se necessário.
    1. Preparar a área conforme seção 1 (preparação cirúrgica).
    2. Anestesiar os animais conforme os passos 2.1-2.3.
    3. Remova o clipe existente usando um removedor de clipe se o clipe ainda estiver presente.
    4. Aplicar um novo clipe cirúrgico, conforme passos 2.19-2.21.
  4. Remova os clipes cirúrgicos 7 dias após a cirurgia de acordo com as etapas 9.3.1-9.3.3 ou quando o animal estiver sob anestesia (como para uma transferência de embrião, o procedimento de decidualização artificial ou uma injeção subcutânea após a cirurgia).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Um modelo bem caracterizado de decidualização artificial é descrito neste artigo de protocolo (Figura 1A). Aqui, camundongos fêmeas adultas jovens (8 semanas de idade) foram submetidos à ooforectomia cirúrgica, conforme descrito na seção 1 e na seção 2. Os camundongos foram então descansados por 2 semanas para garantir que os hormônios ovarianos endógenos se dissipassem antes de serem suportados com hormônios exógenos, conforme descrito nas seções 3-7 e seção 9. A decid...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este artigo fornece instruções passo a passo sobre como realizar OVX e fornecer hormônios exógenos para estudos focados na compreensão das contribuições uterinas para a gravidez e fertilidade. Dois protocolos detalhados são fornecidos sobre duas aplicações experimentais desses métodos, incluindo a realização de transferência de embriões e indução de decidualização artificial.

Embora a realização da OVX possa ser um desafio inicial - especialmente para pesquisadores iniciantes em modelos de roe...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros ou outros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi possível através do Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo do Estado Vitoriano e do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Governo Australiano (NHMRC) IRIISS. Este trabalho foi apoiado pela Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant to A.L.W. (Winship-PAG18-0343) para acessar a Monash Reproductive Services Platform. A A.L.W. é apoiada pelo financiamento DECRA DE21010037 do Australian Research Council (ARC). J.N.H. e L.R.A. são apoiados por uma bolsa do Programa de Treinamento em Pesquisa do Governo Australiano. A L.R.A. é apoiada por uma Bolsa de Excelência de Pós-Graduação Monash. K.J.H. é apoiado por uma ARC Future Fellowship FT190100265.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bombas mini osmóticas ALZET 1002BioScientific1002Fornece 0,25 µ L/h por 14 dias. Utilizar para a secção 7 (Procedimento experimental - Transferência de embriões).
Bombas mini osmóticas ALZET 1003DBioScientific1003DFornece 1 µ L/h por 14 dias. Use para a seção 8 (Procedimento experimental - Decidualização artificial).
Clipes ALZET Reflex de 7 mmBioScientific0009971Os clipes Reflex ou os clipes Michel podem ser usados para o fechamento de feridas, dependendo da preferência
Aplicador de clipes ALZET ReflexBioScientific0009974Os clipes Reflex ou os clipes Michel podem ser usados para o fechamento de feridas, dependendo da preferência
Removedor de clipes ALZET ReflexBioScientific0009976Os clipes Reflex ou Michel podem ser usados para o fechamento da ferida, dependendo da preferência
Injeção de bupivicaínaPfizerNAStock 0,5%. Use a 0,05% em solução salina
EstradiolSigmaE8875
MeloxicamIliumNAConstituinte ativo 0,5 mg / mL. Use 3,5 mL por garrafa de água de gaiola de 400 mL ou conforme prescrito pelo veterinário da sua instituição.
Michel clipsDanielsNS-000242
Selante multiusoDow Corning732
Dispositivo de transferência de embriões não cirúrgico (NSET)ParaTechs60010Contém espéculo de 6 mm. Apenas para uso único.
ProgesteronaSigmaP0130Solúvel em etanol. Use para  seção 3 (Preparação hormonal - injeção subcutânea) e  seção 4 (Preparação hormonal - pellets de liberação lenta)
ProgesteronaSigmaP7556Solúvel em água. Use para a seção 5 (Preparação hormonal - mini bombas osmóticas)
Pomada refrescante para os olhosAllerganNA42,5% p / v parafina líquida, 57,3% p / v parafina branca macia
Rimadyl CarprofenoZoetisNAStock 50 mg / mL. Use a 1 mg / ml (para dose de 5 mg / kg)
Tubo de borrachaDow Corning508-008Lavado em etanol 100% e cortado em pedaços de 1 cm. Diâmetro interno 1,57 mm ±   0,23 mm; diâmetro externo 3,18 mm ± 0,23 mm; parede 0,81 mm.
Suturas deSigmaS3547
Sofsilk do óleo de sésamo tamanho 3-0CovidienGS-832
seda

Referências

  1. Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
  2. Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
  3. Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
  4. Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O'Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
  5. Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
  6. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
  7. Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
  8. Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248(2022).
  9. Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
  10. Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
  11. Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
  12. Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809(2021).
  13. Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
  14. Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
  15. Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378(2014).
  16. Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
  17. Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
  18. Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
  19. Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
  20. Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
  21. Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
  22. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Decidualização ArtificialTransferência de EmbriõesAdministração de Hormônios ExógenosInjeção SubcutâneaPellets de ProgesteronaReceptividade EndometrialCorno Uterino
Métodos para o Estudo das Contribuições Uterinas para o Estabelecimento da Gestação em Modelo de Camundongo Ovariectomizado
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.