Circuitos genéticos complexos são demorados para projetar, testar e otimizar. Para facilitar esse processo, células de mamíferos são transfectadas de forma a permitir o teste de múltiplas estequiometrias de componentes do circuito em um único poço. Este protocolo descreve as etapas para o planejamento experimental, transfecção e análise dos dados.
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Artigo de método
Rápido Desenvolvimento de Circuitos de Identificação do Estado Celular com Poli-Transfecção
Neste artigo
Resumo
Resumo
Circuitos genéticos de mamíferos têm demonstrado o potencial para detectar e tratar uma ampla gama de estados de doenças, mas a otimização dos níveis de componentes do circuito permanece desafiadora e trabalhosa. Para acelerar esse processo, nosso laboratório desenvolveu a politransfecção, uma extensão de alto rendimento da transfecção tradicional de mamíferos. Na politransfecção, cada célula da população transfectada realiza essencialmente um experimento diferente, testando o comportamento do circuito em diferentes números de cópias de DNA e permitindo que os usuários analisem um grande número de estequiometrias em uma reação de pote único. Até o momento, foram demonstradas politransfecções que otimizam as proporções de circuitos de três componentes em um único poço de células; Em princípio, o mesmo método pode ser usado para o desenvolvimento de circuitos ainda maiores. Os resultados da politransfecção podem ser facilmente aplicados para encontrar proporções ótimas de DNA para co-transfect para circuitos transientes ou para escolher níveis de expressão para componentes de circuitos para a geração de linhagens celulares estáveis.
Aqui, demonstramos o uso da politransfecção para otimizar um circuito de três componentes. O protocolo começa com princípios de planejamento experimental e explica como a politransfecção se baseia em métodos tradicionais de cotransfecção. Em seguida, a politransfecção das células é realizada e seguida por citometria de fluxo alguns dias depois. Finalmente, os dados são analisados examinando fatias dos dados de citometria de fluxo de célula única que correspondem a subconjuntos de células com determinadas razões de componentes. No laboratório, a politransfecção tem sido usada para otimizar classificadores de células, controladores de feedback e feedforward, motivos biestáveis e muito mais. Este método simples, mas poderoso, acelera os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos.
Introdução
O campo da biologia sintética de mamíferos progrediu rapidamente, desde o desenvolvimento de partes simples de sentido e resposta em linhagens celulares cultivadas até a otimização de redes complexas de genes para enfrentar desafios do mundo real em diagnóstico e terapêutica1. Esses circuitos sofisticados são capazes de detectar entradas biológicas de perfis de microRNA a citocinas e pequenas moléculas de fármacos, e implementar circuitos de processamento lógico, incluindo transistores, filtros passa-banda, chaves de alternância e osciladores. Também têm mostrado resultados promissores em modelos animais de doenças como câncer, artrite, diabete....
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Protocolo
NOTA: A Tabela 1 e a Tabela 2 servem como referências significativas para este protocolo. A Tabela 1 mostra a escala de reagentes para as reações, e a Tabela 2 mostra a aritmética da razão de DNA para um exemplo de politransfecção descrito no protocolo (metade superior) e para um possível experimento de seguimento (metade inferior).
1. Preparação das células para transfecção
- Certifique-se de que a cultura de células de rim embrionário humano (HEK293) seja 60%-80% confluente antes de iniciar o protocolo. Para isso, semeie 1 x 106 células....
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Resultados
Na Figura 1, comparamos a co-transfecção com a politransfecção. Em uma co-transfecção, todos os plasmídeos são liberados na mesma mistura de transfecção, resultando em alta correlação entre a quantidade de cada plasmídeo que uma única célula recebe (Figura 1A). Enquanto o número de plasmídeos totais entregues a cada célula varia significativamente, a fluorescência das duas proteínas repórteres nas células individuais em toda a população está bem correlacionada, .......
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Discussão
Métodos de prototipagem rápida, como CAD (computer-aided design), protoboard e impressão 3D, revolucionaram as disciplinas de engenharia mecânica, elétrica e civil. A capacidade de pesquisar rapidamente muitas soluções possíveis para um determinado desafio acelera muito o progresso em um campo. Acreditamos que a politransfecção é uma tecnologia análoga para a engenharia biológica, permitindo a prototipagem rápida de circuitos genéticos. Além disso, outras tecnologias de prototipagem rápida requerem iteração sequencial pr.......
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Divulgações
R.W. é co-fundador da Strand Therapeutics e da Replay Bio; R.W. e R.J. registraram uma patente provisória relacionada a um classificador de tipo celular.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer aos ex-membros do Weiss Lab que lideraram ou contribuíram para o desenvolvimento do método de politransfecção e sua aplicação em classificadores celulares: Jeremy Gam, Bre DiAndreth e Jin Huh; outros membros do laboratório Weiss que contribuíram para o desenvolvimento/otimização de métodos: Wenlong Xu, Lei Wang e Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard e membros do grupo, incluindo Patrick Donahue e Hailey Edelstein, por testar a politransfecção e fornecer feedback; e ao Prof. Nika Shakiba por convidar este manuscrito e fornecer feedback. Também gostaríamos de agradecer aos Institutos Nacionais de Saúde [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos cônicos Corning Falcon de 15mL | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| placa de Petri de 24 poços | Qualquer empresa de escolha | (Não pirogênica, estéril, RNase, DNase, DNA e livre de pirogênio) | |
| Albumina de soro bovino | NEB | B9000S | |
| Centrífuga | Qualquer empresa de escolha | Capaz de expor tubos Falcon de 15mL a 300 rcf | |
| Contador de Células Automatizado Countess 3 | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Pacote de software | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use a mídia correta para o seu tipo de célula |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Soro fetal bovino | Sigma Aldrich | F4135 | |
| Células HEK | ATCC | CRL-1573 | Use o tipo de célula relevante para seus experimentos. As células HEK tendem a transfectar com muita eficiência. |
| Células HeLa | ATCC | CRL-12401 | Use o tipo de célula relevante para seus experimentos. |
| Potenciador de lipofectamina 3000 e P3000 | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use o reagente correto para o seu tipo de célula; reagente de transfecção e intensificador |
| LSRFortessa citômetro de fluxo | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais Gibco | 11140050 | ||
| Tubos de Microcentrífuga, 1,5 mL | Qualquer empresa de sua escolha | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | meio de soro reduzido |
| Solução salina tamponada com fosfato | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Contas de calibração Rainbow | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Azida de sódio | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Tripsina | VWR | 25-053-CI |
Referências
- Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
- Sayeg, M. K., et al.
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Reimpressões e permissões
