Artigo de método

Estudo da metilação da arginina proteica: abordagens e métodos

DOI:

10.3791/64821

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20 de janeiro de 2023

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

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ARTIGOS DISCUTIDOS:

Hutchinson, A., Seitova, A. Produção de proteínas PRMT recombinantes usando o sistema de vetor de expressão de Baculovirus. Jornal de Experimentos Visualizados. (173), doi: 10.3791/62510 (2021).

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. Uma abordagem proteômica baseada em espectrometria de massa para análise global e de alta confiança de proteína R-Methylation. Jornal de Experimentos Visualizados. (182), doi: 10.3791/62409 (2022).

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Explorando o metiloma de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Jornal de Experimentos Visualizados. (178), DOI: 10.3791/63245 (2021).

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Métodos quantitativos para estudar a atividade da proteína arginina metiltransferase 1-9 em células. Jornal de Experimentos Visualizados. (174), DOI: 10.3791/62418 (2021).

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. O ensaio de ligação de proximidade permite a detecção, localização e quantificação da metilação da arginina da proteína no tecido fixo. Jornal de Experimentos Visualizados. (185), DOI: 10.3791/64294 (2022).

Editorial

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A metilação da arginina proteica é uma modificação pós-traducional que está envolvida na regulação de um amplo espectro de processos biológicos 1,2,3. Os nove membros da família das proteínas arginina metiltransferases (PRMTs) podem metilar argininas de maneira monometil e di-metil simétrica ou assimétrica. Compreender as consequências funcionais e catalogar os substratos metilados dos PRMTs avançou drasticamente a compreensão das enzimas PRMT e facilitou sua ligação à doença2. Além disso, o desenvolvimento de inibidores potentes e seletivos permitiu abordagens baseadas em biologia química para estudar PRMTs e acelerou o desenvolvimento clínico dos agentes direcionados ao PRMT3. À medida que o campo das PRMTs progride, novos métodos e suas aplicações permitirão ainda mais a elucidação da regulação e biologia dessas enzimas.

Nesta coleção de métodos, um artigo sobre a produção recombinante das proteínas PRMT fornece um relato detalhado de um sistema de expressão baseado em baculovírus4. Vários PRMTs podem ser gerados usando a expressão bacteriana; no entanto, PRMTs dependentes maiores ou complexos, como PRMT7 ou PRMT5, requerem um sistema de expressão de células de insetos. Este método já beneficiou inúmeros esforços in vitro para determinar os substratos das PRMTs.

O estudo de substratos de PRMT no ambiente celular requer abordagens de detecção sofisticadas. Dois artigos desta coleção apresentam metodologias distintas que dependem do enriquecimento de anticorpos de argininas metiladas seguido de quantificação por espectrometria de massa ou quantificação independente de anticorpos usando ressonância magnética nuclear (RMN). Vários anticorpos reconhecendo estados distintos de metilação foram desenvolvidos e têm sido usados em estudos que identificam os substratos do PRMT5. O método de espectrometria de massa permite a avaliação quantitativa da metilação da arginina da proteína celular, empregando marcação metabólica, técnicas de separação sofisticadas subsequentes e enriquecimento baseado em anticorpos6. Vários membros da família PRMT preferem metilar argininas que são encontradas em motivos RGG repetitivos que residem nas regiões intrinsecamente desordenadas das proteínas7. O método baseado em espectroscopia de RMN permite determinar o estado de metilação e a posição de todos os derivados de arginina (mono e di, simétricos e assimétricos) onde podem ser quantificados de forma confiável em amostras biológicas complexas8.

Finalmente, para identificar resíduos de arginina metilada em proteínas específicas, dois artigos fornecem abordagens baseadas em western blotting e no ensaio de ligação de proximidade (PLA). Ambos os métodos utilizam detecção baseada em anticorpos, mas diferem no método de detecção e nas informações fornecidas. O método de western blot é quantitativo e tem sido valioso na caracterização de sondas químicas9. O PLA fornece informações sobre a localização espacial da arginina metilada, uma vez que utiliza o anticorpo proteico alvo e o anticorpo genérico para mono ou dimetilarginina, contornando assim a necessidade de gerar anticorpos específicos e pode ser notavelmente usado em tecidos fixos10.

Juntas, essas diversas metodologias permitirão a descoberta robusta de argininas metiladas em vários sistemas celulares e estados de doença e avançarão ainda mais o conhecimento fundamental da função biológica das enzimas PRMT.

Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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D.B.L. é apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC). O Structural Genomics Consortium é uma instituição de caridade registrada (no: 1097737) que recebe fundos da Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Genentech, Genome Canada por meio do Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (também conhecida como EMD no Canadá e nos EUA), Pfizer e Takeda.

Referências

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  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

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Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

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