Detecção e quantificação de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) em plasma humano usando um ensaio imunoenzimático modificado

Pavan S. Krishnan; Fernando T. Zamuner; Carolyn M. Jenks; Johnny Y. Xie; Lisa Zhang; Mohammed Lehar; Neal S. Fedarko; Mariana Brait; John P. Carey

doi:10.3791/64775

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Artigo de método

Detecção e quantificação de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) em plasma humano usando um ensaio imunoenzimático modificado

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DOI:

10.3791/64775

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16 de junho de 2023

Pavan S. Krishnan¹^,² , Fernando T. Zamuner¹^,³ , Carolyn M. Jenks¹ , Johnny Y. Xie⁴ , Lisa Zhang⁵ , Mohammed Lehar¹ , Neal S. Fedarko⁶ , Mariana Brait¹^,³ , John P. Carey¹

¹Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Virginia Commonwealth University School of Medicine, ³Department of Oncology, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁴Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Michigan Medical School, ⁵Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, The Ohio State University College of Medicine, ⁶ICTR Clinical Research Core Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Os dados publicados relativos às concentrações de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) no plasma humano são inconsistentes. Essas inconsistências podem ser devidas à falta de uma metodologia padronizada e validada para quantificar esse neuropeptídeo. Aqui, descrevemos um protocolo validado de ensaio imunoenzimático (ELISA) para purificar e quantificar CGRP em plasma humano.

Resumo

O peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) é um neuropeptídeo vasoativo que desempenha um papel putativo na fisiopatologia das enxaquecas e pode ser um candidato ao status de biomarcador. A CGRP é liberada das fibras neuronais após a ativação e induz inflamação neurogênica estéril e vasodilatação arterial na vasculatura que recebe inervação eferente do trigêmeo. A presença de CGRP na vasculatura periférica tem estimulado investigações para detectar e quantificar esse neuropeptídeo no plasma humano usando ensaios proteômicos, como o ensaio imunoenzimático (ELISA). No entanto, sua meia-vida de 6,9 min e a variabilidade nos detalhes técnicos dos protocolos de ensaio, que muitas vezes não são totalmente descritos, têm gerado dados inconsistentes de ELISA CGRP na literatura. Aqui, um protocolo ELISA modificado para purificação e quantificação de CGRP em plasma humano é apresentado. As etapas processuais envolvem coleta e preparação da amostra, extração usando um sorvente polar como meio de purificação, etapas adicionais para bloquear a ligação não específica e quantificação via ELISA. Além disso, o protocolo foi validado com experimentos de spike e recuperação e linearidade de diluição. Este protocolo validado pode, teoricamente, ser usado para quantificar as concentrações de CGRP no plasma de indivíduos não apenas com enxaqueca, mas também com outras doenças nas quais a CGRP pode desempenhar um papel.

Introdução

O peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) é um neuropeptídeo de 37 aminoácidos que está presente em fibras neuronais com localização perivascular, bem como em tecidos não neuronais. As duas formas de CGRP, α- e β-CGRP, compartilham mais de 90% de homologia e compartilham funções fisiológicas; entretanto, o αCGRP é encontrado no sistema nervoso central e periférico, enquanto o βCGRP é encontrado no sistema nervoso entérico ^1,2. Após a ativação do nociceptor e exocitose cálcio-dependente, a CGRP é liberada dos neurônios, induzindo inflamação neurogênica estéril envolvendo vasodilatação arterial e extr....