Cellekulturteknikker og praksis for at undgå forurening med svampe og bakterier i forskningscellekulturlaboratoriet

Summary

Denne protokol præsenterer vigtige cellekulturteknikker og -praksis, der skal anvendes i forskningscellekulturlaboratoriet for at undgå forurening med svampe og bakterier. Inden for kategorien bakterier vil der blive lagt særlig vægt på at forhindre mycoplasma-kontaminering.

Abstract

Cellekultur er en delikat færdighed, der er nødvendig for dyrkning af menneske-, dyre- og insektceller eller andre væv i et kontrolleret miljø. Målet med protokollen er at understrege de korrekte teknikker, der anvendes i et forskningslaboratorium for at forhindre forurening fra svampe og bakterier. Der lægges særlig vægt på at undgå mycoplasmakontaminering, et stort problem i cellekulturrummet på grund af dets lille størrelse og resistens over for de fleste antibiotika, der anvendes til cellekultur. Disse samme teknikker sikrer kontinuerlig vækst og opretholder sunde celler. For både nye og erfarne cellekulturbrugere er det vigtigt konsekvent at overholde disse bedste fremgangsmåder for at mindske risikoen for kontaminering. En gang om året bør laboratorier gennemgå bedste praksis for cellekultur og følge op med en diskussion eller yderligere træning, hvis det er nødvendigt. Tidlig handling for at forhindre forurening i første omgang vil spare tid og penge sammenlignet med oprydning efter forurening. Universel bedste praksis holder cellekulturer sunde og reducerer derved behovet for konstant at tø nye celler op, købe dyre cellekulturmedier og reducere mængden af inkubatordekontaminering og nedetid.

Introduction

Cellekultur har mange anvendelser i forskningslaboratoriet. Siden cellekulturens oprindelse i begyndelsen af det 20. århundrede har cellelinjer hjulpet med at fremme videnskaben. Cellelinjer har flere fordele; Forskellige cellelinjer kan hjælpe forskere med at studere cellebiologi, producere baculovirus til yderligere undersøgelser eller producere store mængder af et protein af interesse, for at nævne nogle få¹. Nogle yderligere anvendelser omfatter undersøgelse af vævsvækst, hjælp til at fremme vaccineudvikling, toksikologiforskning, undersøgelse af genernes rolle i sunde organismer og syge modeller og produktion af hybridcellelinjer ^2,3. Cellelinjer kan også muliggøre lægemiddelproduktion³. Korrekte aseptiske teknikker er nødvendige, når man arbejder med cellelinjer; De fremgangsmåder og teknikker, der er skitseret i dette manuskript, gælder for forskningslaboratorier, hvor cellekulturarbejde udføres. Andre laboratorieindstillinger diskuteres ikke.

Forurening er ofte den primære bekymring, når man udfører cellekulturarbejde. I forbindelse med dette papir refererer forurening generelt til svampe og bakterier. Det overordnede mål med den metode, der er skitseret i dette papir, er grundigt at beskrive de bedste fremgangsmåder for at undgå forurening. Alle laboratoriemedlemmer skal overholde denne praksis, når de arbejder i et forskningslaboratoriums cellekulturrum. Laboratorierne bør sikre, at alle arbejdstagere deltager aktivt i anvendelsen af denne bedste praksis til forebyggelse af kontaminering. Kendskabet til den korrekte praksis og teknikker vil hjælpe med at sikre, at cellekulturer forbliver levedygtige, sunde og fri for forurening. Udviklingen af denne teknik er baseret på litteraturforskning, syv års erfaring med at arbejde med cellekulturer og behovet for en metode, som både nybegyndere og erfarne cellekulturarbejdere kan henvise til årligt.

Der er behov for en klar, standardiseret teknik, som alle forskningscellekulturlaboratorier bør følge. Meget af litteraturen om cellekulturkontaminering diskuterer påvisning af mycoplasma, aseptiske teknikker, forureningskilder, eliminering af forurenende stoffer og forebyggelse ved brug af antibiotika og regelmæssig test 4,5,6,7,8. Selvom disse oplysninger er nyttige, er der ingen videoer til stede i litteraturen, der demonstrerer de korrekte cellekulturteknikker, man skal følge. Fordelen ved den praksis, der præsenteres i forhold til alternative teknikker, er et fokus på at forhindre forurening, før den sker, snarere end at opdage og rette fejl senere. Desuden er en grundig demonstration af aseptiske teknikker, en diskussion om forebyggelse af svampe og bakterievækst og information om biosikkerhedskabinettets luftstrøm værdifulde for både nybegyndere og erfarne cellekulturarbejdere.

Bakterier og svampe er de to mest almindelige typer forurenende stoffer. Inden for bakteriekategorien er mycoplasma et stort problem på grund af dets lille størrelse og evne til at sprede sig, mens det forbliver ubemærket. De er selvreplikerende organismer uden stiv cellevæg, der er afhængige af eukaryote celler for at vokse. De har reducerede metaboliske evner og kan formere sig meget, mens de forbliver ukendte i den rutinemæssige visuelle inspektion af cellekulturer og regelmæssig mikroskopisk analyse, selvom transmissionselektronmikroskopi kan detektere mycoplasma ^9,10. Desuden kan de passere gennem mikrobiologiske filtre¹⁰. Cellekulturmedium giver mycoplasma næringsstoffer, selvom supplering af medier med antibiotika desværre ikke påvirker mycoplasma¹⁰. Man skal bemærke, at det generelt ikke er nødvendigt at supplere medier med antibiotika; Korrekte teknikker bør være tilstrækkelige til at holde forureningen i skak. Infektion med mycoplasma fører ikke til øjeblikkelig celledød, men det er bekymrende for forskere, da det påvirker datareproducerbarhed og kvalitet.

Alt laboratoriepersonale bør nøje overholde god cellekulturpraksis. Kulturer bør testes for mycoplasma, efter at de er blevet nykøbt, mens de dyrkes i øjeblikket, før kryopræservering, og når de optøes fra flydende nitrogen ^2,10. Forskellige tests er tilgængelige på markedet ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR), enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) eller immunfarvning. ³ Litteraturen indikerer, at "humane isolater udgør en stor procentdel af de mycoplasma-kontaminanter, der findes i cellekultur"⁵. Selvom mere end 200 mycoplasmaarter er blevet beskrevet, tegner omkring seks af disse sig for de fleste infektioner. Disse seks arter er M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale og Acholeplasma laidlawii¹⁰. Som med andre former for forurening bringer luft og aerosoler disse ind i cellekulturer⁵. Dette gentages i andre artikler, da "den menneskelige operatør potentielt er den største fare i laboratoriet"⁷. Selvom dette gøres gennem menneskelige fejl, kan risikoen elimineres, hvis en standardprocedure følges. Afgivelse fra personale er ikke begrænset til kun mycoplasmakontaminering; Cellekulturer i et laboratorium er normalt inficeret med de samme mycoplasmaarter, hvilket indikerer, at forurening spredes fra en kolbe til en anden på grund af ukorrekte cellekulturteknikker¹⁰.

Forebyggelse af krydskontaminering er også en anden grund til, at korrekte cellekulturteknikker skal følges. Det bemærkes, at mindst 15%-18% af cellelinjer på verdensplan kan være krydskontaminerede eller fejlidentificerede^11,12. Ud over at teste cellelinjer for mycoplasmakontaminering bør de også testes for krydskontaminering¹⁰. For humane cellelinjer er cellelinjegodkendelse ved hjælp af en billig DNA-baseret teknik kaldet kort tandemgentagelse (STR) profilering den nuværende internationale referencestandard, da det er en nem måde at bekræfte cellelinjeidentitet 2,10,13,14. STR kan identificere fejlmærkede eller krydskontaminerede cellelinjer, men det kan ikke detektere forkert vævsoprindelse^10,13,14. Gyldigheden af forskningsdata kan kompromitteres, hvis cellelinjer er forkert mærket, forkert identificeret eller forurenet¹³. I lighed med andre typer kontaminering kan krydskontaminering forekomme på grund af dårlig teknik, der får aerosoler til at sprede sig, forkert kontakt, der fører til, at den forkerte celletype kommer ind i en kolbe eller bruger den samme medieflaske og reagenser med forskellige cellelinjer¹⁰. Der bør ikke deles medieflasker; Deling af en flaske medier mellem to forskellige cellelinjer kan gøre det muligt at blande disse cellepopulationer, hvilket fører til, at den hurtigere voksende celletype helt overtager kolben. Denne udskiftning er ikke mærkbar og fører til fejlmærkning og fejlidentifikation². En cellelinje kan også forveksles med en anden, hvis kulturer er forvirrede under håndtering eller mærkning¹⁰. Der skal lægges stor vægt på at holde reagenser, medier og kolber adskilt fra hinanden. Hvert laboratoriemedlem skal have deres egne medieflasker; Der bør ikke ske deling mellem laboratoriemedlemmer. Cellelinjer selv bør købes fra en kvalificeret cellebank og udbyder. Laboratorier bør ikke dele celler. Undersøgelser viser, at selvom STR- og mycoplasma-test regelmæssigt anvendes, har mange forskningsartikler i litteraturen allerede brugt fejlidentificerede eller forurenede cellelinjer¹⁵. Sigtning gennem forskningen for at finde disse problematiske papirer og med tilbagevirkende kraft informere læserne om denne sag er besværlig. Forebyggelse er den bedste måde at sikre, at dette problem ikke opstår i første omgang.

Den enkle handling at sprøjte genstande med 70% EtOH kan dræbe organismer; 70% EtOH virker ved at denaturere proteiner og opløse lipider i de mest almindeligt forurenende organismer, herunder bakterier og svampe¹⁶. Undersøgelser har vist, at 70% er den mest effektive koncentration; overfladeproteiner koagulerer ikke hurtigt med 70% EtOH, så de kan komme ind i cellen, mens vandet, det indeholder, er nødvendigt for denatureringsprocessen af proteiner. På grund af koncentrationsforskellen mellem vand og alkohol på hver side af cellevæggen kommer 70% EtOH ind i cellen for at denaturere både enzymatiske og strukturelle proteiner. Hvis der observeres skimmelvækst i kolber, skal hele inkubatoren dekontamineres ved først at sprøjte den med 70% EtOH og tørre den tør efterfulgt af en 16 timers inkubation natten over ved 60 °C¹⁷. Dette dræber de fleste skimmel og eventuelle bakterier.

Den største fordel ved forebyggelsespraksis i forhold til alternative teknikker til eliminering af kontaminering, efter at den er opstået, er, at laboratoriearbejdere ved at forhindre kontaminering tidligt kan være sikre på, at deres cellekulturer er sunde, og at der ikke vil være høje omkostninger forbundet med dekontaminering af inkubatorer eller kassering af cellekulturer. Eliminering af mycoplasma-kontaminanter efter f.eks. er ikke effektiv⁷. At tage sig tid tidligt til at sikre, at laboratoriepersonalet er ordentligt uddannet, cellekulturrummet er selvstændigt, og der anvendes en standardprocedure, sparer tid og penge.

Protocol

1. Forberedelser

1. Generel
   1. Brug en ren laboratoriefrakke, der kun er beregnet til at blive båret i cellekulturrummet og ingen andre dele af laboratoriet.
      BEMÆRK: Labcoaten behøver ikke at være steril.
   2. Brug nye handsker, der ikke har rørt andre overflader. Sørg for, at handskerne sidder tæt. Nitril, pulverfri handsker er bedst.
      BEMÆRK: Handskerne behøver ikke at være sterile.
   3. For at forberede dig på arbejde skal du sprøjte handskerne, laboratoriefrakkeærmerne og indersiden af det biologiske sikkerhedsskab med 70% EtOH. Tør arbejdsfladen og glaspanelet af med et fnugfrit køkkenrulle.
      BEMÆRK: Brug af 70% EtOH dræber bakterier med den højeste effektivitet¹⁶. Papirhåndklædet behøver ikke at være sterilt.
   4. Hold vandbade inde i cellekulturrummet og brug kun disse til opvarmning af kulturmedier eller optøning af celler. Tøm og vask vandbadene en gang om ugen efter producentens anvisninger til rengøring.
2. Inde i det biologiske sikkerhedsskab
   1. Begræns antallet af genstande, der bringes ind i kabinettet. Afbryd ikke luftstrømmen inde i det biologiske sikkerhedsskab ved at blokere front- eller baggitteret.
      BEMÆRK: Se figur 1 for en forklaring på, hvordan luft strømmer ind i et skab.
   2. Sprøjt alle genstande, der er placeret inde i skabet, med 70% EtOH og tør dem tørre. Begynd med at sprøjte toppen af medieflasken og arbejd ned. På samme måde skal du tørre det tørt med et rent papirhåndklæde og gradvist arbejde vejen til bunden. Gå ikke tilbage op mod hætten.
   3. Hvis kabinettet er stort nok til at rumme serologiske pipetter, kan de placeres indeni, ellers kan de opbevares i en beholder monteret på ydersiden af kabinettet. Kontroller begge sider af den indkapslede pipette for huller, revner eller punkteringer i emballagen før brug. Riv ikke indpakningen af. Skræl i stedet forsigtigt enderne af indpakningen, indsæt den serologiske pipette i et pipettehjælpemiddel, og fjern indpakningen i en flydende bevægelse.
   4. Hold ikke markøren over åbne flasker eller kolber; Ræk over åbne flasker eller kolber eller åbne genstande over toppen af allerede åbnede genstande i det biologiske sikkerhedsskab.
      BEMÆRK: Luftstrømmen inde i kabinettet skubber ned på arbejdsfladen, så enhver forurening, der er til stede på ærmet, kan for eksempel komme ind i cellekulturerne.
   5. Hæld ikke væsker. Tilføj dem i stedet ved hjælp af en serologisk pipette. Efter supplering af mediet blandes indholdet grundigt og initialiseres flasken. Sørg også for at inkludere en etiket for, hvad mediet blev suppleret med.

2. Arbejde med klæbende cellelinjer

1. Hvis der er behov for en plastikkolbe, skal du sprøjte hele posen og placere den inde i skabet.
2. Brug autoklaverede glaspipetter eller sterile engangsplastpipetter til at opsuge mediet eller vaskeopløsningerne. Fjern forsigtigt metalhætten fra opbevaringsbeholderen. Isoler en glaspipette ved forsigtigt at ryste beholderen skråt. Når du når ind i beholderen, skal du undgå at røre ved andre pipetter.
   BEMÆRK: Håndter kun den valgte pipette fra den ene ende.
3. Sæt hurtigt hætterne på flaskerne på igen så hurtigt som muligt. Placer hætterne på arbejdsfladen på hovedet, så fælgen ikke berører arbejdsfladen. Tag ikke hætten fra toppen eller bunden; Rør i stedet hætterne fra siderne.
4. Når du aspirerer væsker, skal du bruge en vakuumfældekolbe placeret uden for skabet i en sekundær beholder på gulvet.
   BEMÆRK: Smid ikke flydende affald i biofarlige affaldsposer, da poserne lækker. Affald vil blive skabt, mens du arbejder inde i kabinettet. Hvis du flytter hænder ind og ud af kabinettet for ofte, afbrydes luftstrømmen. Efterlad midlertidigt affald inde i skabet. Placer den ud til siden, så den ikke afbryder arbejdet.
5. Sprøjt generøst handskerne med 70% EtOH, hver gang de bliver tørre. Gnid hænderne sammen, så handskerne ikke drypper våde.
6. Hvis en serologisk pipette fejlagtigt rører noget i kabinettet, tøv ikke med at smide det ud. Start forfra med en ren serologisk pipette i stedet for at bruge en, der kan være forurenet.

4. Kontrol og opbevaring af celler

1. Før du placerer celler i inkubatoren, skal du kontrollere, hvordan de ser ud under mikroskopet. Hvis cellerne er blevet grundigt suspenderet, skal enkeltceller observeres.
2. Du må ikke tale, nyse, hoste eller trække vejret tungt ind i inkubatorerne. Åbn og luk hurtigt inkubatordørene. Hvis dørene står åbne længere end nødvendigt, kan det tillade forurenende stoffer i luften at trænge ind i inkubatorerne.
   BEMÆRK: Brug af en maske, mens du arbejder i cellekulturrummet, kan hjælpe, da mycoplasma kan være til stede i munden. Undgå brug af mobiltelefoner i cellekulturrummet, da det ikke anbefales at tale.
3. Sørg for, at hætterne på alle flaskerne er tæt lukket, før du tager flaskerne ud af skabet.
4. Opbevar cellekulturmedier mørkt ved 4 °C, når de ikke er i brug, da de er lysfølsomme.
5. Sprøjt det indre af kabinettet med 70% EtOH igen, når cellekulturarbejdet er afsluttet, og tør overfladen tør af med et køkkenrulle. Tøm de biohazard affaldsposer. Gentag denne proces, og udskift handskerne, når du skifter til en anden cellelinje.

5. Arbejde med suspensionscellelinjer

1. For ophængningsceller dyrket i glaskolber skal du sørge for, at handskerne sprøjtes grundigt med 70% EtOH, derefter røre aluminiumsfolien med de våde handsker og kun sprøjte bunden af kolben, før du placerer den inde i skabet.
2. Når du tager en prøve til celletælling, skal du kun fjerne et 1,5 ml rør fra beholderen. Rør ikke ved andre rør. Placer hætten på hovedet på arbejdsfladen. Rør ikke ved den indvendige kant. Håndter det forsigtigt fra siderne, og udskift det, når det er færdigt.
3. Fjern forsigtigt det dobbeltfoldede stykke aluminiumsfolie, der dækker hele kolbens hals. Håndter kun glaskolben fra bunden - rør den ikke fra halsen - når folien er af. Brug en 1 ml serologisk pipette til at tage en prøve til celletælling.
4. Lad ikke medier dryppe ned ad kolbernes side; hvis det gør det, spray et køkkenrulle med 70% EtOH og rengør det med det samme.
5. Sørg for, at hætter og aluminiumsfolie strammes, før du fjerner flasker eller kolber fra de biologiske sikkerhedsskabe.

6. Celle inkubation

1. Brug separate inkubatorer til forskellige celletyper for at forhindre krydskontaminering af de forskellige celletyper.

7. Indsamling af flydende affald

1. Opsaml flydende affald i en vakuumfældekolbe, der er placeret uden for skabet på gulvet i en sekundær beholder mærket 'Affald'.
   BEMÆRK: Slangen er tilsluttet et højeffektivt partikelabsorberende filter (HEPA), som udskiftes månedligt.

8. Oprydning

1. Fjern posen med biofarligt affald, og vask glaskolberne så hurtigt som muligt. Opbevar en glasvaskeprotokol ved vasken. Se supplerende fil 1 for vaskeprotokollen.
2. Autoklave cellekulturglasvarer i stedet for at sende det til et glasvaskeanlæg. Hold det adskilt fra glasvarer i laboratoriets hovedområde.
   BEMÆRK: SF-9-celler efterlader en kant af døde celler på siden af kolber, hvis glasset ikke skrubbes godt. Se Supplerende fil 1 for autoklaveprotokollen.

9. Organisation

1. Organiser cellekulturrummet, så alle forsyninger er placeret i et område, hvorved behovet for laboratoriemedlemmer minimeres for at forlade rummet på jagt efter forsyninger.
2. Mærk alle plastflasker, der bruges til at høste celler og genbruges i cellekultur bagefter som 'Kun til cellekulturbrug'. Brug de udpegede cellekulturflasker til en bestemt celletype. Opbevar flaskerne i cellekulturrummet for nem adgang.

10. Identifikation af bakterier, svampe og mycoplasmaforurening

BEMÆRK: Hvis du ikke følger arbejdsgangen ovenfor, kan det føre til bakterie-, svampe- og mycoplasmaforurening.

1. Før arbejdet påbegyndes, skal du altid observere kolber for tung turbiditet, ekstra vækst i form af fuzzy bolde og tætte akkumuleringer af celler på siden, som alle er indikatorer for forurening.
   BEMÆRK: Et erfarent øje kan se forskel på turbiditet forårsaget af mikrobiel kontaminering versus de faktiske celler. Mens celler får det normalt klare medie til at virke uklart, forårsager bakteriel forurening tung turbiditet med hvid farve.
   1. Identificer visuelt skimmelforurening ved at bemærke udseendet af runde, fuzzy bolde, der flyder i medierne (se figur 2).
   2. Identificer bakteriel kontaminering visuelt, hvis mediet er uklart, hvidt eller turbulent (se figur 2).
   3. Identificer mycoplasmakontaminering ved at lave en månedlig mycoplasma-test. En PCR-baseret test instruerer brugerne i at tage en 1,5 ml prøve af celler, udføre en celletælling ved hjælp af 10 μL, fortyndes til 0,08 x 10⁶ celler / ml, dreje cellerne ned, lyse cellerne ved hjælp af bufferen indeholdt i sættet og dreje ned en sidste gang. Supernatanten inkuberes med primere, der forstærker en række mycoplasmaarter. Kør en DNA-gel for at visualisere båndene. Ingen bånd betyder, at mycoplasma ikke er identificeret.
      BEMÆRK: Dette store forurenende stof kan være til stede i den menneskelige mund. Det er god praksis at teste for mycoplasmakontaminering i celler efter optøning af dem, og før de bruges til forsøg. Derefter overvåges cellerne for mycoplasma-kontaminering en gang om måneden. Mange virksomheder tilbyder mycoplasma testkits. Vælg en, der passer.

Representative Results

Hvis de korrekte cellekulturteknikker og -praksis, der er skitseret i dette papir, ikke følges, kan forurening med svampe og bakterier forekomme i forskningscellekulturlaboratoriet. Figur 2 viser kolber, der indeholder kontaminering i både suspensionskulturen og den vedhængende kultur.

Når man ikke følger aseptiske teknikker, kan skimmelforurening forekomme 2-3 dage senere. Runde fuzzy bolde, der flyder i medierne, er mærkbare i suspensionsceller, mens skimmelvækst i vedhæftede celler kan observeres som store, uregelmæssige, hvide eller grønne pletter.

For bakterier observeres forurening den følgende dag. Medierne er turbulente, hvide og overskyede. Den hvide farve er typisk for bakterieceller, som formerer sig meget hurtigere end cellelinjer. Et erfarent øje er i stand til at skelne mellem ikke-forurenede medier og forurenede medier. For vedhæftede celler kan man sammenligne en flaske uåbnede medier med en kolbe for at kontrollere, om der ses turbulens i kolben.

Inde i det biologiske sikkerhedsskab skal antallet af genstande holdes på et minimum. Undgå at placere genstande på bagsiden og frontgitteret (se figur 3). I dette skab er der et sæt pipetter, spidser, autoklaverede glaspipetter, et pipettehjælpemiddel og markører indeni. Arbejdsområdet i midten er klart. Det er en god idé at holde skabe organiseret på denne måde. Derudover skal operatøren bære en ren laboratoriefrakke og handsker, inden arbejdet påbegyndes. En sprayflaske med 70% EtOH bør opbevares i nærheden, så operatøren ofte kan sprøjte sine handsker. Huden er dækket af handsker eller en laboratoriefrakke. Operatøren skal justere sin stol, så armene er i en vinkel på 90°, når de arbejder inde i skabet, og genstande skal være inden for rækkevidde inde i skabet (se figur 4).

Mange arter af mycoplasma kan identificeres pålideligt ved hjælp af et PCR-baseret assay. Figur 5 viser resultaterne af en negativ mycoplasmatest. Båndet til venstre viser molekylvægtstandarderne for DNA. De fire bånd til højre er positive kontroller. Der vises ingen bånd under de testede celletyper, fordi mycoplasma ikke blev påvist.

Hvis mediet indeholder pH-indikatorer, vil det være rødt for den optimale pH-værdi af celler ved 7,4. Når cellerne vokser, skifter mediet farve fra rød til gul³. Denne farveændring kan også forekomme, hvis bakterier overtager kolben og vokser over (figur 6). Den gule farve angiver, at pH-værdien er lav. At observere en ny, uåbnet flaske medier ved siden af en kolbe er en objektiv måde at observere forurening i vedhæftede celler på. For suspensionskulturer kan brugeren nøje observere kolben for eventuelle vækster, der flyder i mediet, eller om der er en tyk ring af tilgroede bakterieceller omkring indersiden af glaskolben. For begge celletyper kan en lille prøve tages og observeres under mikroskopet. Hvis der observeres andre vækster eller celleformer, især hvis cellerne bevæger sig, er dette en indikator for forurening (figur 7). En grundig rensning af hæmocytometeret bør udføres før celletælling, da denne type affald muligvis kun er til stede på hæmocytometeret og ikke i selve cellekulturerne.

Lugten kan være en anden indikator for forurening i en inkubator. Bakteriel overvækst har en typisk lugt, som en erfaren cellekulturbruger vil bemærke. Lugten falder altid sammen med en forurenet kolbe, selvom en inficeret kolbe måske ikke altid får hele inkubatoren til at lugte.

Skimmelforurening har tendens til at være mere udbredt i HEK 293 S-celler dyrket i suspension. Bakteriel forurening er mere almindelig i SF-9-celler. Dette kan skyldes, at RIC-celler dyrkes med fugtighed, hvilket fører til fugtophobning i inkubatorerne. SF-9-celler dyrkes uden fugtighed, så miljøet er tørrere. Kontamineringshastigheden i vedhængende kulturer er mindre end kontamineringshastigheden i suspensionskulturer. Dette kan skyldes den mindre kolbestørrelse, kolbens ikke-genanvendelige karakter eller den ventilerede hætte i stedet for brugen af aluminiumsfolie.

Mycoplasma kan ikke observeres med det blotte øje eller med et almindeligt lysmikroskop, selvom specialiseret transmissionselektronmikroskopi kan detektere mycoplasma. Et mycoplasma identifikationssæt bør anvendes til at teste cellekulturerne månedligt. Mange arter af mycoplasma kan identificeres pålideligt ved hjælp af et PCR-baseret assay. En kort beskrivelse af, hvordan denne PCR-test udføres, findes i protokolafsnittet, og mere information om mycoplasma findes i diskussionsafsnittet.

Figur 1: Hvordan luft strømmer i et biosikkerhedsskab. Biologiske sikkerhedsskabe trækker forurenet luft fra selve rummet og fra kabinettet gennem for- og baggitteret. Denne luft går under metalarbejdsfladen, mod bagsiden af kabinettet og op til toppen af enheden, hvor et HEPA-filter er placeret. Der passerer luften gennem filteret og bliver filtreret. Denne rene luft skubber ned på arbejdsfladen. På grund af hvordan strømmen af filtreret luft skubbes ned inde i kabinettet, er det god praksis ikke at svæve. For eksempel er det uønsket at have et ærme oven på en åben flaske og risikere, at potentielle forurenende stoffer skubbes ind i medierne. Antallet af genstande, der bringes ind i kabinettet, skal holdes på et minimum, og genstande bør ikke placeres på for- eller baggrillene for ikke at afbryde luftstrømmen. Hvis du bevæger armene ind og ud af kabinettet for hurtigt, kan det også forstyrre luftstrømmen. Oprettet til NuAire, Inc., af Jeff Kaphingst, Jeff the Designer, LLC. Brugt med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Ikke-forurenet suspension og klæbende celler og celler forurenet med skimmel eller bakterier. Det første billede til venstre indeholder insektceller (SF-9-celler), der ikke er forurenede. Det andet billede viser en anden kolbe af disse celler, der er forurenet med skimmel. Den tredje kolbe blev forurenet af bakterier, som det kan bemærkes af det tykke, hvide, overskyede udseende. Den anden og tredje kolbe blev forurenet, fordi ingen af de korrekte cellekulturteknikker og -praksis blev fulgt. Alle kolber blev tilberedt samme dag. Vækst blev observeret den næste dag for bakteriel forurening og 2 dage senere for skimmelforurening. Ikke-forurenede klæbende celler vises (Hek293-celler) sammen med skimmel- og bakteriel forurening i klæbende kulturer. Skimmelforurening er vist i anden linje i en rund petriskål. Billedet er taget fra toppen af skålen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Cellekulturkabinets organisation. Inde i det biologiske sikkerhedsskab skal mængden af genstande holdes på et minimum. Placering af genstande på bagsiden og frontgitteret bør undgås. I dette skab er der et sæt pipetter, spidser, autoklaverede glaspipetter, et pipettehjælpemiddel og markører indeni. Arbejdsområdet i midten er klart. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Den korrekte måde for en operatør at arbejde under flowemhætten. En operatør skal bære en ren laboratoriefrakke og handsker, inden arbejdet påbegyndes. En sprayflaske med 70% EtOH bør opbevares i nærheden, så operatøren ofte kan sprøjte sine handsker. Huden er dækket af handskerne eller laboratoriefrakken. Operatøren skal justere sin stol, så armene er i en vinkel på 90°, når de arbejder inde i skabet. Genstande skal være inden for rækkevidde inde i kabinettet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Et negativt mycoplasma testresultat. Mange arter af mycoplasma kan identificeres pålideligt ved hjælp af et PCR-baseret assay. Båndet til venstre viser molekylvægtstandarderne for DNA. De fire bånd til højre er positive kontroller. Der vises ingen bånd under de testede celletyper, fordi mycoplasma ikke blev påvist. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Normal mediefarve ændres fra rød til gul. Cellekulturmedier ændrer farven fra rød til gul, hvis pH-indikatorer er til stede. Den gule farve angiver, at pH-værdien er lav, og mediet skal udskiftes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Forurenende stoffer observeret under lysmikroskopet. Hvis andre vækster eller celleformer observeres under lysmikroskopet, mens der udføres celletællinger, kan dette være en indikator for forurening. Det skal bemærkes, at en grundig rensning af hæmocytometeret skal udføres før celletælling, da denne type affald kun kan være til stede på hæmocytometeret og ikke i selve cellekulturerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Tillæg Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Mens forurening er en af de primære bekymringer, når man udfører cellekulturarbejde, vil den praksis og de teknikker, der er skitseret i dette manuskript, hjælpe med at afbøde risiciene. De kritiske trin inkluderer at bære en ren laboratoriefrakke, som kun bruges i cellekulturrummet, ved hjælp af rene, pulverfrie handsker, der ofte sprøjtes med 70% EtOH, og som skiftes, når der skiftes mellem cellelinjer, opfordrer hver enkelt person til ikke at dele medieflasker, rengør kabinettet grundigt før og efter afslutningen af arbejdet, Udpakning af serologiske pipetter pænt, undgå langvarig tæt kontakt med åbne flasker eller kolber, ikke at dele medieflasker mellem flere cellelinjer og hurtigt åbne og lukke inkubatordøre. Derudover sikrer vask og autoklavering af ens egne glasvarer kvalitetskontrol, hvilket reducerer sandsynligheden for at indføre eksterne forurenende stoffer. Kvalitetskontrolmetoder omfatter brug af autoklavetape til at angive, om sterilisatoren har nået den korrekte temperatur på 121 °C, regelmæssig forebyggende vedligeholdelse af udstyret og visuel inspektion af kolben for at sikre, at den er blevet skrubbet korrekt¹⁸. Et andet vigtigt punkt er at bruge separate inkubatorer til forskellige celletyper for at sikre, at kontaminering fra en celletype ikke overføres til andre, og for også at sikre, at krydskontaminering med celler ikke forekommer.

Bakterie- og svampeinfektioner er de to mest almindelige ubudne gæster i cellekulturer. Et af de største forurenende stoffer, M. orale, er den mest almindelige mycoplasmaart i menneskets mund og repræsenterer også "det mest almindelige isolat, der tegner sig for 20%-40% af alle mycoplasmainfektioner i cellekulturer"⁴. Med andre ord er laboratoriepersonale den største kilde til denne forurening. Det er altid et problem i cellekulturrummet, da mycoplasma er en lille, langsomt voksende mikroorganisme, der mangler en stiv cellevæg, der kan passere gennem 0,45 μm filtre⁴. Undersøgelser viser, at forekomsten af mycoplasmakontaminering er 15%-35% af kontinuerlige humane eller animalske cellelinjer⁴. Desuden viser statistikker, at omkring 5% til 30% af verdens cellelinjer er forurenet med mycoplasmer⁶. Desværre er mycoplasma resistent over for de fleste antibiotika, der anvendes til cellekultur, og infektion kan påvirke cellefysiologi og metabolisme ^4,6. Selv om kontaminering ikke bremser cellemetabolismen, kan den forurene slutproduktet⁶. Infektioner kan holde fast uden laboratoriemedlemmer bemærker celleskader. Hvis der sker forurening, er omkostningerne ved optøning af nye celler, den tid, der bruges på at formere de nye kulturer, de dyre medier, der er gået til spilde, dekontaminering af inkubatorer og den tid, kolleger bruger på at vente på at begynde deres eksperimenter igen, enorme. Vores laboratorium estimerer den samlede tabte tid tegner sig for 2 uger, og de samlede omkostninger forbundet med forurening af et typisk humant pattedyrcelleproteinekspression på 8 L er $ 1.400. De fremgangsmåder og teknikker, der er skitseret i dette manuskript, tilbyder gode forebyggende foranstaltninger til at afbøde yderligere omkostninger, tabte celler og nedetid.

Det anbefales ikke at ændre denne praksis. Alle laboratoriemedlemmer skal trænes, inden de arbejder i cellekulturrummet og derefter modtage genopfriskningstræning hvert år⁷. Labmedlemmer bør også organisere cellekulturrummet, så alle nødvendige forsyninger er i et område og derved minimere behovet for, at laboratoriemedlemmer forlader cellekulturrummet på jagt efter forsyninger.

Begrænsninger af de præsenterede teknikker observeres, hvis forurening kommer fra eksterne kilder såsom serum, inkubatorer, funktionsdygtige autoklaver, beskidte laboratoriefrakker eller kilden til cellerne. Fejlfinding af teknikken kan være nødvendig, hvis kontaminering opstår på trods af streng overholdelse af denne protokol. Mange eksterne faktorer kan bidrage til denne type forurening. Labmedlemmer skal være forsigtige og kontrollere eksterne kilder. For eksempel kan partiet af føtalt bovin serum (FBS) købt fra leverandøren være blevet forurenet med mycoplasma. Sammenlignet med 1950'erne er dette nu en sjælden forekomst, men det kan stadig ske⁶. Alle medieflasker skal smides ud, hvis der opdages forurening, og protokollen genstartes ved at tø nye celler op og bruge nye medier. Forureningen kan allerede have været til stede inde i inkubatoren, hvis det er skimmel eller bakterier; De andre kolber inde i samme inkubator skal kontrolleres for at se, om bakteriel eller skimmelvækst observeres. Alle de forurenede kolber skal smides ud og inkubatoren dekontamineres. Hvis der ikke findes nogen forurening, skal autoklaven kontrolleres for funktionsfejl; Glasvarerne er muligvis ikke blevet autoklaveret korrekt i første omgang. Autoklavetapen kan skifte farve, selv om autoklaven ikke når 121 °C. Derefter skal udløbsdatoer på de anvendte antibiotikaopløsninger kontrolleres; Det kan være nødvendigt at købe nye løsninger. Endelig bør kilden til cellerne overvejes; Var de fra en betroet laboratorieleverandør eller lånt fra et andet laboratorium? Celler bør altid købes fra en betroet laboratorieleverandør og bør aldrig lånes fra et andet laboratorium. Endelig bør laboratoriefrakker vaskes for at sikre deres renlighed¹⁹. Dekontaminering af inkubatorer bør overvejes, når en kolbe er blevet kontamineret. Bakterieceller eller skimmelsporer må ikke få lov til at formere sig og fortsætte med at sprede forurening.

Eksisterende metoder afspejler eliminering af kontaminering. De metoder, der er skitseret i dette manuskript, fokuserer på forebyggelse snarere end eliminering af forurening. Der findes flere procedurer vedrørende brug af antibiotika til fjernelse af mycoplasma²⁰. Det er imidlertid risikabelt at anvende antibiotika, da de måske ikke helt fjerner infektionen og "kan tillade resistente organismer at udvikle sig"¹². Faktisk viste "72% af kulturer dyrket kontinuerligt i antibiotika sig at være mycoplasma-positive, mens kun 7% dyrket i fravær af antibiotika blev inficeret"¹². Disse data understreger ideen om, at mens brugen af antibiotika anbefales og kan være nyttig, er overforbrug eller fuldstændig afhængighed af antibiotika ikke gavnligt. Desuden kan brug af antibiotika til at fjerne forurening kun tillade problemet at fortsætte. Antibiotikaopløsninger er ikke nødvendige; Hvis teknikkerne i dette papir følges, bør kontaminering forhindres med succes.

De fremgangsmåder og teknikker, der er skitseret i dette manuskript, kan bruges i fremtiden til at opretholde et aseptisk miljø, når man udfører den månedlige mycoplasma-test og ved fremstilling af hjemmelavede kompetente bakterieceller. Begge protokoller kræver et rent miljø, der ligner cellekulturarbejde, så slutproduktet ikke er forurenet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques