Rápido Desenvolvimento de Circuitos de Identificação do Estado Celular com Poli-Transfecção

Summary

Circuitos genéticos complexos são demorados para projetar, testar e otimizar. Para facilitar esse processo, células de mamíferos são transfectadas de forma a permitir o teste de múltiplas estequiometrias de componentes do circuito em um único poço. Este protocolo descreve as etapas para o planejamento experimental, transfecção e análise dos dados.

Abstract

Circuitos genéticos de mamíferos têm demonstrado o potencial para detectar e tratar uma ampla gama de estados de doenças, mas a otimização dos níveis de componentes do circuito permanece desafiadora e trabalhosa. Para acelerar esse processo, nosso laboratório desenvolveu a politransfecção, uma extensão de alto rendimento da transfecção tradicional de mamíferos. Na politransfecção, cada célula da população transfectada realiza essencialmente um experimento diferente, testando o comportamento do circuito em diferentes números de cópias de DNA e permitindo que os usuários analisem um grande número de estequiometrias em uma reação de pote único. Até o momento, foram demonstradas politransfecções que otimizam as proporções de circuitos de três componentes em um único poço de células; Em princípio, o mesmo método pode ser usado para o desenvolvimento de circuitos ainda maiores. Os resultados da politransfecção podem ser facilmente aplicados para encontrar proporções ótimas de DNA para co-transfect para circuitos transientes ou para escolher níveis de expressão para componentes de circuitos para a geração de linhagens celulares estáveis.

Aqui, demonstramos o uso da politransfecção para otimizar um circuito de três componentes. O protocolo começa com princípios de planejamento experimental e explica como a politransfecção se baseia em métodos tradicionais de cotransfecção. Em seguida, a politransfecção das células é realizada e seguida por citometria de fluxo alguns dias depois. Finalmente, os dados são analisados examinando fatias dos dados de citometria de fluxo de célula única que correspondem a subconjuntos de células com determinadas razões de componentes. No laboratório, a politransfecção tem sido usada para otimizar classificadores de células, controladores de feedback e feedforward, motivos biestáveis e muito mais. Este método simples, mas poderoso, acelera os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos.

Introduction

O campo da biologia sintética de mamíferos progrediu rapidamente, desde o desenvolvimento de partes simples de sentido e resposta em linhagens celulares cultivadas até a otimização de redes complexas de genes para enfrentar desafios do mundo real em diagnóstico e terapêutica¹. Esses circuitos sofisticados são capazes de detectar entradas biológicas de perfis de microRNA a citocinas e pequenas moléculas de fármacos, e implementar circuitos de processamento lógico, incluindo transistores, filtros passa-banda, chaves de alternância e osciladores. Também têm mostrado resultados promissores em modelos animais de doenças como câncer, artrite, diabete....

Protocol

NOTA: A Tabela 1 e a Tabela 2 servem como referências significativas para este protocolo. A Tabela 1 mostra a escala de reagentes para as reações, e a Tabela 2 mostra a aritmética da razão de DNA para um exemplo de politransfecção descrito no protocolo (metade superior) e para um possível experimento de seguimento (metade inferior).

1. Preparação das células para transfecção

1. Certifique-se de que a cultura de células de rim embrionário humano (HEK293) seja 60%-80% confluente antes de iniciar o protocolo. Para isso, semeie 1 x 10⁶ células....

Results

Na Figura 1, comparamos a co-transfecção com a politransfecção. Em uma co-transfecção, todos os plasmídeos são liberados na mesma mistura de transfecção, resultando em alta correlação entre a quantidade de cada plasmídeo que uma única célula recebe (Figura 1A). Enquanto o número de plasmídeos totais entregues a cada célula varia significativamente, a fluorescência das duas proteínas repórteres nas células individuais em toda a população está bem correlacionada, .......

Discussion

Métodos de prototipagem rápida, como CAD (computer-aided design), protoboard e impressão 3D, revolucionaram as disciplinas de engenharia mecânica, elétrica e civil. A capacidade de pesquisar rapidamente muitas soluções possíveis para um determinado desafio acelera muito o progresso em um campo. Acreditamos que a politransfecção é uma tecnologia análoga para a engenharia biológica, permitindo a prototipagem rápida de circuitos genéticos. Além disso, outras tecnologias de prototipagem rápida requerem iteração sequencial pr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos cônicos Corning Falcon de 15mL	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
placa de Petri de 24 poços	Qualquer empresa de escolha		(Não pirogênica, estéril, RNase, DNase, DNA e livre de pirogênio)
Albumina de soro bovino	NEB	B9000S
Centrífuga	Qualquer empresa de escolha		Capaz de expor tubos Falcon de 15mL a 300 rcf
Contador de Células Automatizado Countess 3	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Pacote de software		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use a mídia correta para o seu tipo de célula
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Soro fetal bovino	Sigma Aldrich	F4135
Células HEK	ATCC	CRL-1573	Use o tipo de célula relevante para seus experimentos. As células HEK tendem a transfectar com muita eficiência.
Células HeLa	ATCC	CRL-12401	Use o tipo de célula relevante para seus experimentos.
Potenciador de lipofectamina 3000 e P3000	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use o reagente correto para o seu tipo de célula; reagente de transfecção e intensificador
LSRFortessa citômetro de fluxo	BD Biosciences	N/A
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais Gibco		11140050
Tubos de Microcentrífuga, 1,5 mL	Qualquer empresa de sua escolha
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	meio de soro reduzido
Solução salina tamponada com fosfato	ThermoFisher Scientific	70011044
Contas de calibração Rainbow	Spherotech	URCP-100-2H
Azida de sódio	Sigma Aldrich	S2002
Tripsina	VWR	25-053-CI