Um protocolo é apresentado para o isolamento e enriquecimento conveniente e de alto rendimento de tricomas glandulares e sésseis de Cannabis sativa. O protocolo é baseado em uma extração seca e não tampão de tricomas usando apenas nitrogênio líquido, gelo seco e peneiras de nylon e é adequado para extração de RNA e análise transcriptômica.
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Artigo de método
Isolamento Não Aquoso e Enriquecimento de Tricomas Glandulares e Tricomas Sésseis de Cannabis sativa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este trabalho apresenta um protocolo para o isolamento e enriquecimento conveniente e de alto rendimento de tricomas glandulares e sésseis de Cannabis sativa. As vias biossintéticas para o metabolismo de canabinóides e terpenos voláteis estão localizadas principalmente nos tricomas de Cannabis, e tricomas isolados são benéficos para a análise do transcriptoma. Os protocolos existentes de isolamento de tricomas glandulares para caracterização transcriptômica são inconvenientes e fornecem cabeças de tricomas comprometidas e uma quantidade relativamente baixa de tricomas isolados. Além disso, contam com aparelhos caros e meios de isolamento contendo inibidores de proteínas para evitar a degradação do RNA. O presente protocolo sugere a combinação de três modificações individuais para a obtenção de uma grande quantidade de tricomas glandulares e sésseis isolados de inflorescências femininas maduras e folhas leques de C. sativa , respectivamente. A primeira modificação envolve a substituição do nitrogênio líquido pelo meio de isolamento convencional para facilitar a passagem dos tricomas pelas micropeneiras. A segunda modificação envolve o uso de gelo seco para separar os tricomas da fonte vegetal. A terceira modificação envolve a passagem consecutiva do material vegetal através de cinco micropeneiras de poros decrescentes. Imagens microscópicas demonstraram a eficácia da técnica de isolamento para ambos os tipos de tricomas. Além disso, a qualidade do RNA extraído dos tricomas isolados foi adequada para análise transcriptômica a jusante.
Introdução
Tricomas glandulares são estruturas semelhantes a pelos presentes em plantas que contêm muitos metabólitos secundários1 e representam um valioso banco de novos genes biossintéticos e enzimas2. Na Cannabis, a biossíntese dos importantes metabólitos secundários, canabinóides3 e terpenos4, está localizada nos tricomas. Considerando o papel dos tricomas na determinação da qualidade da Cannabis tanto para uso medicinal quanto recreativo, o estudo da expressão gênica dos tricomas é de interesse. Para caracterizar a expressão de genes específicos de tricomas, os tricomas de interesse devem ser primeiramente isolados. Os protocolos de isolamento de tricomas foram descritos pela primeira vez em 19925, e seus desenvolvimentos mais recentes foram recentemente revisados2. Em geral, os protocolos de extração de tricomas glandulares para caracterização transcriptômica podem ser divididos em duas etapas sequenciais distintas. O primeiro passo envolve uma separação física completa dos tricomas do tecido vegetal. Essa etapa pode ser realizada utilizando-se gelo seco5, esferas de vidro com aparato comercial6,7, trituração do material vegetal contra uma peneira de malha 8 ou vórtex do tecido vegetal em tampãode isolamento9. A segunda etapa envolve uma separação mais refinada dos tricomas de interesse do resíduo vegetal microscópico e/ou outros tipos de tricomas. Esta etapa pode ser executada utilizando-se centrifugação por gradiente de densidade 8,10 ou peneiras de vários tamanhos 7,9. Devido à extrema sensibilidade do RNA nos tecidos processados aos agentes degradadores, essas duas etapas sequenciais são geralmente conduzidas no meio de isolamento gelado, muitas vezes na presença de inibidores proteicos4.
Os protocolos convencionais de isolamento de tricomas exigem, além das temperaturas geladas, grandes quantidades de meio de isolamento para garantir um procedimento de extração eficiente. A combinação desses componentes resulta em um processo de isolamento árduo e demorado que dificulta a alta taxa de transferência. A apresentação de um protocolo alternativo de isolamento de tricomas simples e fácil de usar é, portanto, provavelmente benéfica para vários aspectos associados à caracterização dos tricomas. O presente trabalho tem como objetivo oferecer um protocolo alternativo para o isolamento de tricomas capitatos glandulares caulinares e sésseis de Cannabis sativa, combinando e integrando vários elementos dos protocolos convencionais. Esses elementos incluem gelo seco5, passagem dos tricomas por várias micropeneiras com poros decrescentes 7,9 e substituição do nitrogênio líquido (NL) pelo meio de isolamento8.
A novidade do atual protocolo de isolamento de tricomas, em relação aos protocolos convencionais, apresenta-se de várias formas. Este protocolo é conveniente, pois não requer componentes perigosos. O procedimento pode ser realizado em laboratório com precauções mínimas e facilita o alto rendimento. A substituição do LN pelo meio de isolamento líquido padrão garante a integridade dos tricomas durante todo o processo de isolamento, permitindo a análise transcriptômica subsequente. Após a sublimação do NL e gelo seco, os tricomas isolados são deixados livres de resíduos nocivos. Além disso, a propensão do NL a sublimar à temperatura ambiente permite seu uso generoso durante todo o protocolo. Em contrapartida, a utilização de grandes volumes de meio isolante convencional gera dificuldades práticas no seu manuseio. Finalmente, o protocolo diminui a separação da célula discal da estrutura frágil remanescente da cabeça do tricoma glandular, permitindo a retenção do conteúdo do headspace.
Este protocolo é apresentado de forma detalhada e passo a passo, visando auxiliar a prática técnica de isolamento de tricomas capitatos glandulares de C. sativa. O protocolo fornece um fluxo de trabalho gerenciável que resulta em tricomas isolados com alta concentração e pureza que são apropriados para análise molecular a jusante.
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Protocolo
NOTA: O material vegetal utilizado neste estudo consistiu de quatro linhagens de C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 e CS-14) cultivadas no Centro Volcani, Israel, conforme descrito anteriormente11. Tricomas glandulares capitados foram isolados de inflorescências maduras com floração, e tricomas sésseis capitados glandulares foram isolados de folhas grandes de leques de plantas-mãe maduras não floridas. Todo o material vegetal foi recém-colhido e imediatamente armazenado a −80 °C.
CUIDADO: Gelo seco e NL são usados durante todo o protocolo. Estas substâncias são extremamente perigosas. Os tricomas isolados podem conter partículas de gelo seco que podem criar pressão de gás perigosa quando inseridos em tubos selados; portanto, todas as tampas devem ser puncionadas com agulha. O uso de óculos de proteção, roupas apropriadas de laboratório e luvas para manuseio em temperaturas extremamente baixas é altamente recomendado.
1. Configuração para a separação inicial dos tricomas do material vegetal
- Esmague um bloco de gelo seco em pequenos flocos finos usando um martelo e um objeto plano duro em um recipiente de plástico de 5 L.
- Peneire os flocos de gelo seco fino (menores que 5 mm) do gelo seco não triturado com um filtro grande (através de poros menores que 5 mm) em outro recipiente plástico de 5 L. Despeje aproximadamente 200 cm3 (marca de 200 mL) dos flocos de gelo seco em um copo de vidro vertical de 1 L.
- Adicione até 10 g de inflorescências congeladas de C. sativa (doravante referidas como material vegetal) na primeira camada de gelo seco triturado e cubra com uma camada adicional de 200 cm3 de gelo seco finamente triturado.
- Cubra a abertura do copo de vidro de 1 L com duas a três camadas de mosquiteiro de porta de tela de 1 mm e prenda-o às laterais externas do copo de vidro com elásticos (Figura 1).
- Despeje o LN em um grande recipiente de aço inoxidável de fundo redondo (ver Tabela de Materiais), onde os tricomas isolados serão coletados.
- Inserir uma malha de 350 μm em uma peneiradora de farinha/peneira para cobrir a malha de peneira de farinha por baixo (Figura 2). Se estiver disponível uma peneira de farinha com um anel de plástico destacável, introduza a malha de 350 μm de modo a fixá-la sob a malha da peneira de farinha. Caso contrário, prenda a malha de 350 μm à circunferência da peneira de farinha com elásticos.
- Coloque a peneira de farinha acima do grande recipiente de aço inoxidável de fundo redondo preenchido com LN (Figura 3). Certifique-se de que a largura do recipiente exceda a da peneira de farinha para minimizar a perda da massa peneirada fora do recipiente de aço inoxidável de fundo redondo.
2. Separação dos tricomas do material vegetal
- Agite o copo de 1 L com a abertura apontada para baixo em direção à peneira de farinha como se estivesse usando um saleiro grande (Figura 4).
- Separe o copo de vidro de 1 L a cada 2-3 min para permitir a peneiração do gelo seco triturado e do material vegetal acumulado na peneira de farinha.
- Peneire a peneira de farinha horizontalmente para facilitar a passagem do material vegetal para o LN no recipiente de aço inoxidável de fundo redondo abaixo.
- Adicione LN ao recipiente de aço inoxidável e gelo seco triturado ao copo de vidro de 1 L quando seus níveis baixarem. Reabastecer o material vegetal usado no copo de vidro com mais 10 g de material vegetal fresco quando o material vegetal na peneira de farinha estiver esgotado. A reposição geralmente não precisa ser repetida mais de duas vezes.
- Repita os passos 2.1-2.4 até que uma quantidade suficiente de tricomas enriquecidos tenha sido coletada no recipiente de aço inoxidável de fundo redondo. Geralmente, 20 g de material vegetal fresco são suficientes para extração de RNA e análise do transcriptoma.
- Verifique se há uma substância semelhante a um pó branco (consistindo em restos vegetais, tricomas glandulares e gelo seco triturado) no fundo do recipiente de aço inoxidável submerso no LN. Uma observação microscópica ajudará a determinar se uma quantidade suficiente de tricomas foi coletada; no entanto, essa etapa pode obstruir o fluxo do protocolo. Geralmente, 10-20 g de material vegetal inicial é suficiente para a maioria dos isolamentos; no entanto, pode haver diferenças na densidade de tricomas das plantas.
Observação : a partir deste ponto, o experimento pode ser pausado e reiniciado mais tarde. Se pausado por um curto período de tempo, quantidades adequadas de LN devem ser adicionadas para que os tricomas permaneçam submersos. Alternativamente, os tricomas podem ser coletados e armazenados a −80 °C por até 3 meses para uso posterior, conforme descrito na etapa 5.
3. Separação dos tricomas glandulares capitados (pedúnculo e séssil) de outros tipos de tricomas, como tricomas bulbosos e cistolíticos, e debris
- Adicione uma pequena quantidade de LN a um pequeno recipiente de aço inoxidável de fundo redondo limpo.
- Dobre uma micropeneira de 40 cm x 40 cm com uma malha de 150 μm duas vezes para obter uma dobra de 20 cm x 20 cm e abra-a. Certifique-se de que se assemelhe a uma forma semelhante a um cone (Figura 5).
- Fixe o cone de malha na borda do recipiente de aço inoxidável de fundo redondo com um ou dois alfinetes de varal para que a parte aberta do cone fique ereta e sua parte pontiaguda esteja parcialmente submersa no LN.
- Despeje suavemente o LN e a substância branca em pó da etapa 2.6 no cone de micropeneira.
- Aplique suavemente um pincel largo para coletar e transferir qualquer material vegetal restante do primeiro recipiente para o cone de malha de 150 μm.
- Adicione mais LN ao primeiro recipiente e repita o movimento de escovação até que todo o material vegetal seja transferido para o cone de micropeneira.
- Retire cuidadosamente o varal da tampa do recipiente e abra o cone de micropeneira para que os tricomas fiquem localizados no meio da micropeneira aberta. Mantenha os quatro cantos da micropeneira juntos para que a parte média que contém os tricomas permaneça submersa no LN (Figura 6).
- Enquanto segura os quatro cantos da micropeneira, mergulhe suavemente e agite a micropeneira no LN no recipiente de aço como se estivesse infundindo um saquinho de chá. Continue este movimento de imersão/agitação (vertical e horizontal) por 1 min. Há um tradeoff entre a qualidade e a quantidade do isolamento. Movimentos de imersão mais longos podem resultar em maiores quantidades de tricomas, mas seu grau de isolamento pode ser menor. No geral, 1 min é recomendado como adequado tanto para qualidade quanto para quantidade.
NOTA: Este movimento de peneiramento é a parte mais crítica do protocolo e deve ser executado em conformidade. - Opcional: Coloque os restos vegetais não peneirados e os tricomas maiores (ainda submersos no LN) que estão envolvidos no centro da micropeneira em um tubo de ensaio de 13 mL ou 50 mL e armazene a -80 °C para uso futuro.
CUIDADO: Para evitar o acúmulo de gás pressionado (do gelo seco e resíduos de LN), puncione um orifício na tampa do tubo de ensaio com uma agulha esterilizada. A tampa pode ser substituída uma vez que a pressão tenha diminuído, o que geralmente é após 24 h.
4. Passagem de tricomas através de micro-peneiras de tamanho de poro decrescente
- Transfira os tricomas peneirados submersos no LN no fundo do pequeno recipiente de aço inoxidável de fundo redondo sequencialmente através de micropeneiras com tamanhos de poros decrescentes (105 μm, 80 μm, 65 μm e 50 μm), da mesma forma como apresentado na etapa 3.
5. Coleta dos tricomas desejados
- Remova os tricomas desejados submersos no LN e envolvidos na micropeneira de 50 μm usando uma colher pré-gelada (em LN). Coloque-os em um prato limpo.
OBS: Nesta etapa final de isolamento, os tricomas desejados são coletados da peneira. - Transfira rapidamente os tricomas em pó para um tubo de 1,5 mL pré-resfriado marcado através de uma espátula pré-resfriada ou de uma escoópula inserida no tubo (Figura 7). Conservar os tubos imediatamente a -80 °C para estudos adicionais.
NOTA: Um gráfico de fluxo de trabalho esquemático descrevendo todo o protocolo de isolamento é fornecido na Figura 8.
6. Observação e análise dos tricomas purificados
- Coloque uma pequena quantidade (10 mg) de tricomas isolados em uma lâmina de microscópio usando uma espátula pré-resfriada (via LN). Adicione uma gota de água e observe diretamente em um microscópio de luz sem manchar. Avaliar o isolamento geral e o grau de contaminação usando aumentos baixos (10x) e altos (40x). O enriquecimento visual é estimado pela quantidade relativa de tricomas em relação ao tecido não tricoma, como mostra a Figura 9.
- Realizar extração de RNA e análise de qualidade de 50 mg de caule glandular isolado de C. sativa e tricomas sésseis.
NOTA: Um kit de extração comercial (ver Tabela de Materiais) empregando uma estratégia baseada em poli-A de purificação de mRNA foi usado para a extração de RNA.- Ressuspender 50 mg dos tricomas isolados na solução de lise, vórtice por 30 s, sonicar em uma unidade de limpeza ultrassônica gelada a 35 kHz por 5 min e extrair o mRNA das amostras de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais).
- Para estimar a integridade do RNA extraído dos tricomas, determine a concentração de RNA, a quantidade total e os valores do número de integridade do RNA (RIN) usando um sistema lab-on-a-chip (ver Tabela de Materiais).
- Realizar análise de RNAseq das frações dos tricomas (opcional). A análise de RNAseq e as análises de bioinformática de leituras sequenciadas podem ser realizadas por serviços terceirizados padrão
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Resultados
A principal modificação incluída neste protocolo em relação aos protocolos convencionais de isolamento de tricomas é a substituição do meio de isolamento padrão por NL. O uso do LN como meio de isolamento permite um fluxo de trabalho relaxado, pois enquanto as amostras estiverem submersas no LN, a degradação metabólica provavelmente não ocorrerá. Além disso, como o protocolo evita os componentes perigosos (i.e., ácido auritricarboxílico e β-mercaptoetanol) usados no meio de isolamento de tricomas tradicional, o trabalho ...
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Discussão
Em comparação com os protocolos de isolamento de tricomas atualmente disponíveis, duas modificações principais são descritas no presente protocolo. Estes incluem o desprendimento dos tricomas do material vegetal usando gelo seco na etapa inicial e substituindo o LN pelo meio tampão líquido comumente usado. A primeira modificação para purificação de tricomas de C. sativa baseia-se em um protocolo anterior que introduziu o uso de gelo seco triturado para desprender os tricomas dos pedicelos de gerânio
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro da CannabiVar Ltd. Todo o material vegetal foi generosamente fornecido pelo professor Hinanit Koltai, do Centro Volcani, Israel.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bioanalisador RNA Pico 6000 chip | Agilent, Alemanha | Número de pedido 5067-1513 | Sistema Lab-on-a-chip |
| Transsonic-310 | Elma, Alemanha | D-78224 | Unidade de limpeza ultrassônica |
| Kit de Preparação de Amostras de RNA TruSeq v2 | Illumina, EUA | RS-122-2001 | Preparação de amostras para biblioteca de sequenciamento de RNA |
| Kit Total de RNA Spectrum Plant | SIGMA-ALDRICH, EUA | de RNA Total de Plantas | STRN50-1KT |
| Micro-peneira de nylon com malha de 350 e micro; m (40 x 40 cm ou maior que a circunferência da peneira de farinha) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon |
| micro-peneira de nylon da abertura da tela com tamanho de malha de 150 µ m (tamanho de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon abertura da tela |
| Micro-peneira de nylon com tamanho de malha ø 105 µ m (tamanho de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon abertura da tela |
| Micro-peneira de nylon com tamanho de malha ø 80 µ m (tamanho de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon abertura da tela |
| Micro-peneira de nylon com tamanho de malha ø 65 µ m (tamanho de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon abertura da tela |
| Micro-peneira de nylon com tamanho de malha ø 50 µ m (tamanho de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon abertura |
| da tela Até 10 g de material vegetal congelado (armazenado em -80 oC ou nitrogênio líquido) | |||
| Luvas adequadas para o manuseio de baixas temperaturas | |||
| Óculos de segurança | |||
| Malha de porta de tela (mosquito) de 1 mm (tira de 30 x 100 cm) | |||
| Filtro grande (peneira) com orifícios de aproximadamente 5 mm | |||
| 1 L copo | |||
| 1 bloco de gelo seco (0,5-1 kg) | |||
| Martelo e objeto | |||
| Dois recipientes | |||
| Elásticos | |||
| Peneira de farinha grande ou peneira - de preferência um com um anel de plástico destacável na circunferência | |||
| Vários recipientes de aço inoxidável de fundo redondo grandes e pequenos. Um deles deve ser maior que a circunferência da peneira de farinha (aproximadamente 40 cm de diâmetro), para minimizar a perda da massa peneirada fora do recipiente | |||
| Pré-resfriado (via nitrogênio líquido) colher, espátula e colher | |||
| Placa | |||
| Vários prendedores | |||
| de roupaTubos de 1,5 mL rotulados com pré-resfriado (via nitrogênio líquido) com orifícios na tampa com uma agulha | |||
| Dois recipientes de nitrogênio | |||
| pintura de 1 cm de largura |
Referências
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Reimpressões e permissões
