Este artigo descreve protocolos para a fabricação de microgel de metacriloíla de gelatina de alto rendimento usando dispositivos microfluídicos, conversão de microgéis em pó ressuspendível (micro-aerogéis), montagem química de microgéis para formar arcabouços de hidrogel granular e desenvolvimento de biotintas de hidrogel granulares com microporosidade preservada para bioimpressão 3D.
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Artigo de método
Suportes de hidrogel granular de metacriloíla de gelatina: fabricação de microgel de alto rendimento, liofilização, montagem química e bioimpressão 3D
Neste artigo
Resumo
Resumo
O surgimento de arcabouços granulares de hidrogel (GHS), fabricados via montagem de micropartículas de hidrogel (HMPs), possibilitou a formação de arcabouços microporosos in situ. Ao contrário dos hidrogéis convencionais a granel, os poros de microescala interconectados no GHS facilitam a infiltração celular independente da degradação, bem como a transferência de oxigênio, nutrientes e subprodutos celulares. A gelatina modificada com metacriloíla (GelMA), um biopolímero (foto)quimicamente reticulável, à base de proteínas, contendo adesivo celular e metades biodegradáveis, tem sido amplamente utilizada como biomaterial responsivo/instrutivo a células. A conversão de GelMA em GHS em massa pode abrir uma infinidade de oportunidades para engenharia e regeneração de tecidos. Neste artigo, demonstramos os procedimentos de fabricação de microgel GelMA de alto rendimento, conversão em microgéis secos ressussuspendíveis (micro-aerogéis), formação de GHS através da montagem química de microgéis e fabricação de biotinta granular para bioimpressão por extrusão. Mostramos como um tratamento físico-químico sequencial via resfriamento e fotoreticulação permite a formação de GHS mecanicamente robusto. Quando a luz é inacessível (por exemplo, durante a injeção de tecidos profundos), HMPs de GelMA reticulados individualmente podem ser montados bioortogonalmente via reticulação enzimática usando transglutaminases. Finalmente, a bioimpressão tridimensional (3D) de GHS microporoso em baixa densidade de empacotamento de HMP é demonstrada através da automontagem interfacial de nanopartículas heterogêneamente carregadas.
Introdução
A montagem de blocos de construção HMP para formar arcabouços de engenharia de tecidos ganhou enorme atenção nos últimos anos1. GHS, fabricado via montagem HMP, tem propriedades únicas em comparação com suas contrapartes a granel, incluindo microporosidade em escala celular originada dos espaços vazios entre os blocos de construção discretos. Propriedades adicionais, como injetabilidade, modularidade e rigidez dissociada da porosidade, tornam o GHS uma plataforma promissora para melhorar o reparo e a regeneração tecidual2. Diferentes biomateriais têm sido utilizados para a fabricação de GHS, incluindo polímeros ....
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Protocolo
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.
1. Síntese de GelMA
NOTA: A síntese de GelMA deve ser realizada em uma capela de fumaça química, e equipamentos de proteção individual (EPIs) adequados devem ser usados o tempo todo.
- Adicionar 200 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS, 1x) a um balão de Erlenmeyer e aquecer a solução até atingir 50 °C. Cubra o balão com papel alumínio para evitar a evaporação.
- Adicionar 20 g de gelatina em pó à sol....
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Resultados
O GelMA foi sintetizado através da reação da gelatina com MA, conforme apresentado na Figura 1A. Adaptando-se as condições de reação, tais como a concentração de MA, diferentes graus de substituição de MA foram obtidos. Para quantificar o grau de substituição da MA, o GelMA foi avaliado por espectroscopia de RMN de 1H (Figura 1B). Grupos funcionais de vinil com picos representativos nos deslocamentos químicos de ~5-6 ppm confirmaram o sucess.......
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Discussão
A gelatina e seus derivados são os biomateriais proteicos mais comumente utilizados para a fabricação de HMP. O desafio do trade-off de monodispersidade de produção versus tamanho de partícula pode ser superado usando dispositivos microfluídicos de emulsificação por etapas. Esses dispositivos são capazes de formar mais de 40 milhões de gotículas por hora, com coeficiente de variação inferior a 5%27. Neste artigo, discutimos a microfabricação de gotículas contendo soluções de GelMA, seguidas de con.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a T. Pond, especialista em apoio à pesquisa do Departamento de Engenharia Química da Universidade Estadual da Pensilvânia (Penn State), à equipe do Laboratório de Nanofabricação da Penn State e ao Dr. J. de Rutte da Partillion Bioscience pela ajuda e discussão sobre os processos de nanofabricação. A. Sheikhi agradece o apoio do Materials Research Institute (MRI) e da College of Engineering Materials Matter at the Human Level seed grants, do Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) e do Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS)....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, EUA | B20156-18 | Punção de biópsia de 98% de pureza |
| Integra Miltex, NY, EUA | 33-31A-P/25 | Punção de biópsia de 1,5 mm com sistema de êmbolo | |
| Agulha romba | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
| Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, EUA | Centrífuga de dispositivo de RMN | |
| Eppendorf, Alemanha | 5415 C | ||
| Tubo de centrífuga | Celltreat, MA, EUA | 229423 | |
| Filtros de café | BUNN, IL, USA | 20104.0006 | BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 cada, 100 ct |
| Dessecador | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Dessecador a Vácuo, Tampa e Corpo de PC, 280 mm OD |
| Óxido de deutério | Sigma, MA, EUA | 151882 | |
| Membrana de diálise (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, USA | 08-667E | |
| salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS, 1x) | Sigma, MA, USA | 56064C-10L | pó seco, sem cálcio, sem magnésio, adequado para cultura de células |
| Frasco Erlenmeyer | Corning, NY, USA | 4980 | Corning PYREX |
| Etanol | VWR, PA, EUA | 89125-188 | Koptec 200 prova |
| Frascos criogênicos de rosca externa (criogeniais) | Corning, NY, EUA | 430659 | |
| Liofilizador | Labconco, MO, EUA | 71042000 | Equipado com bomba de vácuo (Catálogo# 7587000) |
| Gelatina em pó | Sigma, MA, EUA | G1890-5100G | Tipo A de pele suína, força do gel ~300 g Bloom |
| Glass lâminas de microscópio | VWR, PA, USA | 82027-788 | |
| Placa de aquecimento | FOUR E'S SCIENTIFIC | Agitador de placa magnética de 5 polegadas Max Temp 280 ° C/536 ° F | |
| Kimwipes | Fischer scientific, MA, USA | 06-666 | |
| KMPR 1000 série de fotorresistentes negativos | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | 121619 | KMPR1025 e KMP1035 estão incluídos |
| LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, USA | 2344265 | |
| Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio (LAP) | Sigma, MA, EUA | 900889-1G | >95% |
| Luer-Lok conector | BD, NJ, EUA | BD 302995 | |
| Máscara MA/BA Gen4-Serie e Alinhador de Ligação | SÜ SS MicroTeck, dispositivo de | nanofabricação | |
| Anidrido de metacilato Sigma | , MA, EUA | 276685-100ML | contém 2.000 ppm topanol A como inibidor, 94% |
| Milli-Q água | Millipore Corporation, MA, EUA | ZRQSVR5WW | resistividade elétrica ≈ 18 M & Omega; a 25 ° C, Sistema de Purificação de Água Remota UV Direct-Q 5 |
| Novec 7500 fluido de engenharia | 3M, MN, USA | 3M ID Forno 7100003723 | |
| VWR, PA, EUA | VWR-1410 | 1410 Forno a vácuo | |
| Parafilm | Fischer scientific, MA, EUA | HS234526C | |
| Pipeta Pasteur | VWR, PA, EUA | 14673-010 | |
| Placa de Petri | VWR, PA, EUA | 25384-092 | poliestireno |
| Pico-Surf | Sphere Fluidics, UK | C022 | (5% (p / p) em novembro de 7500) |
| Pipeta | VWR, PA, USA | 89079-970 | |
| Ponteiras de pipeta | VWR, PA, USA | 87006-060 | |
| Câmara de limpeza de plasma | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-001-HP | |
| Polidimetilsiloxano | Dow Corning, MI, EUA& | nbsp; 2065623 | SYLGARD 184 Kit de Elastômero de Silicone |
| Pipeta de deslocamento positivo | Microman E M100E, Gilson, OH, USA | M100E | |
| Bolachas de silício | UniversityWafer, MA, USA | 452/1196 | mecânica de grau mecânico de 4 polegadas |
| VWR, PA, USA | 231-0104 | Descartável | |
| SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, EUA | ||
| Bomba de seringa | Harvard Apparatus, MA, EUA | 70-2001 | PHD 2000 |
| Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano | Millipore Sigma, MA, EUA | 448931-10G | 97% |
| Tygon tubings | Saint-globain, PA, USA | AAD04103 | |
| Luz UV | QUANS | Tensão: 85 V-265 V AC / Potência: 20 W | |
| Unidade de filtração a vácuo | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µ m |
| Vortex | Fischer scientific, EUA | 14-955-151 | Mini misturador de vórtice |
Referências
- Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A.
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Reimpressões e permissões
