Artigo de método

Interrogação pareada célula-específica do epigenoma e transcriptoma ovariano de camundongos

DOI:

10.3791/64765

⸱

24 de fevereiro de 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, o método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram otimizados para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando o modelo de camundongo NuTRAP cruzado com uma linhagem de camundongo Cyp17a1-Cre.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A avaliação das alterações epigenômicas e transcriptômicas específicas do tipo celular é fundamental para a compreensão do envelhecimento ovariano. Para este fim, a otimização do método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram realizados para a subsequente interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando um novo modelo transgênico de camundongo NuTRAP. A expressão do alelo NuTRAP está sob o controle de um STOP floxado e pode ser direcionada para tipos específicos de células ovarianas usando linhas Cre promotoras-específicas. Uma vez que estudos recentes implicaram células estromais ovarianas na condução de fenótipos de envelhecimento precoce, o sistema de expressão NuTRAP foi direcionado para células estromais usando um driver Cyp17a1-Cre. A indução da construção NuTRAP foi específica para fibroblastos estromais ovarianos, e DNA e RNA suficientes para estudos de sequenciamento foram obtidos de um único ovário. O modelo e os métodos NuTRAP aqui apresentados podem ser usados para estudar qualquer tipo de célula ovariana com uma linha Cre disponível.

Introdução

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Os ovários são os principais atores no envelhecimento somático1, com contribuições distintas de populações celulares específicas. A heterogeneidade celular do ovário dificulta a interpretação dos resultados moleculares de ensaios volumosos de ovário inteiro. Compreender o papel de populações celulares específicas no envelhecimento ovariano é fundamental para identificar os fatores moleculares responsáveis pelo declínio da fertilidade e da saúde em mulheres idosas. Tradicionalmente, a avaliação multi-ômica de tipos específicos de células ovarianas era realizada por técnicas como microdissecção a laser2, abordagens unicelulares3 ou triagem celular4. No entanto, a microdissecção pode ser cara e de difícil execução, e a triagem celular pode alterar o perfil fenotípicocelular5.

Uma nova abordagem para avaliar perfis epigenômicos e transcriptômicos específicos de células ovarianas usa o modelo de camundongo de purificação de afinidade de ribossomo nuclear (NuTRAP). O modelo NuTRAP permite o isolamento de ácidos nucléicos específicos do tipo celular sem a necessidade de triagem celular usando os métodos de purificação por afinidade: tradução da purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT)6. A expressão do alelo NuTRAP está sob o controle de um STOP floxado e pode ser direcionada para tipos específicos de células ovarianas usando linhas Cre promotoras-específicas. Ao cruzar o camundongo NuTRAP com uma linha Cre específica do tipo celular, a remoção do STOP causa marcação eGFP do complexo ribossomal e marcação biotina/mCherry do núcleo de maneira dependentede Cre 6. As técnicas TRAP e INTACT podem então ser usadas para isolar o RNAm e o DNA nuclear do tipo celular de interesse e proceder a análises transcriptômicas e epigenômicas.

O modelo NuTRAP tem sido utilizado em diferentes tecidos, como tecido adiposo6, tecido cerebral 7,8,9 e retina10, para revelar alterações epigenômicas e transcriptômicas específicas do tipo celular que podem não ser detectadas no homogeneizado de tecido total. Os benefícios da abordagem NuTRAP sobre as técnicas tradicionais de classificação celular incluem o seguinte: 1) a prevenção de artefatos de ativação ex vivo 8, 2) a necessidade minimizada de equipamentos especializados (i.e., classificadores celulares) e 3) o aumento do rendimento e a diminuição do custo das análises específicas do tipo celular. Além disso, a capacidade de isolar DNA e RNA específicos do tipo celular de um único camundongo permite análises pareadas que aumentam o poder estatístico. Uma vez que estudos recentes têm implicado células estromais ovarianas na condução de fenótipos de envelhecimento precoce 11,12,13, direcionamos o sistema de expressão NuTRAP para células estromais e tecais usando um driver Cyp17a1-Cre. Aqui, demonstramos que a indução da construção NuTRAP é específica para células do estroma ovariano e teca, e DNA e RNA suficientes para estudos de sequenciamento são obtidos de um único ovário. O modelo e os métodos NuTRAP aqui apresentados podem ser usados para estudar qualquer tipo de célula ovariana com qualquer linha Cre disponível.

Para a geração de uma linhagem de camundongos NuTRAP ovarianos específicos do tipo celular, o alelo nuclear de marcação e purificação de afinidade do ribossomo (NuTRAP) tem um códon STOP floxado que controla a expressão de BirA, peptídeo de reconhecimento de biotina ligase (BLRP) marcado com mCherry/mRANGAP1 e eGFP/L10a. Quando cruzada com uma linha Cre específica do tipo celular, a expressão do NuTRAP rotula a proteína nuclear mRANGAP1 com biotina/mCherry e a proteína ribossomal L10a com eGFP de maneira Cre-dependente. Isso permite o isolamento de núcleos e RNAm de tipos celulares específicos sem a necessidade de classificação celular. Oflox/flox NuTRAP pode ser emparelhado com um Cre específico para o tipo de célula relevante para os tipos de células ovarianas para avaliar isso.

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Protocolo

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Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Camundongos progenitores foram adquiridos no Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e criados e alojados sob condições de FPS em um ambiente de barreira HEPA em um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h (luzes acesas às 6:00 horas) na OMRF.

NOTA: Nesta demonstração, usamos um macho Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) emparelhado com uma fêmea NuTRAP (Strain # 029899, The Jackson Laboratory). A progênie desejada Cyp17-NuTRAP (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) expressará o alelo NuTRAP sob o controle do promotor Cyp17a1 em células do estroma ovariano. Para a preparação deste manuscrito, foram utilizados camundongos fêmeas Cyp17-NuTRAP com 4 meses de idade (n = 4). DNA foi extraído de amostras de punch de orelha de camundongo para genotipagem para confirmação da herança dos transgenes Cyp17iCre e NuTRAP e para a detecção por PCR de 1) Cre genérico, 2) Cyp17iCre, e 3) floxed NuTRAP usando os primers listados na Tabela de Materiais, conforme descrito anteriormente 7,8.

1. Dissecção ovariana de camundongo

  1. Realizar a eutanásia de camundongos de acordo com as orientações de cuidados com os animais e aprovação da instituição, seguida da coleta de ovários.
  2. Disseque os ovários para remover qualquer tecido adiposo ou partes dos ovidutos que possam estar aderidas ao tecido ovariano antes de colocar os ovários em tubos com tampão. Prossiga imediatamente para as técnicas TRAP ou INTACT.
    NOTA: Este protocolo não foi otimizado para uso com tecido congelado. O uso de um ovário do mesmo camundongo para cada técnica é recomendado para futuras análises estatísticas.

2. Isolamento de núcleos de tipos específicos de células ovarianas

  1. Preparação do tampão
    1. Tampão de purificação nuclear (NPB): Para preparar 100 mL de NPB, combinar 2 mL de 1 M HEPES (concentração final: 20 mM HEPES), 0,8 mL de NaCl 5 M (NaCl 40 mM), 4,5 mL de KCl 2 M (90 mM KCl), 0,4 mL de 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 mL de 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), e 92,2 mL de água livre de nucleases. Suplementação com 1x inibidor de protease no dia do isolamento dos núcleos.
      NOTA: O NPB pode ser preparado sem o inibidor de protease com antecedência e dura até 3 semanas a 4 °C.
    2. Tampão de lise de núcleos (completo): Complemento de tampão de lise de núcleos com 1x inibidor de protease no dia do isolamento dos núcleos.
  2. Criação dos núcleos de suspensão
    NOTA: As amostras devem ser mantidas sempre congeladas, salvo indicação em contrário.
    1. Recolher um ovário de um rato Cyp17-NuTRAP (ou outro Cre-NuTRAP relevante) em 500 μL de tampão de lise nuclear (completo). Pique o ovário em oito partes dentro do tampão usando micro tesouras de abertura automática.
    2. Use pontas de pipeta de furo largo para transferir o ovário picado e 500 μL de tampão de lise em um homogeneizador de vidro Dounce no gelo. Homogeneizar o ovário 10x-20x com o pilão solto A. Adicionar 400 μL de tampão de lise ao homogeneizador Dounce, lavando o pilão A.
    3. Homogeneizar o ovário com o pilão B apertado 10x-20x. Adicionar 1.000 μL de tampão de lise, lavando o pilão B. Transfira o homogeneizado (1,9 mL) para um tubo de fundo redondo de 2 mL.
    4. Centrifugar a 200 x g por 1,5 min a 4 °C para remover tecidos e vasos sanguíneos indissociados14. O sobrenadante contém os núcleos; Descarte o pellet de tecido indissociado.
    5. Após pré-umedecer um filtro celular de 30 μm com 100 μL de tampão de lise, e filtrar o sobrenadante através do filtro celular em um tubo cônico de 15 mL. Em seguida, transfira a mistura contendo núcleos para um tubo de fundo redondo de 2 mL.
    6. Centrifugar a amostra a 500 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante. O pellet contém núcleos.
    7. Ressuspender a pelota nuclear em 250 μL de tampão de lise gelado por vórtice brevemente a velocidade moderada a alta. Aumentar o volume até 1,75 ml adicionando 1,5 ml de tampão de lise. Misture delicadamente e apoie a suspensão nuclear no gelo por 5 min.
    8. Pellet os núcleos por centrifugação a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a pelota nuclear. Ressuspenda a pelota em 200 μL de tampão de armazenamento gelado e vomite brevemente para ressuspender completamente a pelota nuclear.
    9. Reserve 10% do pellet ressuspendido (20 μL) como amostra de núcleos de entrada para análises a jusante.
    10. Pegue o pellet de núcleos ressuspensos e perfaça o volume para 2,0 mL com NPB gelado. Proceder ao isolamento dos núcleos marcados usando o método de purificação baseado em afinidade INTACT.
  3. Isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACTOS)
    1. Vórtice as contas de estreptavidina no frasco para injetáveis durante 30 s a uma velocidade média para garantir que estão totalmente ressuspensas. Adicionar 30 μL de contas ressuspensas para cada amostra em um tubo de fundo redondo de 2 mL (contas para até 10 amostras podem ser lavadas em um único tubo), adicionar 1 mL de NPB e ressuspender bem por pipetagem.
    2. Coloque o tubo no rack magnético por 1 min para separar as contas. Descarte o sobrenadante e remova o tubo do ímã. Ressuspender as esferas magnéticas lavadas em 1 mL de NPB.
    3. Repita a etapa de lavagem para um total de três lavagens. Após a lavagem final, ressuspender as esferas no volume inicial de NPB (30 μL por amostra).
    4. Adicionar 30 μL das esferas lavadas à suspensão nuclear de 2 ml a partir do passo 2.2.10. Ressuspenda bem a mistura de talão e núcleos pipetando e invertendo suavemente o tubo.
    5. Coloque os tubos em um misturador rotativo em uma câmara fria ou geladeira por 30 min em baixa velocidade. Incubar as amostras de entrada sem contas nas mesmas condições.
    6. Coloque os tubos com a suspensão nuclear e as contas sobre o ímã e separe os núcleos biotinilados ligados às esferas de estreptavidina (fração positiva) da fração negativa dos núcleos. Deixe as contas se separarem no ímã por 3 min.
    7. Retire o sobrenadante, passe a fração negativa para um tubo fresco de 2,0 mL e reserve no gelo. Para cada tubo de fração positivo, remova o tubo do ímã e ressuspenda o conteúdo em 1 mL de NPB.
    8. Coloque o tubo no ímã por 1 min e descarte o sobrenadante. Retire o tubo do ímã e ressuspenda a mistura de núcleos de contas lavada em 1 mL de NPB.
    9. Repetir o passo 2.3.8 para um total de três lavagens. Após a conclusão de três lavagens, ressuspender a mistura de núcleos fracionados positivos em 30 μL de NPB.
    10. Para cada tubo de fracção negativa, centrifugar a suspensão nuclear a partir do passo 2.3.7 a 500 x g durante 7 min a 4 °C. Aspirar e descartar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender a pastilha dos núcleos fracionários negativos em 30 μL de NPB.
    11. Conservar os núcleos a partir da entrada (passo 2.2.9), a fracção negativa (passo 2.3.10) e a fracção positiva (passo 2.3.9) num congelador de −80 °C até estarem prontos para o isolamento de ADN ou ARN nuclear.
      NOTA: Os núcleos não devem ser congelados para protocolos que exijam núcleos intactos como entrada (ou seja, ensaio para cromatina acessível à transposase, imunoprecipitação de cromatina).

3. Isolamento de RNAm de tipos específicos de células ovarianas

  1. Preparando os buffers
    1. Base tampão TRAP: Preparar 100 mL de base tampão TRAP combinando 78,8 mL de água livre de RNase, 5 mL de Tris-HCl 1 M (concentração final: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 mL de KCl 2 M (KCl 100 mM), 1,2 mL de 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) e 10 mL de 10% NP-40 (1% NP-40). Conservar a 4 °C até 1 mês.
    2. Base tampão salina alto: Preparar 100 mL de base tampão salina alta combinando 68,8 mL de água livre de RNase, 5 mL de Tris-HCl 1 M (concentração final: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 mL de KCl 2 M (KCl 300 mM), 1,2 mL de 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) e 10 mL de 10% NP-40 (1% NP-40). Conservar a 4 °C até 1 mês.
    3. Tampão de homogeneização TRAP (completo): Preparar 1,5 mL por amostra no dia da coleta do tecido. Preparar 10 ml de tampão de homogeneização TRAP combinando 10 ml de tampão base TRAP (do passo 3.1.1) com 10 μL de cicloheximida 100 mg/ml (concentração final: 100 μg/ml cicloheximida), 10 mg de heparina sódica (1 mg/ml de heparina sódica), 20 μL de TDT 0,5 M (TDT 1 mM), 50 μL de inibidor de RNase 40 U/μL (inibidor de 200 U/mL de RNase), 200 μL de espermidina 0,1 M (espermidina 2 mM) e um comprimido inibidor de protease livre de EDTA (1x).
    4. Tampão de lavagem com baixo teor de sal (completo): Fazer 1,5 mL por amostra no dia da coleta do tecido. Para fazer 10 ml de tampão de lavagem com baixo teor de sal, combinar 10 ml de tampão base TRAP (do passo 3.1.1) com 10 μL de cicloheximida 100 mg/ml (cicloheximida 100 μg/ml) e 20 μL de TDT 0,5 M (TDT 1 mM).
    5. Tampão de lavagem com alto teor de sal (completo): Fazer 1,5 mL por amostra no segundo dia de isolamento do TRAP. Para fazer 10 mL de tampão de lavagem com alto teor de sal, combinar 10 mL de tampão base de sal alto (da etapa 3.1.2) com 10 μL de cicloheximida 100 mg/mL e 20 μL de TDT 0,5 M.
  2. Realizando a purificação de afinidade do ribossomo (TRAP)
    1. Recolher o outro ovário de um rato Cyp17-NuTRAP (ou outro Cre-NuTRAP relevante) e colocá-lo num tubo sem RNase de 1,5 ml contendo 100 μL de tampão de homogeneização TRAP gelado (do passo 3.1.3). Pique o ovário em oito partes dentro do tampão usando micro tesouras de abertura automática.
    2. Use pontas largas para transferir o ovário e 100 μL de tampão de homogeneização para um homogeneizador Dounce de vidro. Homogeneizar 10x-20x com o pilão solto A. Adicionar 400 μL de tampão de homogeneização TRAP, lavando o pilão A.
    3. Transfira o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de 2 mL. Lavar o homogeneizador Dounce com mais 1 ml de tampão de homogeneização TRAP e transferir o volume lavado para o tubo de fundo redondo de 2 ml.
    4. Centrifugar o homogeneizado a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante limpo para um tubo de fundo redondo fresco de 2 mL. Descarte o pellet.
    5. Transfira 100 μL do homogeneizado limpo para um tubo de fundo redondo fresco de 2 mL e reserve como entrada no gelo.
    6. Incubar o resto do homogeneizado eliminado (a partir do passo 3.2.4) com um anticorpo anti-GFP (5 μg/ml) durante 1 h a 4 °C enquanto gira a extremidade sobre a extremidade. Incubar a amostra de entrada nas mesmas condições.
    7. Nos últimos 15 min da incubação, lavar as esferas magnéticas da proteína G no tampão de lavagem com baixo teor de sal utilizando os seguintes passos (3.2.8-3.2.11).
    8. Vórtice o frasco de grânulos magnéticos de proteína G por 30 s para ressuspender completamente. Transfira 50 μL das esferas magnéticas da proteína G para cada amostra (até 10 amostras podem ser lavadas em um tubo) para um tubo de fundo redondo de 2 mL.
    9. Adicione 500 μL de tampão de lavagem com pouco sal às contas e pipete suavemente para misturar. Coloque o tubo em um suporte magnético por 1 min para coletar as contas contra o lado do tubo. Retire e descarte o sobrenadante.
    10. Retire o tubo do suporte magnético e adicione 1 mL de tampão de lavagem com sal baixo ao tubo. Pipetar suavemente para misturar. Coloque o tubo em um suporte magnético por 1 min para coletar as contas contra o lado do tubo. Retire e descarte o sobrenadante.
    11. Repetir o passo 3.2.10 para um total de três lavagens. Após a lavagem final, retire o tubo do rack magnético e ressuspenda as esferas no volume inicial de tampão de lavagem com baixo teor de sal (50 μL por amostra).
    12. Transfira as esferas lavadas ressuspensas (50 μL) para a mistura de amostras de antigénio/anticorpos e incube a 4 °C durante a noite enquanto gira num misturador de ponta a ponta. Incubar as amostras de entrada girando de ponta a ponta a 4 °C durante a noite para manter condições equivalentes.
    13. Após a incubação durante a noite, remova os tubos do rotador e separe as esferas magnéticas com os ribossomos/RNA alvo (fração positiva) do sobrenadante (fração negativa) usando o suporte magnético por 2,5-3 min. Aspirar a fração negativa, colocá-la em um tubo de fundo redondo de 2 mL e colocá-la de lado no gelo enquanto processa a fração positiva.
    14. Adicionar 500 μL de tampão de lavagem com sal elevado (do passo 3.1.5) ao tubo com a fracção positiva e pipetar suavemente para misturar. Coloque o tubo em um suporte magnético mantido no gelo por 1 min para separar as contas. Descarte o sobrenadante e remova o tubo do ímã.
    15. Repetir o passo 3.2.14 para um total de três lavagens. Após a lavagem final, ressuspender as esferas em 350 μL de tampão de lise de RNA suplementado com 3,5 μL de 2-mercaptoetanol (BME). Incubar os tubos à temperatura ambiente enquanto mistura durante 10 min a 900 rpm num agitador digital.
    16. Separe as esferas da solução que agora contém os ribossomos/RNA alvo com um suporte magnético por 1 min à temperatura ambiente. Coletar a fração positiva eluída (sobrenadante) em um tubo fresco de 1,5 mL e adicionar 350 μL de etanol a 100%. Inverter para misturar. Prossiga para o isolamento de RNA.
    17. Opcional: Para isolar o ARN da amostra de entrada (passo 3.2.5) e da fracção negativa (passo 3.2.13), transfira 100 μL das fracções de entrada e negativas para tubos frescos de 1,5 ml. Adicionar 350 μL de tampão de lise de RNA suplementado com 3,5 μL de BME a cada amostra. Inverter para misturar. Adicione 250 μL de etanol a 100% a cada tubo e inverta para misturar. Prossiga para o isolamento de RNA.
  3. Isolamento de RNA
    1. Transferir 700 μL da fração positiva e, opcionalmente, da fração de entrada e/ou negativa para uma coluna de spin de RNA. Siga as instruções do fabricante para isolar o RNA da coluna de rotação.

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Resultados

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Um esquema dos protocolos TRAP e INTACT é mostrado na Figura 1. Aqui, a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP para células estromais/tecais ovarianas é demonstrada por imagem imunofluorescente e RNA-Seq a partir de RNA isolado por TRAP. Primeiramente, foram realizadas imagens de imunofluorescência do sinal da eGFP no ovário e localização do sinal da eGFP para as células da teca e do estromal. Resumidamente, cortes de 5 μm foram desparafinizados com gradiente de xileno e etanol....

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Discussão

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O modelo de camundongo NuTRAP6 é uma poderosa abordagem de marcação transgênica para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma de tipos celulares específicos que podem ser adaptados a qualquer tipo de célula com um driver Cre disponível. Aqui, demonstramos a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP em atingir tecas ovarianas e células estromais. O modelo Cyp17-NuTRAP pode ser usado para elucidar ainda mais os mecanismos epigenéticos específicos da teca e da célula estromal env...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por subsídios do National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) e Presbyterian Health Foundation. Este trabalho também foi apoiado em parte pelo prêmio MERIT I01BX003906 e um prêmio do Programa de Avaliação de Equipamentos Compartilhados (ShEEP) ISIBX004797 dos Estados Unidos (EUA). Departamento de Assuntos de Veteranos, Serviço de Pesquisa e Desenvolvimento de Laboratórios Biomédicos. Os autores também gostariam de agradecer ao Clinical Genomics Center (OMRF) e ao Imaging Core Facility (OMRF) pela assistência e uso do instrumento.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,1 M EspermidinaSigma-Aldrich05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/mL CicloheximidaSigma-AldrichC4859-1ML
2-mercaptoetanolSigma-AldrichM3148
30 µ Filtro de célula M Miltenyi Biotec130-098-458
All Prep DNA / RNA Mini KitQiagen80204
anticorpo anti-GFPAbcamAb290Para TRAP e IHC (Coelho policlonal para GFP)
Tampão de lise de RNA RLTQiagen79216em protocolo
cComprimido inibidor de protease completo, mini, livre de EDTARoche11836170001para homogeneização TRAP Modelo
de camundongo Buffer Cyp17iCreThe Jackson Laboratory28547B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 ímãInvitrogen12321D
Primers de GenotipagemIDTCustomGeneric Cre - Jackson Protocolo de laboratório 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - Protocolo de laboratório Jackson 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - Protocolo de laboratório Jackson 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626
Coquetel Inibidor de Protease Halt (100X)Thermo Scientific1861278Para NPB Buffer
M-280 Streptavidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 e micro; m de diâmetro do cordão
MixMateEppendorf5353000529
Kit de Isolamento de Núcleos: Núcleos EZ PrepSigma-AldrichNuc101Contém Tampão de Lise de Núcleos e Tampão de Armazenamento de Núcleos
1 M HEPESGibco15630-080
5 M NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0,5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0,5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
Modelo de rato NuTRAPO Laboratório Jackson29899B6; 129S6-Gt (ROSA) 26Sortm2 (CAG-NuTRAP) Evdr / J
Pierce DTT Formato sem pesoThermo ScientificA39255
Proteína G DynabeadsThermoFisher10004DPara TRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
Heparina de SódioFisher ScientificBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7,5Invitrogen15567-027
Rotador de tubos FisherScientificNC9854190
da VWR

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
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  4. Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591(2008).
  5. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
  6. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
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