Apresentamos aqui um protocolo para iniciar, manter e analisar culturas de células-tronco hematopoéticas de camundongos usando expansão ex vivo à base de álcool polivinílico, bem como métodos para manipulá-las geneticamente por transdução lentiviral e eletroporação.
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Artigo de método
Ex Vivo Expansão e Manipulação Genética de Células-Tronco Hematopoéticas de Camundongos em Culturas à Base de Álcool Polivinílico
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Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco hematopoéticas (CTHs) multipotentes auto-renovadoras são um tipo celular importante devido à sua capacidade de suportar a hematopoiese ao longo da vida e reconstituir todo o sistema sanguíneo após o transplante. As CTHs são usadas clinicamente em terapias de transplante de células-tronco, que representam tratamento curativo para uma série de doenças do sangue. Há um interesse substancial tanto na compreensão dos mecanismos que regulam a atividade da TH e da hematopoiese, quanto no desenvolvimento de novas terapias baseadas em HSC. No entanto, o cultivo estável e a expansão de CTHs ex vivo têm sido uma grande barreira no estudo dessas células-tronco em um sistema ex vivo tratável. Recentemente, desenvolvemos um sistema de cultura à base de álcool polivinílico que pode apoiar a expansão a longo prazo e em larga escala de HSCs transplantáveis de camundongos e métodos para editá-los geneticamente. Este protocolo descreve métodos para cultura e manipulação genética de HSCs de camundongos via eletroporação e transdução lentiviral. Espera-se que este protocolo seja útil para uma ampla gama de hematologistas experimentais interessados em biologia da CAR e hematopoese.
Introdução
O sistema hematopoiético suporta uma série de processos essenciais em mamíferos, desde o fornecimento de oxigênio até o combate a patógenos, passando por tipos especializados de células sanguíneas e imunológicas. A produção contínua de sangue (hematopoiese) é necessária para dar suporte à homeostase do sistema sanguíneo, que é sustentada por células-tronco hematopoéticas e células progenitoras (HSPCs)1. A célula hematopoética mais primitiva é a célula-tronco hematopoética (CTH), que possui capacidades únicas de auto-renovação e diferenciação de multilinhagens2,3. Esta é uma população ce....
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Protocolo
Todos os procedimentos com animais, incluindo a criação e a eutanásia, devem ser realizados dentro das diretrizes institucionais e nacionais. Os experimentos detalhados abaixo foram aprovados pelo Ministério do Interior do Reino Unido. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.
1. Preparação de soluções de estoque
- Solução de estoque PVA
- Tomar 50 mL de água de qualidade para cultura de tecidos em uma pequena garrafa de vidro (adequada para autoclavagem). Aqueça a água até quase ferver no micro-ondas.
- ....
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Resultados
Para a purificação FACS de HSCs, esperamos que, dentro da medula óssea enriquecida com c-Kit, ~0,2% das células sejam a população CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- para camundongos jovens (8-12 semanas de idade) C57BL/6 (Figura 1). No entanto, é provável que camundongos transgênicos ou de diferentes idades apresentem diferentes frequências de HSC. Após 4 semanas de cultura, esperamos que a fração CD201+CD150+c-Kit+
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Discussão
Esperamos que este protocolo forneça uma abordagem útil para investigar a biologia da THS, hematopoese e hematologia de forma mais geral. Desde o desenvolvimento inicial do método de cultura à base de PVA para HSCs purificadas porFACS8, o método tem sido ampliado. Por exemplo, foi demonstrado que o método funciona com c-Kit enriquecido com medula óssea e com placas carregadas superficialmentenegativas14. Sua compatibilidade com transdução e eletroporação também foi demonstr.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos ao WIMM Flow Cytometry Core pelo acesso à citometria de fluxo e ao WIMM Virus Screening Core pela geração do vetor lentiviral. Este trabalho foi financiado pelo Kay Kendall Leukaemia Fund e pelo UK Medical Research Council.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Dissection Kit | Fisher Scientific | ||
| Appleton Woods Ltd | HC002 | ||
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| pilão e almofariz | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separador | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL seringa | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G agulha | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μ filtro de células m | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μ filtro de células m | Corning | 431751 | |
| Kimtech toalhetes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS coluna | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μ g | IDT | ||
| Fator de células-tronco de camundongo recombinante livre de animais | Peprotech | AF-250-03 | |
| Trombopoetina de camundongo recombinante livre de animais | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotina (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotina (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotina (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotina (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotina (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotina (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| placas CellBIND, placas CellBIND de 24 poços | Corning | 3337 | com carga negativa de superfície |
| , 96 poços | Corning | 3330 | superfície negativa carregada |
| SgRNA sintético personalizado | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Pedido | |
| Soro bovino fetal | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Placas revestidas com fibronectina, 96 poços | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulina-Transferrina-Selênio-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Solução salina tamponada com fosfato | Alfa Aesar | J61196. | |
| Álcool polivinílico | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Iodeto de propídio | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Estreptacidina APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Tü rks ' solução | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
Referências
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
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Reimpressões e permissões
