Avaliação dos sintomas de pacientes com rinite alérgica usando uma câmara de exposição a alérgenos

As alergias transmitidas pelo ar estão se tornando um problema social crescente. O diagnóstico adequado, a avaliação da eficácia da imunoterapia específica para alérgenos (AIT) e a compreensão das farmacoterapias são pontos-chave na abordagem dessa questão. No entanto, a padronização desses procedimentos requer concentrações estáveis de alérgenos, condições ambientais estáveis (por exemplo, umidade e temperatura) e a capacidade de causar sinais alérgicos de maneira repetível. As câmaras de exposição a alérgenos (CTEAs) proporcionam condições ambientais estáveis, independentes de fatores externos, e a concentração de partículas alergênicas dispersas é bem controlada e estável durante os desafios em CTEAs ^1,2.

O teste de provocação alergênica é a base para o diagnóstico de alergias transmitidas pelo ar, pois fornece evidências diretas da relevância clínica de um alérgeno específico para os sintomas e a gravidade da doença alérgica. O diagnóstico alérgico clássico inclui provocações nasais, conjunticais e brônquicas ^3,4,5. No entanto, o teste de provocação alergênica em um CTVA parece ser o mais próximo da exposição natural a alérgenos⁶.

Este estudo tem como objetivo apresentar um método seguro e eficaz de desafiar participantes com vários aeroalérgenos em um CTVA para desencadear sintomas alérgicos significativos correspondentes à exposição natural. Esse método é adequado para a indução de características patológicas de doenças respiratórias, incluindo rinite alérgica e asma, como um ponto final no teste de eficácia da TIA e pode contribuir e acelerar o desenvolvimento clínico de tratamentos farmacológicos 2,3,7,8,9,10.

Existem mais de uma dúzia de AECs no mundo¹¹. No entanto, as CTEA não são comparáveis entre si porque são projetadas individualmente, usam diferentes tipos de alérgenos (por exemplo, ácaro da poeira doméstica [HDM], pólen de bétula, pólen de gramíneas, pólen de gato, ragweed ou pólen de cedro japonês) e têm diferentes sistemas de medição para as partículas distribuídas 12,13,14,15,16,17,18,19 . Portanto, cada CTVA deve ser validada para alérgenos individuais. A validação do CEA garante que a concentração adequada do alérgeno é segura e que os sintomas são induzidos nos pacientes. O ALL-MED AEC é validado para alérgenos de HDM²⁰.

O ALL-MED AEC está localizado no Instituto de Pesquisa Médica em Wroclaw, Polônia. A instalação pode acomodar confortavelmente 15-20 pessoas durante um teste. A instalação consiste em uma sala com uma área de 12^m2, que é acessada por uma fechadura de ar para impedir que partículas do ambiente externo entrem nela. Os equipamentos (assentos, paredes, etc.) são compostos por superfícies não adesivas, acessíveis e passíveis de lavagem, como couro ecológico, plástico e metal. As cadeiras são móveis, permitindo diferentes configurações. A janela de visualização e a comunicação com o microfone permitem o monitoramento constante dos sujeitos (Figura 1). A acumulação de partículas é medida por um contador de partículas a laser (LPC). As partículas podem ser categorizadas em diferentes faixas, incluindo 0-20 μm, 20-50 μm e 50-100 μm, e os resultados são dados em partículas por metro cúbico (p/m³) durante uma unidade de tempo especificada (por exemplo, cada minuto). Há duas salas acessórias ao lado do CEA, onde os pacientes passam por exames antes de entrar na câmara. O equipamento de resgate consiste em um desfibrilador e outros dispositivos de ressuscitação alojados na instalação. Pelo menos dois profissionais de saúde, incluindo um médico, estão presentes durante cada desafio.

Este artigo apresenta um protocolo que segue as diretrizes do Comitê de Bioética da Wroclaw Medical University, na Polônia. Todos os participantes eram legalmente competentes e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para participar do estudo. Eles também foram informados de que tinham a opção de desistir a qualquer momento, sem dar um motivo.

1. Limpeza do CEA

NOTA: A limpeza pode ser feita mais cedo do que no dia do experimento.

1. Aspirar todas as superfícies, incluindo o mobiliário e o piso, com um aspirador de ar particulado de alta eficiência (HEPA).
2. Limpe todas as superfícies laváveis com um lenço umedecido, incluindo os móveis, as paredes, as janelas e o chão.
3. Ligue o compressor, que circula o ar pelo sistema AEC (duto de alimentação de alergênicos).
4. Ligue os ventiladores de piso e teto para que o ar de entrada seja misturado regularmente em condições turbulentas.
5. Sopre o duto de alimentação de alergênicos com ar limpo por 30 minutos, ajustando o "comprimento da injeção" e o "intervalo entre as injeções" da estação de controle do alimentador para seus valores máximos.
6. Verificar a contaminação pelo alérgeno monitorando o número de partículas no contador de partículas a laser (LPC)²¹.
   1. No menu principal, pressione Configuração | Amostra. Use os seguintes parâmetros: amostra por 1 min, 000 ciclos, 0 min de atraso, hold por 0 min e unidades de metros cúbicos (m³).
      NOTA: O LPC começará a contar as partículas imediatamente e, em seguida, contará as partículas por 1 minuto sem um intervalo entre cada medição. O LPC medirá as amostras até parar manualmente e, em seguida, calculará as partículas por metro cúbico (p/m³).
   2. No menu principal, pressione Configuração | Partículas. Selecione todas as opções.
      NOTA: O LPC medirá todas as partículas até 100 μm (faixa completa).
   3. Leia o resultado no programa de computador (por exemplo, LMS Express 7).
      NOTA: A cabine é limpa quando o número de partículas por metro cúbico (p/m 3) é inferior a 50 p/m³ e as partículas estão na faixa entre 0-100 μm por pelo menos 10 min.

2. Funcionamento do CEA

NOTA: A atmosfera na cabine deve ser monitorada regularmente por um engenheiro, que estabelece que os parâmetros são constantes durante o ensaio. Os parâmetros devem ser estabilizados antes da entrada dos participantes.

1. Ambiente
2. Ligue o compressor, que circula o ar por todo o AEC.
   1. Ajuste a temperatura para 21 °C ± 0,5 °C no sistema de controle de temperatura (Tabela de Materiais).
      NOTA: A temperatura pode variar entre 18°C e 27°C, se necessário.
   2. Ligue os ventiladores de piso e teto.
   3. Ligue o umidificador na estação de controle do alimentador (Tabela de Materiais).
   4. Defina a troca de ar por hora (ACH) entre 5 e 20 ajustando o botão "fonte de ar" na estação de controle do alimentador para a posição entre 40% e 100%. Meça a umidade relativa e a concentração de CO₂ com um medidor de qualidade do ar.
      NOTA: O ar externo fresco é aspirado através de filtros HEPA. Controle a umidade relativa (tipicamente 40% a 58%) e a concentração de dióxido de carbono (CO₂) (abaixo de 900 partes por milhão [ppm]). Ajuste o ACH para que a umidade e o CO₂ estejam dentro da faixa normal. Os valores de umidade e CO₂ são muito suscetíveis ao número de participantes.
3. Geração e contagem de partículas
   NOTA: Extratos alergênicos padronizados e liofilizados são usados. As partículas são injetadas no duto de alimentação de ar e sopradas no AEC através de um alimentador controlado por computador. A concentração de partículas pode ser ajustada entre 500/m 3 e 10.000/m³. Uma distribuição homogênea e espacialmente estável de partículas é obtida por mistura turbulenta para garantir que as partículas alergênicas estejam circulando em vez de cair e se acumular no chão.
   1. Ajuste o LPC para contar as partículas durante 1 min (repetir o passo 1.6.1).
   2. Defina o valor das partículas monitoradas na faixa de 0-20 μm. No menu principal, pressione Configuração | Partículas. Marque "5, 10, 20 μm". O LPC medirá todas as partículas na faixa de 0-20 μm.
      NOTA: As partículas podem ser classificadas em faixas, incluindo 0-20 μm, 20-50 μm e 50-100 μm, se necessário para monitorar um alérgeno diferente.
   3. Coloque o alérgeno no comedouro. Ajuste o "comprimento da injeção" para 100 ms (intervalo 10-200 ms) e o "intervalo entre as injeções" para 1,5 min (intervalo 0,3-3,0 min) na estação de controle do alimentador.
      NOTA: Para a validação do AEC ALL-MED, corpos de ácaros Dermatophagoides pteronyssinus (Dp ) secos e purificados (Tabela de Materiais) foram utilizados para o desafio HMD, sendo 5.000 p/m³ a concentração ótima²⁰.
   4. Monitorar o número de partículas (p/m³). Ajuste ambos os parâmetros continuamente, alterando seus valores.
4. Após a conclusão de cada teste, baixe todos os dados medidos (p/m³, concentração de CO₂ ) do computador para uma unidade externa. Analise os dados (Figura 2).

3. Medidas de segurança

1. Teste os participantes com um teste PCR para o vírus do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) 36-24 h antes de entrarem no AEC. Só permitem que participantes com resultado negativo no PCR entrem no CEA.
   NOTA: Esta etapa não é obrigatória e depende das restrições locais da doença 2019 do coronavirus (COVID-19). Os pacientes na cabine não usam máscaras de proteção.

4. Exame na cabine e desfechos clínicos

NOTA: Para os critérios de inclusão e exclusão, bem como as características dos participantes, ver Tabela Suplementar 1. Os participantes foram expostos a alérgenos de HDM na concentração de 5.000 p/m³ por uma duração de 120 min, de acordo com a validação do ALL-MED AEC²⁰.

1. Desinfetar as mãos dos participantes antes dos exames, pois os componentes do dispositivo que eles tocam podem ser uma fonte de transmissão da infecção. Essa recomendação é essencial, especialmente durante uma epidemia ou pandemia de doença viral.
2. Monitorar constantemente a condição dos participantes através da janela de visualização e estar em contato de voz através do sistema de microfone (Tabela de Materiais).
3. Antes de o participante entrar no CTA, solicite que coloque macacão descartável com capuz (Tabela de Materiais) para se proteger contra a infiltração de partículas não alergênicas e a possível contaminação das roupas.
4. Antes de o participante entrar no CTVA, forneça uma caixa contendo todas as pontas descartáveis necessárias para uso durante o exame: uma ponta de espirometria e um tampão nasal, uma máscara de fluxo inspiratório descartável, uma ponta do peak flow meter (MAP), ponteiras de MRA, um controle remoto para o questionário, um pacote de lenços e um saco plástico de risco biológico para secreção nasal.
5. Execute os desfechos clínicos seguindo as etapas abaixo. Repita o ARM, PNIF, PERF e FEV₁ testes antes do experimento e após 60 min e 120 min. Garantir que os participantes preencham o questionário TNSS a cada 30 min (Figura 3). Para maior conforto dos participantes, realizar os testes individualmente em uma sala ao lado do CTVA.
   NOTA: Para testes eficientes, peça aos participantes que entrem na cabine em intervalos de 10 min. Como resultado, as medidas para cada sujeito serão realizadas em diferentes momentos reais, com cada paciente passando um total de 120 min dentro do CTVA. A mudança de horário também permite que os membros da equipe auxiliem e interajam com os participantes durante o processo de teste. No total, o CEA opera por aproximadamente 210 min.
   1. Secreção nasal (parâmetro objetivo)
      OBS: Os participantes deverão estar com embalagens idênticas de lenços e sacolas plásticas. Isso é necessário para comparar os pesos.
      1. Instrua os participantes a colocar os lenços usados em um saco plástico. Após o término do desafio de 2 horas, peça aos participantes que também coloquem os lenços não utilizados na mesma bolsa. Se necessário, forneça lenços de papel adicionais e sacos plásticos.
      2. Recolha todos os sacos após o término do teste. Determinar o peso das secreções nasais pesando os lenços usados nos sacos plásticos. Subtrair o peso dos lenços e sacos plásticos não utilizados de cada medida para obter o peso das secreções nasais (Figura 4A).
   2. Levantamento de sintomas nasais (avaliação subjetiva)
      1. Exiba as perguntas do questionário na tela da TV.
      2. Peça ao paciente que se autoavalie antes do desafio e a cada 30 min durante o desafio, selecionando o número no controle remoto que corresponde à gravidade de cada sintoma (pergunta). Avaliar os sintomas nasais com base no questionário total nasal symptom score (TNSS) (Tabela 1).
      3. Envie ao participante um e-mail com o questionário TNSS. Peça-lhes que preencham o questionário em casa às 4 h e 24 h após o desafio e enviem os resultados.
      4. Após o término do desafio, faça o download das respostas e calcule a pontuação total de cada questionário (Figura 4B).
   3. Rinometria acústica (MRA) (parâmetro objetivo)
      NOTA: Para calcular as diferenças na área de secção transversal mínima (ACM), todas as medidas de um participante devem ser salvas em um único arquivo. Caso contrário, a análise não será possível.
      1. Realize o teste três vezes: antes do desafio, 60 min após o desafio e 120 min após o desafio.
      2. Coloque a ponta apropriada da cabeça do rinômetro contra a narina (azul para a narina esquerda). Verifique se está apertado. Peça ao participante para prender a respiração por 3 s e, em seguida, inicie o programa.
         NOTA: Em caso de resultado incerto, repita o teste.
      3. Repita para a outra narina com a ponta apropriada (vermelha para a narina direita).
      4. Terminado o desafio, calcule a ACM (Figura 4C).
   4. Pico de fluxo inspiratório nasal (PFNI) (parâmetro objetivo)
      NOTA: O PFNI mede diretamente o fluxo aéreo nasal durante a inspiração máxima e determina o grau de obstrução nasal.
      1. Realize o teste três vezes: antes do desafio, 60 min após o desafio e 120 min após o desafio.
      2. Peça ao participante que desinflame profundamente seus pulmões. Em seguida, coloque a máscara do medidor de fluxo inspiratório descartável conectada ao fluxômetro em seu rosto e instrua-os a inspirar pelo nariz ao máximo (Figura 4D).
      3. Certifique-se de que o medidor de fluxo inspiratório esteja em posição horizontal durante todo o teste. Registre a média da melhor de três medições.
   5. Pico de fluxo expiratório PFE (parâmetro de segurança)
      NOTA: O PFE é um indicador confiável da adequação da ventilação, bem como da obstrução ao fluxo aéreo.
      1. Realize o teste três vezes: antes do desafio, 60 min após o desafio e 120 min após o desafio.
      2. Peça ao participante que respire o mais fundo possível, coloque os lábios ao redor da ponta descartável de matéria de pico de fluxo e expire rápida e vigorosamente (Figura 4E).
      3. Registre a média da melhor de três medições.
      4. Após o término do desafio, forneça ao participante um MAP. Peça-lhes que realizem o teste em casa às 4 h e 24 h após o desafio e devolvam os resultados.
   6. Espirometria (parâmetro pulmão de segurança)
      NOTA: A espirometria é realizada de acordo com as normas da European Respiratory Society (ERS)²² para avaliar a segurança e monitorar possíveis obstruções brônquicas23.
      1. Realize o teste três vezes: antes do desafio, 60 min após o desafio e 120 min após o desafio.
      2. Antes da medida, defina os parâmetros no espirômetro para cada participante: sexo, idade, peso e altura.
      3. Peça ao participante que se sente e coloque o tampão nasal. Em seguida, peça ao participante que coloque os lábios ao redor da ponta descartável do espirômetro e respire com calma e cuidado.
      4. Peça ao participante que respire fundo e exale forte, sem demora desnecessária, que só pode ser interrompida quando o espirômetro der um sinal. Repita 3x.
      5. Após examinar todos os participantes, faça o download dos resultados e registre o volume expiratório forçado no primeiro segundo (_VEF1) (Figura 4F).
6. Se os parâmetros de bem-estar ou segurança do participante se deteriorarem drasticamente durante o desafio alergênico, pare o teste imediatamente.
7. Mantenha os participantes seguros e confortáveis depois de deixar as instalações do CEA, fornecendo-lhes medicamentos de resgate (se necessário).
8. Realizar chamadas de acompanhamento de segurança com cada participante 24 h após o desafio.

O ambiente do CTVA foi monitorado durante todo o tempo de operação quanto ao número de alérgenos (p/m3), temperatura, umidade e concentração de CO 2 (Figura 2). Os níveis de alérgenos de HDM mostraram-se estáveis (Figura 2A). Além disso, é mostrado um ensaio no qual não foram distribuídos alérgenos, com partículas na faixa de 0-20 μm e contagem de partículas máxima de 50 p/m3 (Figura 2A). Houve um influxo de partículas provenientes da entrada dos participantes no CTA, resultando em cerca de 100 p/m3 para os 15 participantes em comparação com uma câmara vazia. Como resultado, os valores medidos pelo LPC durante o ensaio incluíram a concentração-alvo com um influxo de aproximadamente 100 p/m3.

Os dados pareados foram comparados com o teste U de Mann-Whitney. Os valores foram considerados estatisticamente significantes para todos os testes com p < 0,05. Cálculos estatísticos foram realizados, e gráficos foram gerados usando um programa gráfico.

Dois grupos foram incluídos no estudo para mostrar a diferença entre os resultados positivos e negativos: oito indivíduos alérgicos à HDM com sintomas de rinite alérgica (RA) e sete indivíduos controles saudáveis (HC) sem alergias. A Tabela Suplementar 1 apresenta os critérios de inclusão e exclusão, bem como as características dos participantes. Os participantes foram expostos à HDM na concentração de 5.000 p/m3 por uma duração de 120 min, de acordo com a validação do ALL-MED AEC20.

Todos os participantes foram submetidos aos seguintes testes (ARPA, PNIF, PERF, espirometria) e responderam aos questionários TNSS, e suas descargas nasais foram coletadas. O peso do TNSS e da secreção nasal foi significativamente maior nos indivíduos com RA em comparação com o grupo HC (Figura 4A,B). O SNT atingiu os valores de pico após 60 min de exposição e, em seguida, platô (p < 0,0001). Além disso, o peso da secreção nasal foi significativamente maior no grupo RA (p < 0,0001). Na rinometria acústica observou-se comprometimento da patência das vias aéreas. A MCA diminuiu significativamente após a primeira medida aos 60 min quando comparado o grupo RA com o grupo HC. A partir desse momento até o final do desafio, os valores permaneceram estáveis (p < 0,001). Isso concordou com as medidas do PFNI, para as quais foi observada uma redução significativa nas mesmas concentrações (p < 0,01) (Figura 4C,D).

OVEF1 e o PFE foram medidos durante o desafio do CTVA (Figura 4E,F). Além disso, os participantes mediram seu PFE em casa em 4 h e 24 h após o desafio e devolveram os resultados pelo correio. Os valores estavam dentro da normalidade e permaneceram estáveis durante o desafio e por até 24 h após. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os alérgicos com RA e os HCs, o que sugere que a exposição ao alérgeno HDM não teve efeitos sobre a função pulmonar em ambos os grupos.

Figura 1: Layout esquemático do CEA. Os participantes entram pela fechadura de ar. As partículas são distribuídas através do sistema de saídas de ar por um alimentador controlado por computador. As condições de CTE (concentração de partículas, concentração de CO2 , umidade e temperatura) são constantemente monitoradas por um LPC. Os participantes são monitorados pela janela e conexão de voz. Abreviações: CTVA = câmara de exposição a alérgenos; CO2 = dióxido de carbono; LPC = contador de partículas a laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados representativos da estabilidade do ambiente no CTVA durante o ensaio . (A) A concentração de partículas foi avaliada e encontrada na faixa de 0-20 μm por LPC. O valor alvo para a concentração de alérgenos de HDM foi de 5.000 p/m3. Para comparação, um ensaio em que nenhum alérgeno foi usado é mostrado. (B) Umidade, (C) concentração de CO2 e (D) e temperatura são mostrados. Abreviaturas: °C = graus Celsius; CO2 = dióxido de carbono; HDM = ácaro da poeira doméstica; LPC = contador de partículas a laser; m = metro; min = minuto(s); p = partículas; ppm = partes por milhão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Lista de testes a serem realizados durante o desafio do CTA, com pontos de tempo (para cada participante). Para garantir a execução oportuna de testes individuais, os participantes devem entrar no CEA a cada 10 min. Como resultado, o teste para cada participante será realizado em diferentes momentos reais. Além disso, a mudança de horário permite que a equipe ajude os participantes durante o teste. Abreviações: CTVA = câmara de exposição a alérgenos; MRA = rinometria acústica; VEF1 = volume expiratório forçado no primeiro segundo; PFE = pico de fluxo expiratório; PFNI = pico de fluxo inspiratório nasal; TNSS = escore total de sintomas nasais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados representativos de diferentes desfechos durante o desafio do CTVA em pacientes com RA (barras vermelhas) e HCs (barras azuis). Indivíduos alérgicos desencadeados por DMH (com RA) e HC, incluindo oito e sete participantes, respectivamente, foram expostos a concentrações de alérgenos de HDM de 5.000 p/m3 no CTA. (A) Foram avaliados o peso das secreções nasais, (B) os sintomas nasais, (C) a ACM na rinometria acústica, (D) o PFNI, (E) o PFE e o (F)VEF1 . Os resultados são apresentados como réplicas individuais com o valor médio. Abreviações: CTVA = câmara de exposição a alérgenos; RA = rinite alérgica; VEF1 = volume expiratório forçado no primeiro segundo; HC = controles saudáveis; HDM = ácaro da poeira doméstica; g = grama(s); MCA = área transversal mínima; p = partículas; PFE = pico de fluxo expiratório; PFNI = pico de fluxo inspiratório nasal; TNSS = escore total de sintomas nasais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Sintomas e método de escore para SNT. Um sistema de classificação foi utilizado pelos participantes para avaliar quatro sintomas. Os resultados da pesquisa são apresentados como um valor - um escore total para as quatro questões de um determinado tempo (antes da tentativa e a cada 30 min da tentativa). Abreviação: TNSS = escore total de sintomas nasais.

Tabela Suplementar 1: Critérios de inclusão e exclusão do estudo e características dos participantes incluídos no estudo. Oito pacientes com sintomas de RA, desencadeados por HDM, e sete pacientes sem sintomas (HCs). Abreviações: AR = rinite alérgica; Df = Dermatophagoides farinae; Dp = Dermatophagoides pteronyssinus; F = feminino; HC = controle saudável; HDM = ácaro da poeira doméstica; kU/L = quilo unidades/litro; M = masculino; md = diâmetro médio; sIgE = imunoglobulina E específica; TCP = teste cutâneo de puntura. Clique aqui para baixar este arquivo.

Marek Jutel relata taxas pessoais de ALK-Abello, Allergopharma, Stallergenes, Anergis, Allergy Therapeutics, Leti, HAL, GSK, Novartis, Teva, Takeda e Chiesi. Os demais autores não têm nada a revelar.