Summary
В этом протоколе представлены основные методы и методы культивирования клеток, которые будут использоваться в исследовательской лаборатории клеточных культур, чтобы избежать заражения грибками и бактериями. В категории бактерий особый акцент будет сделан на предотвращении заражения микоплазмами.
Abstract
Клеточная культура — это тонкий навык, необходимый для выращивания клеток человека, животных и насекомых или других тканей в контролируемой среде. Цель протокола состоит в том, чтобы подчеркнуть правильные методы, используемые в исследовательской лаборатории для предотвращения загрязнения грибками и бактериями. Особое внимание уделяется предотвращению заражения микоплазмой, что является серьезной проблемой в помещении для культивирования клеток из-за его небольшого размера и устойчивости к большинству антибиотиков, используемых для культивирования клеток. Эти же методы обеспечивают непрерывный рост и поддерживают здоровые клетки. Как для новых, так и для опытных пользователей клеточных культур важно последовательно придерживаться этих передовых методов, чтобы снизить риск заражения. Раз в год лаборатории должны проводить обзор передового опыта в области клеточных культур и при необходимости проводить обсуждение или дополнительное обучение. Заблаговременное принятие мер по предотвращению загрязнения в первую очередь сэкономит время и деньги по сравнению с очисткой после загрязнения. Универсальные передовые методы поддерживают здоровье клеточных культур, тем самым уменьшая необходимость постоянного размораживания новых клеток, покупки дорогостоящих сред для клеточных культур и сокращения количества обеззараживания инкубаторов и времени простоя.
Introduction
Клеточная культура имеет множество применений в исследовательской лаборатории. С момента возникновения клеточных культур в начале 20-го века клеточные линии помогли продвинуть науку. Клеточные линии имеют ряд преимуществ; Различные клеточные линии могут помочь исследователям изучать клеточную биологию, производить бакуловирус для дальнейших исследований или производить большое количество белка, представляющего интерес, и это лишь некоторые изних. Некоторые дополнительные виды использования включают изучение роста тканей, помощь в разработке вакцин, токсикологические исследования, изучение роли генов в здоровых организмах и больных моделях, а также производство гибридных клеточных линий 2,3. Клеточные линии также могут обеспечивать производство лекарств3. При работе с клеточными линиями необходимы правильные асептические методики; Методы и методы, изложенные в этой рукописи, применимы к исследовательским лабораториям, где проводятся работы с клеточными культурами. Другие лабораторные условия не обсуждаются.
Загрязнение часто является основной проблемой при выполнении работы с клеточными культурами. В контексте этой статьи под загрязнением обычно понимаются грибки и бактерии. Общая цель метода, изложенного в этой статье, состоит в том, чтобы подробно описать лучшие практики предотвращения загрязнения. Все члены лаборатории должны придерживаться этих правил при работе в комнате клеточных культур исследовательской лаборатории. Лаборатории должны обеспечить, чтобы все работники были активными участниками использования этих передовых методов для предотвращения загрязнения. Знание правильных практик и методов поможет гарантировать, что клеточные культуры останутся жизнеспособными, здоровыми и свободными от загрязнения. Разработка этого метода основана на изучении литературы, семилетнем опыте работы с клеточными культурами и необходимости метода, к которому могут обращаться как новички, так и опытные работники клеточных культур на ежегодной основе.
Существует потребность в четкой, стандартизированной методике, которой должны следовать все исследовательские лаборатории клеточных культур. Большая часть литературы по загрязнению клеточных культур обсуждает обнаружение микоплазмы, асептические методы, источники загрязнения, устранение загрязняющих веществ и профилактику с помощью антибиотиков и регулярного тестирования 4,5,6,7,8. Хотя эта информация полезна, в литературе нет видеороликов, демонстрирующих правильные методы культивирования клеток, которым следует следовать. Преимущество представленных методов перед альтернативными методами заключается в том, что основное внимание уделяется предотвращению загрязнения до того, как оно произойдет, а не обнаружению и исправлению ошибок позже. Кроме того, тщательная демонстрация асептических методов, обсуждение предотвращения роста грибков и бактерий, а также информация о воздушном потоке шкафа биобезопасности ценны как для начинающих, так и для опытных работников клеточных культур.
Бактерии и грибки являются двумя наиболее распространенными типами загрязняющих веществ. В категории бактерий микоплазма является серьезной проблемой из-за ее небольшого размера и способности размножаться, оставаясь незамеченной. Это самовоспроизводящиеся организмы без жесткой клеточной стенки, рост которых зависит от эукариотических клеток. Они имеют сниженные метаболические возможности и могут сильно размножаться, оставаясь нераспознанными при обычном визуальном осмотре клеточных культур и регулярном микроскопическом анализе, хотя просвечивающая электронная микроскопия может обнаружить микоплазму 9,10. Более того, они могут проходить через микробиологические фильтры10. Питательная среда для клеточных культур обеспечивает микоплазму питательными веществами, хотя, к сожалению, добавление антибиотиков не влияет на микоплазму10. Следует отметить, что, как правило, нет необходимости дополнять среды антибиотиками; Надлежащих методов должно быть достаточно для предотвращения загрязнения. Заражение микоплазмой не приводит к немедленной гибели клеток, но это беспокоит исследователей, поскольку влияет на воспроизводимость и качество данных.
Весь персонал лаборатории должен строго придерживаться надлежащей практики культивирования клеток. Культуры следует проверять на микоплазму после того, как они были недавно приобретены, пока они в настоящее время выращиваются, перед криоконсервацией и при размораживании от жидкого азота 2,10. На рынке доступны различные тесты, использующие полимеразную цепную реакцию (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА) или иммуноокрашивание. 3 В литературе указывается, что «человеческие изоляты представляют собой большой процент загрязнителей микоплазмы, обнаруженных в культуре клеток»5. Хотя было описано более 200 видов микоплазмы, около шести из них являются причиной большинства инфекций. Этими шестью видами являются M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale и Acholeplasma laidlawii10. Как и в случае с другими типами загрязнения, воздух и аэрозоли переносят их в клеточные культуры5. Это повторяется в других работах, поскольку «человек-оператор потенциально представляет наибольшую опасность в лаборатории»7. Хотя это делается из-за человеческой ошибки, риск можно устранить, если следовать стандартной процедуре. Выделение от персонала не ограничивается только заражением микоплазмой; Клеточные культуры в одной лаборатории обычно инфицированы одними и теми же видами микоплазмы, что указывает на то, что загрязнение распространяется от одной колбы к другой из-за неправильных методов культивирования клеток10.
Предотвращение перекрестного загрязнения также является еще одной причиной, по которой следует следовать правильным методам культивирования клеток. Отмечается, что, по крайней мере, 15–18% клеточных линий во всем мире могут быть перекрестно загрязнены или неправильно идентифицированы11,12. В дополнение к тестированию клеточных линий на микоплазменное загрязнение, они также должны быть проверены на перекрестную контаминацию10. Для клеточных линий человека аутентификация клеточных линий с помощью недорогого метода на основе ДНК, называемого профилированием короткого тандемного повтора (STR), является текущим международным эталонным стандартом, поскольку это простой способ подтвердить идентичность клеточной линии 2,10,13,14. STR может идентифицировать неправильно маркированные или перекрестно загрязненные клеточные линии, но он не может обнаружить неправильное происхождение ткани10,13,14. Достоверность данных исследований может быть поставлена под угрозу, если клеточные линии неправильно маркированы, неправильно идентифицированы или загрязнены13. Подобно другим типам загрязнения, перекрестное загрязнение может происходить из-за плохой техники, вызывающей распространение аэрозолей, ошибочного контакта, приводящего к попаданию неправильного типа клеток в колбу, или использования одной и той же бутылки с носителем и реагентов с разными клеточными линиями10. Совместное использование бутылок с носителями не должно происходить; Совместное использование одной бутылки среды между двумя разными клеточными линиями может позволить этим клеточным популяциям смешиваться, что приводит к тому, что более быстрорастущий тип клеток полностью захватывает колбу. Эта замена не заметна и приводит к неправильной маркировке и неправильной идентификации2. Клеточная линия также может быть ошибочно принята за другую, если культуры перепутаны во время обработки или маркировки10. Особое внимание следует уделять хранению реагентов, сред и колб отдельно друг от друга. У каждого члена лаборатории должны быть свои собственные бутылки-носители; Между членами лаборатории не должно происходить совместное использование. Сами клеточные линии должны быть приобретены у квалифицированного банка клеток и поставщика. Лаборатории не должны делиться клетками. Исследования показывают, что, хотя тесты STR и микоплазмы используются регулярно, во многих исследовательских работах в литературе уже использовались неправильно идентифицированные или загрязненные клеточные линии15. Просеивание исследований, чтобы найти эти проблемные статьи и задним числом проинформировать читателей об этом вопросе, является громоздким. Профилактика - лучший способ гарантировать, что эта проблема не возникнет в первую очередь.
Простое действие распыления предметов с 70% EtOH может убить организмы; 70% EtOH работает путем денатурации белков и растворения липидов в наиболее часто загрязняющих организмах, включая бактерии и грибы16. Исследования показали, что 70% является наиболее эффективной концентрацией; поверхностные белки не коагулируют быстро с 70% EtOH, поэтому они могут проникнуть в клетку, в то время как содержащаяся в них вода необходима для процесса денатурации белков. Из-за разницы в концентрациях воды и спирта по обе стороны клеточной стенки 70% EtOH поступает в клетку для денатурации как ферментативных, так и структурных белков. Если в колбах наблюдается рост плесени, весь инкубатор необходимо обеззаразить, сначала опрыскав его 70% EtOH и вытерев насухо, а затем 16-часовую ночную инкубацию при 60 ° C17. Это убивает большую часть плесени и любых бактерий.
Основное преимущество профилактических практик по сравнению с альтернативными методами устранения загрязнения после его возникновения заключается в том, что, предотвращая загрязнение на ранней стадии, лабораторные работники могут быть уверены, что их клеточные культуры здоровы и не будет высоких затрат, связанных с обеззараживанием инкубаторов или выбрасыванием клеточных культур. Удаление микоплазменных загрязнителей, например, после, не является эффективным7. Если вы потратите время на то, чтобы убедиться, что лабораторный персонал должным образом обучен, комната для культивирования клеток автономна, а стандартная процедура используется, это сэкономит время и деньги.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
- Общее
- Носите чистый лабораторный халат, предназначенный для ношения только в комнате клеточных культур и ни в каких других частях лаборатории.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лабораторный халат не обязательно должен быть стерильным. - Наденьте новые перчатки, которые не касались других поверхностей. Убедитесь, что перчатки плотно прилегают. Лучше всего подойдут нитриловые, неопудренные перчатки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перчатки не обязательно должны быть стерильными. - Чтобы подготовиться к работе, опрыскайте перчатки, рукава лабораторного халата и внутреннюю часть шкафа биологической безопасности 70% EtOH. Рабочую поверхность и стеклянную панель насухо протрите безворсовым бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 70% EtOH убивает бактерии с высочайшей эффективностью16. Бумажное полотенце не обязательно должно быть стерильным. - Держите водяные бани в помещении для клеточных культур и используйте их только для нагрева питательных сред или размораживания клеток. Сливайте воду и мойте водяные бани один раз в неделю, следуя инструкциям производителя по очистке.
- Носите чистый лабораторный халат, предназначенный для ношения только в комнате клеточных культур и ни в каких других частях лаборатории.
- Внутри шкафа биологической безопасности
- Ограничьте количество предметов, вносимых в шкаф. Не прерывайте поток воздуха внутри шкафа биологической безопасности, блокируя переднюю или заднюю решетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1 для объяснения того, как воздух течет внутри шкафа. - Опрыскайте все предметы, помещенные внутри шкафа, 70% EtOH и вытрите их насухо. Начните с распыления на верхнюю часть флакона носителя и двигайтесь вниз. Точно так же чистым бумажным полотенцем вытрите его насухо, постепенно продвигаясь ко дну. Не поднимайтесь обратно к крышке.
- Если шкаф достаточно велик для размещения серологических пипеток, их можно поместить внутрь, в противном случае их можно хранить в емкости, установленной снаружи шкафа. Перед использованием проверьте обе стороны закрытой пипетки на наличие отверстий, разрывов или проколов в упаковке. Не срывать обертку. Вместо этого аккуратно снимите концы упаковки, вставьте серологическую пипетку в пипетку и снимите обертку одним жидким движением.
- Не нависайте над открытыми бутылками или колбами; Протяните руку над открытыми бутылками или колбами или откройте предметы поверх уже открытых предметов в шкафу биологической безопасности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушный поток внутри шкафа давит на рабочую поверхность, поэтому любое загрязнение, присутствующее, например, на рукаве, может попасть в клеточные культуры. - Не наливайте жидкости. Вместо этого добавьте их с помощью серологической пипетки. После добавления среды тщательно перемешайте содержимое и инициируйте флакон. Кроме того, не забудьте включить метку для того, чем был дополнен носитель.
- Ограничьте количество предметов, вносимых в шкаф. Не прерывайте поток воздуха внутри шкафа биологической безопасности, блокируя переднюю или заднюю решетки.
2. Работа с адгезивными клеточными линиями
- Если нужна пластиковая колба, опрыскайте весь пакет и поместите его внутрь шкафа.
- Используйте автоклавные стеклянные пипетки или одноразовые стерильные пластиковые пипетки для аспирации среды или моющих растворов. Осторожно снимите металлический колпачок с контейнера для хранения. Изолируйте одну стеклянную пипетку, осторожно встряхнув емкость под углом. Залезая в контейнер, не прикасайтесь к другим пипеткам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте выбранную пипетку только с одного конца. - Быстро замените крышки на бутылках как можно скорее. Поместите колпачки на рабочую поверхность вверх дном так, чтобы ободок не касался рабочей поверхности. Не хватайтесь за колпачок сверху или снизу; Вместо этого прикоснитесь к колпачкам с боков.
- При аспирации жидкостей используйте колбу-ловушку, расположенную снаружи шкафа во вторичном контейнере на полу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбрасывайте жидкие отходы в мешки для биологически опасных отходов, так как пакеты могут протекать. Отходы будут создаваться во время работы внутри шкафа. Слишком частое перемещение рук внутрь и наружу шкафа прервет поток воздуха. Временно оставьте все отходы внутри шкафа. Отложите его в сторону, чтобы он не прерывал работу. - Обильно сбрызгивайте перчатки 70% EtOH каждый раз, когда они высыхают. Потрите руки друг о друга, чтобы перчатки не промокли.
- Если серологическая пипетка по ошибке задела что-то в шкафу, не стесняйтесь выбросить ее. Начните заново с чистой серологической пипетки вместо того, чтобы использовать ту, которая может быть загрязнена.
4. Проверка и хранение ячеек
- Перед помещением клеток в инкубатор проверьте, как они выглядят под микроскопом. Если клетки были тщательно подвешены, следует наблюдать за отдельными клетками.
- Не говорите, не чихайте, не кашляйте и не дышите тяжело в инкубаторы. Быстро открывайте и закрывайте дверцы инкубатора. Если оставить двери открытыми дольше, чем необходимо, это может привести к попаданию загрязняющих веществ, присутствующих в воздухе, в инкубаторы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ношение маски во время работы в комнате клеточных культур может помочь, поскольку микоплазма может присутствовать во рту человека. Избегайте использования сотовых телефонов в комнате клеточной культуры, так как разговаривать не рекомендуется. - Убедитесь, что крышки на всех бутылках плотно закрыты, прежде чем вынимать бутылки из шкафа.
- Храните среду для культивирования клеток в темноте при температуре 4 ° C, когда она не используется, так как она чувствительна к свету.
- После завершения работы по культивированию клеток снова опрыскайте внутреннюю часть шкафа 70% EtOH и вытрите поверхность насухо бумажным полотенцем. Опорожните мешки для биологически опасных отходов. Повторите этот процесс и замените перчатки при переходе на другую клеточную линию.
5. Работа с суспензионными клеточными линиями
- Для суспензионных ячеек, выращенных в стеклянных колбах, убедитесь, что перчатки тщательно опрысканы 70% EtOH, затем прикоснитесь к алюминиевой фольге влажными перчатками и опрыскайте только дно колбы, прежде чем помещать ее внутрь шкафа.
- При взятии образца для подсчета клеток извлеките из контейнера только одну пробирку объемом 1,5 мл. Не прикасайтесь к другим трубкам. Поместите колпачок вверх дном на рабочую поверхность. Не прикасайтесь к внутреннему ободу. Обращайтесь с ним осторожно с боков и замените его после завершения.
- Осторожно снимите сложенный вдвое кусок алюминиевой фольги, который покрывает все горлышко колбы. Прикасайтесь к стеклянной колбе только снизу - не прикасайтесь к ней с горлышка - после того, как фольга снята. Используйте серологическую пипетку объемом 1 мл, чтобы взять образец для подсчета клеток.
- Не допускайте стекания носителя по стенкам колб; если это так, сбрызните бумажное полотенце 70% EtOH и сразу же очистите его.
- Убедитесь, что крышки и алюминиевая фольга затянуты, прежде чем вынимать бутылки или колбы из шкафов биологической безопасности.
6. Клеточная инкубация
- Используйте отдельные инкубаторы для разных типов клеток, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение разных типов клеток.
7. Сбор жидких отходов
- Соберите жидкие отходы в колбу вакуумной ловушки, расположенную снаружи шкафа на полу, во вторичном контейнере с надписью «Отходы».
ПРИМЕЧАНИЕ: Шланг подключен к высокоэффективному фильтру поглощения твердых частиц (HEPA), который заменяется ежемесячно.
8. Очистка
- Извлеките пакет для биологически опасных отходов и как можно скорее вымойте стеклянные колбы. Соблюдайте протокол мытья стекол у раковины. Протокол стирки см. в дополнительном файле 1 .
- Автоклавировать стеклянную посуду для клеточных культур вместо того, чтобы отправлять ее на мойку стекла. Храните его отдельно от стеклянной посуды в основной зоне лаборатории.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки SF-9 оставляют ободок мертвых клеток на боковой стороне колб, если стекло не вычищено должным образом. Протокол автоклава см. в дополнительном файле 1 .
9. Организационная структура
- Организуйте комнату клеточных культур так, чтобы все расходные материалы располагались в одной зоне, тем самым сведя к минимуму необходимость для сотрудников лаборатории покидать комнату в поисках расходных материалов.
- Маркируйте любые пластиковые бутылки, используемые для сбора клеток и повторно используемые в клеточных культурах впоследствии, как «Только для использования в клеточных культурах». Используйте специальные флаконы для клеточных культур для одного конкретного типа клеток. Храните флаконы в помещении для культивирования клеток для легкого доступа.
10. Идентификация бактерий, грибков и микоплазменного загрязнения
ПРИМЕЧАНИЕ: Несоблюдение описанного выше рабочего процесса может привести к заражению бактериями, грибками и микоплазмами.
- Всегда перед началом работы наблюдайте за колбами на предмет сильного помутнения, дополнительного роста в виде нечетких шариков и плотных скоплений клеток сбоку, которые являются индикаторами загрязнения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опытный глаз может определить разницу между мутностью, вызванной микробным загрязнением, и фактическими клетками. В то время как клетки приводят к тому, что обычно прозрачная среда кажется мутной, бактериальное загрязнение вызывает сильное помутнение с белым цветом.- Визуально определите загрязнение плесенью, отметив появление круглых нечетких шариков, плавающих в среде (см. рис. 2).
- Визуально определите бактериальное загрязнение, если среда мутная, белая или турбулентная (см. рис. 2).
- Определите загрязнение микоплазмой, проводя ежемесячный тест на микоплазму. Один тест на основе ПЦР инструктирует пользователей взять образец клеток объемом 1,5 мл, выполнить подсчет клеток с использованием 10 мкл, разбавить до 0,08 x 106 клеток / мл, раскрутить клетки, лизировать клетки с помощью буфера, содержащегося в наборе, и открутить вниз в последний раз. Надосадочную жидкость инкубируют с праймерами, которые усиливают ряд видов микоплазмы. Запустите гель ДНК, чтобы визуализировать полосы. Отсутствие полос означает, что микоплазма не идентифицирована.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот основной загрязнитель может присутствовать во рту человека. Хорошей практикой является тестирование на загрязнение микоплазмой клеток после их размораживания и перед использованием в экспериментах. После этого контролируйте клетки на предмет загрязнения микоплазмой один раз в месяц. Многие компании предлагают наборы для тестирования микоплазмы. Выберите тот, который подходит.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Если не следовать надлежащим методам и практикам культивирования клеток, изложенным в этой статье, в исследовательской лаборатории клеточных культур может произойти заражение грибами и бактериями. На рисунке 2 показаны колбы, содержащие загрязнение как в суспензии, так и в адгезивных культурах.
При несоблюдении асептических методов заражение плесенью может произойти через 2-3 дня. Круглые нечеткие шарики, плавающие в среде, заметны в ячейках суспензии, в то время как рост плесени в прикрепленных клетках можно наблюдать в виде больших, неправильных, белых или зеленых пятен.
Для бактерий загрязнение наблюдается на следующий день. Средства массовой информации турбулентны, белы и облачны. Белый цвет характерен для бактериальных клеток, которые размножаются гораздо быстрее, чем клеточные линии. Опытный глаз способен отличить незагрязненную среду от загрязненной. Для прикрепленных ячеек можно сравнить бутылку с неоткрытой средой с колбой, чтобы проверить, не видна ли в колбе турбулентность.
Внутри шкафа биологической безопасности количество предметов должно быть минимальным. Не кладите предметы на заднюю и переднюю решетки (см. рисунок 3). В этом шкафу находится набор пипеток, наконечники, автоклавные стеклянные пипетки, пипетка и маркеры. Рабочая зона посередине чистая. Держать шкафы организованными таким образом - хорошая идея. Кроме того, перед началом работы оператор должен надеть чистый лабораторный халат и перчатки. Поблизости следует держать пульверизатор с 70% EtOH, чтобы оператор мог часто опрыскивать перчатки. Кожа закрыта перчатками или лабораторным халатом. Оператор должен отрегулировать свое кресло так, чтобы его руки находились под углом 90° при работе внутри шкафа, а предметы должны быть в пределах легкой досягаемости внутри шкафа (см. Рисунок 4).
Многие виды микоплазмы могут быть надежно идентифицированы с помощью анализа на основе ПЦР. На рисунке 5 показаны результаты отрицательного теста на микоплазму. Полоса слева показывает стандарты молекулярной массы для ДНК. Четыре полосы справа являются положительными элементами управления. Полосы не появляются под тестируемыми типами клеток, потому что микоплазма не была обнаружена.
Если среда содержит индикаторы рН, она будет красного цвета для оптимального значения рН клеток на уровне 7,4. Как только клетки вырастут, носитель изменит цвет с красного на желтый3. Это изменение цвета также может произойти, если бактерии захватят колбу и разрастут (рис. 6). Желтый цвет указывает на низкий рН. Наблюдение за новой, неоткрытой бутылкой со средой рядом с колбой является объективным способом наблюдения за загрязнением в прикрепленных клетках. Для суспензионных культур пользователь может внимательно наблюдать за колбой на предмет любых наростов, плавающих в среде, или наличия толстого кольца разросшихся бактериальных клеток вокруг внутренней части стеклянной колбы. Для обоих типов клеток можно взять небольшой образец и наблюдать его под микроскопом. Если наблюдаются другие наросты или формы клеток, особенно если клетки движутся, то это показатель загрязнения (рис. 7). Перед подсчетом клеток следует провести тщательную очистку гемоцитометра, так как этот тип мусора может присутствовать только на гемоцитометре, а не в самих клеточных культурах.
Запах может быть еще одним индикатором загрязнения в инкубаторе. Избыточный бактериальный рост имеет типичный запах, который заметит опытный пользователь клеточных культур. Запах всегда совпадает с запахом зараженной колбы, хотя одна зараженная колба не всегда может вызвать запах всего инкубатора.
Загрязнение плесенью, как правило, более распространено в клетках HEK 293 S, выращенных в суспензии. Бактериальное загрязнение чаще встречается в клетках SF-9. Это может быть связано с тем, что клетки RIC выращиваются при влажности, что приводит к накоплению влаги в инкубаторах. Клетки SF-9 выращиваются без влажности, поэтому окружающая среда более сухая. Скорость контаминации в адгезивных культурах меньше, чем скорость контаминации в суспензионных культурах. Это может быть связано с меньшим размером колбы, немногоразовым характером колбы или вентилируемой крышкой вместо использования алюминиевой фольги.
Микоплазму нельзя наблюдать ни невооруженным глазом, ни обычным световым микроскопом, хотя специализированная просвечивающая электронная микроскопия может обнаружить микоплазму. Набор для идентификации микоплазмы следует использовать для ежемесячного тестирования клеточных культур. Многие виды микоплазмы могут быть надежно идентифицированы с помощью анализа на основе ПЦР. Краткое описание того, как проводится этот ПЦР-тест, можно найти в разделе протокола, а более подробную информацию о микоплазме можно найти в разделе обсуждения.
Рисунок 1: Как воздух течет в шкафу биобезопасности. Шкафы биологической безопасности вытягивают загрязненный воздух из самого помещения и из шкафа через переднюю и заднюю решетки. Этот воздух проходит под металлической рабочей поверхностью, к задней части шкафа и к верхней части устройства, где расположен HEPA-фильтр. Там воздух проходит через фильтр и фильтруется. Этот чистый воздух давит на рабочую поверхность. Из-за того, как поток отфильтрованного воздуха выталкивается внутрь шкафа, рекомендуется не парить. Например, нежелательно иметь рукав поверх открытой бутылки и рисковать попаданием любых потенциальных загрязняющих веществ в среду. Количество предметов, заносимых внутрь шкафа, должно быть минимальным, и предметы не должны размещаться на передних или задних решетках, чтобы не прерывать поток воздуха. Слишком быстрое перемещение рук внутрь и наружу из шкафа также может нарушить воздушный поток. Создано для NuAire, Inc., Джеффом Капхингстом, Jeff the Designer, LLC. Используется с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Незагрязненные суспензии и адгезивные клетки и клетки, загрязненные плесенью или бактериями. Первое изображение слева содержит клетки насекомых (клетки SF-9), которые не загрязнены. На втором изображении показана еще одна колба с этими клетками, загрязненная плесенью. Третья колба была заражена бактериями, о чем можно судить по густому, белому, мутному виду. Вторая и третья колбы были загрязнены из-за того, что не были соблюдены надлежащие методы и практики культивирования клеток. Все колбы были приготовлены в один и тот же день. Рост наблюдался на следующий день при бактериальном загрязнении и через 2 дня при заражении плесенью. Показаны незагрязненные адгезивные клетки (клетки Hek293) вместе с плесенью и бактериальным загрязнением в адгезивных культурах. Заражение плесенью показано во второй строке в круглой чашке Петри. Фото делается с верхней части блюда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Организация кабинета клеточных культур. Внутри шкафа биологической безопасности количество предметов должно быть минимальным. Следует избегать размещения предметов на задней и передней решетках. В этом шкафу находится набор пипеток, наконечники, автоклавные стеклянные пипетки, пипетка и маркеры. Рабочая зона посередине чистая. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Правильный способ работы оператора под проточным колпаком. Перед началом работы оператор должен надеть чистый лабораторный халат и перчатки. Поблизости следует держать пульверизатор с 70% EtOH, чтобы оператор мог часто опрыскивать перчатки. Кожа закрыта перчатками или лабораторным халатом. Оператор должен отрегулировать свое кресло так, чтобы его руки находились под углом 90° при работе внутри шкафа. Предметы должны быть в пределах легкой досягаемости внутри шкафа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Отрицательный результат теста на микоплазму. Многие виды микоплазмы могут быть надежно идентифицированы с помощью анализа на основе ПЦР. Полоса слева показывает стандарты молекулярной массы для ДНК. Четыре полосы справа являются положительными элементами управления. Полосы не появляются под тестируемыми типами клеток, потому что микоплазма не была обнаружена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Нормальный цвет носителя меняется с красного на желтый. Среды для культивирования клеток меняют цвет с красного на желтый, если присутствуют индикаторы pH. Желтый цвет указывает на низкий рН, и носитель следует заменить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Загрязняющие вещества, наблюдаемые под световым микроскопом. Если при подсчете клеток под световым микроскопом наблюдаются другие наросты или формы клеток, то это может быть индикатором загрязнения. Следует отметить, что перед подсчетом клеток следует провести тщательную очистку гемоцитометра, так как этот тип мусора может присутствовать только на гемоцитометре, а не в самих клеточных культурах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Приложение Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как загрязнение является одной из основных проблем при выполнении работы с клеточными культурами, методы и методы, изложенные в этой рукописи, помогут снизить риски. Критические шаги включают в себя ношение чистого лабораторного халата, который используется только в комнате для клеточных культур, использование чистых, неопудренных перчаток, которые часто распыляются 70% EtOH и которые меняются при переключении между клеточными линиями, поощрение каждого человека не делиться бутылками со средой, тщательная очистка шкафа до и после окончания работы, аккуратно разворачивать серологические пипетки, избегать длительного тесного контакта с открытыми флаконами или колбами, не делить флаконы со средой между несколькими клеточными линиями, а также быстро открывать и закрывать дверцы инкубатора. Кроме того, мойка и автоклавирование собственной стеклянной посуды обеспечивает контроль качества, тем самым снижая вероятность попадания внешних загрязнений. Методы контроля качества включают использование автоклавной ленты, чтобы указать, достигла ли стерилизатор надлежащей температуры 121 °C, регулярное профилактическое обслуживание оборудования и визуальный осмотр колбы, чтобы убедиться, что она была правильно очищена18. Еще одним важным моментом является использование отдельных инкубаторов для разных типов клеток, чтобы гарантировать, что загрязнение от одного типа клеток не будет перенесено на другие, а также гарантировать, что перекрестное загрязнение клетками не произойдет.
Бактериальные и грибковые инфекции являются двумя наиболее распространенными злоумышленниками в клеточных культурах. Один из основных загрязнителей, M. orale, является наиболее распространенным видом микоплазмы во рту человека, а также «представляет собой единственный наиболее распространенный изолят, на долю которого приходится 20–40% всех микоплазменных инфекций в клеточных культурах»4. Другими словами, персонал лаборатории является основным источником этого загрязнения. Это всегда вызывает беспокойство в помещении для культивирования клеток, поскольку микоплазма представляет собой маленький, медленно растущий микроорганизм, не имеющий жесткой клеточной стенки, которая может проходить через фильтры 0,45 мкм4. Исследования показывают, что частота заражения микоплазмой составляет 15–35% от непрерывных клеточных линий человека или животных4. Кроме того, статистика показывает, что от 5% до 30% клеточных линий в мире загрязнены микоплазмами6. К сожалению, микоплазма устойчива к большинству антибиотиков, используемых для культивирования клеток, и инфекция может влиять на физиологию и метаболизм клеток 4,6. Хотя загрязнение не замедляет клеточный метаболизм, оно может загрязнять конечный продукт6. Инфекции могут сохраняться без того, чтобы члены лаборатории заметили повреждение клеток. Если загрязнение действительно происходит, затраты на размораживание новых клеток, время, затрачиваемое на размножение новых культур, дорогостоящие среды, которые были потрачены впустую, обеззараживание инкубаторов и количество времени, которое коллеги тратят на ожидание повторного начала своих экспериментов, огромны. По оценкам нашей лаборатории, общее потерянное время составляет 2 недели, а общая стоимость, связанная с загрязнением типичной экспрессии белка клеток млекопитающих человека 8 л, составляет 1,400 долларов США. Методы и методы, изложенные в этой рукописи, предлагают хорошие профилактические меры для снижения дополнительных затрат, потери клеток и простоев.
Вносить изменения в эти методики не рекомендуется. Все члены лаборатории должны пройти обучение перед работой в комнате клеточных культур, а затем проходить повышение квалификации каждый год7. Члены лаборатории также должны организовать комнату клеточных культур таким образом, чтобы все необходимые материалы находились в одной зоне, тем самым сводя к минимуму необходимость для членов лаборатории выходить из комнаты клеточных культур в поисках расходных материалов.
Ограничения представленных методов наблюдаются, если загрязнение происходит из внешних источников, таких как сыворотка, инкубаторы, неисправные автоклавы, грязные лабораторные халаты или источник клеток. Устранение неисправностей техники может потребоваться, если загрязнение происходит, несмотря на строгое соблюдение этого протокола. Многие внешние факторы могут способствовать этому типу загрязнения. Сотрудники лаборатории должны быть осмотрительными и проверять внешние источники. Например, партия эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), приобретенная у поставщика, могла быть загрязнена микоплазмой. По сравнению с 1950-ми годами, сейчас это редкое явление, но все еще может произойти6. Все бутылки с носителями следует выбросить, если будет замечено какое-либо загрязнение, и протокол перезапустится путем размораживания новых ячеек и использования новых носителей. Загрязнение могло уже присутствовать внутри инкубатора, если это плесень или бактерии; Другие колбы внутри того же инкубатора следует проверить, не наблюдается ли рост бактерий или плесени. Все загрязненные колбы следует выбросить, а инкубатор обеззаразить. Если загрязнение не обнаружено, автоклав следует проверить на наличие неисправных ошибок; Стеклянная посуда, возможно, не была автоклавирована должным образом. Автоклавная лента может изменить цвет, несмотря на то, что температура автоклава не достигает 121 °C. После этого следует проверить сроки годности используемых растворов антибиотиков; Возможно, потребуется приобрести новые решения. Наконец, следует учитывать источник клеток; Были ли они получены от надежного поставщика лабораторий или заимствованы из другой лаборатории? Клетки всегда следует приобретать у надежного поставщика лабораторий и никогда не следует заимствовать в другой лаборатории. Наконец, лабораторные халаты следует стирать, чтобы обеспечить их чистоту19. Обеззараживание инкубаторов следует рассматривать всякий раз, когда колба была загрязнена. Нельзя допускать, чтобы бактерии, клетки или споры плесени размножались и продолжали распространять загрязнение.
Существующие методы направлены на устранение загрязнения. Методы, изложенные в этой рукописи, направлены на предотвращение, а не устранение загрязнения. Существует несколько процедур, касающихся использования антибиотиков для удаления микоплазмы20. Однако использование антибиотиков рискованно, поскольку они не могут полностью устранить инфекцию и «могут способствовать развитию резистентных организмов»12. Фактически, «было показано, что 72% культур, постоянно выращиваемых в антибиотиках, являются микоплазмоположительными, в то время как только 7%, выращенных в отсутствие антибиотиков, были инфицированы»12. Эти данные подчеркивают идею о том, что, хотя использование антибиотиков рекомендуется и может быть полезным, чрезмерное использование или полная зависимость от антибиотиков не приносят пользы. Кроме того, использование антибиотиков для удаления загрязнения может только позволить проблеме сохраняться. Растворы антибиотиков не нужны; Если следовать методам, изложенным в этом документе, загрязнение должно быть успешно предотвращено.
Методы и методы, изложенные в этой рукописи, могут быть использованы в будущем для поддержания асептической среды при проведении ежемесячного теста на микоплазму и при создании самодельных компетентных бактериальных клеток. Оба протокола требуют чистой среды, аналогичной работе с клеточными культурами, чтобы конечный продукт не был загрязнен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У автора нет каких-либо конфликтующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа стала возможной благодаря финансированию Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI). Мы хотели бы поблагодарить нашего руководителя лаборатории Цзюэ Чен за прочтение рукописи и за ее постоянную поддержку, Донну Таллент за ее полезные правки и комментарии, а также Джеффа Хеннефельда из отдела информационных технологий Рокфеллеровского университета за его помощь с видеокомпонентом этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
References
- Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
- Stacey, G. N.
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R.
- Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098 (2019).
- Gabelli, S., Zhao, C., Oberst, J. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science. , Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020).
- Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
- Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676 (2019).
- Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
- Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal. , Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties (2023).
- United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications. , Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004).
- Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023).
- Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Penning, S. D. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire. , Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020).
- Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).
