$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Com seus notáveis ganhos em sensibilidade, velocidade e versatilidade, a espectrometria de massa (MS) moderna oferece aos pesquisadores maiores oportunidades para a caracterização do proteoma. Com tecnologias aprimoradas, os pesquisadores estão exigindo um maior nível de rigor em seus resultados. Portanto, de igual importância para o fluxo de trabalho proteômico são estratégias inovadoras de preparação de amostras concebidas para isolar, separar e processar misturas proteômicas complexas antes do MS. A diversidade química dos sistemas proteômicos impede uma abordagem de "tamanho único" para a preparação de amostras. No entanto, como visto por meio dessa coleta de métodos, vários protocolos estão disponíveis para maximizar a qualidade e a confiança dos dados de MS. Esta coleção visa fornecer aos pesquisadores ferramentas e truques fáceis de implementar, projetados para melhorar o resultado esperado dos fluxos de trabalho proteômicos e metabolômicos.
As colunas de HPLC capilar e UPLC são quase onipresentes em fluxos de trabalho proteômicos abrangentes. Embora as colunas capilares autoembaladas sejam uma alternativa de baixo custo às colunas comerciais, aqueles que tentaram embalar suas próprias colunas podem estar familiarizados com taxas de empacotamento inconsistentes e qualidade variável da coluna. Kovalchuk e colegas da Academia Russa de Ciências demonstram sua abordagem FlashPack para garantir o empacotamento eficiente e consistente das colunas capilares UPLC1. Uma combinação de variáveis controladas com precisão reduz a formação de cúpula na entrada capilar e permite o enchimento rápido da coluna usando uma bomba de embalagem de baixa pressão.
A imunopeptidômica é uma subdisciplina emergente da proteômica, com implicações clínicas em oncologia e imunoterapias. A análise confiável da EM requer o isolamento de MHC classe I/II ou ligantes peptídicos do antígeno leucocitário humano (HLA). Para melhorar a reprodutibilidade deste protocolo de isolamento, Sirois e colegas da Universidade de Montreal demonstram um fluxo de trabalho de captura de afinidade baseado em esferas em pequena escala, juntamente com os resultados antecipados de MS do imunopeptidoma2 recuperado.
Para melhorar ainda mais o rigor dos dados proteômicos e facilitar o processamento de alto rendimento de um grande número de amostras, os pesquisadores estão cada vez mais recorrendo a plataformas robóticas para automatizar as etapas de processamento de amostras. Uma plataforma robótica de baixo custo está disponível, embora isso exija que o usuário programe as etapas de manipulação desejadas, o que pode ser uma barreira para o uso deste dispositivo. Han et al. no Campus Médico Anschutz da Universidade do Colorado desenvolveram um pacote de codificação simples de código aberto e demonstram as etapas básicas envolvidas na digestão de proteínas na plataforma robótica Opentrons OT-23.
Surfactantes como SDS são comumente empregados para facilitar a extração celular e a solubilização do proteoma antes da EM. No entanto, a remoção do SDS pode ser incompleta ou arriscar a perda da amostra. Nickerson e colegas da Dalhousie University demonstram um cartucho descartável para automatizar o processo de precipitação de proteínas4. Uma combinação de sal e solvente orgânico é fundamental para maximizar a recuperação de proteínas e pode ser realizada em tempo mínimo com altos rendimentos.
A metabolômica está seguindo os passos da análise de proteoma, com um banco de dados crescente de espectros de MS de referência sendo usados para identificar metabólitos desconhecidos em fluxos de trabalho direcionados e não direcionados. Semelhante à análise proteômica, as identificações espectrais são propensas a correspondências de falsos positivos e, portanto, um relatório estatístico da taxa de descoberta falsa (FDR) é essencial para filtrar resultados de baixa confiança. Li e colegas da Universidade de Jinan fizeram parceria com a Chi-Biotech Co. para produzir um fluxo de trabalho baseado na web com base em seu programa XY-Meta e gerar um banco de dados demetabólitos 5. Eles demonstram as etapas para gerar o banco de dados de destino e filtrar os resultados metabolômicos com base em um FDR desejado.
Finalmente, um protocolo para isolamento de proteoma de célula única é demonstrado por Petelski e colegas da Northeastern University6. O protocolo Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) permite que os pesquisadores quantifiquem centenas a milhares de proteínas em um único experimento, usando um transportador isobárico para reduzir a perda de amostra. A chave para o protocolo é uma etapa rápida de ciclo térmico para lisar as células, bem como uma digestão tríptica eficiente usando uma quantidade maior do que o normal de enzima e marcação isobárica com etiquetas TMT.
Apesar de décadas de experiência em proteômica, esse campo em amadurecimento simplesmente evoluiu para enfrentar problemas mais desafiadores. A capacidade de processar um número maior de amostras, ou quantidades menores de material, com maior consistência e confiança na saída de dados continua a impulsionar as inovações tecnológicas. A troca de ideias relacionadas a manipulações químicas, abordagens instrumentais e informáticas é essencial para o crescimento desse campo. O "problema" de um pesquisador pode já ter sido resolvido por uma simples "dica ou truque" para superar o desafio. É, portanto, um sinal positivo que tantas estratégias exclusivas para análise de proteoma estejam disponíveis. Para os desafios que permanecem, é provável que alguém já esteja trabalhando em uma possível solução.