Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Transplantation intrapéritonéale pour générer une leucémie myéloïde aiguë chez la souris

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64834
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Center for Molecular Immunology and Infectious Disease and Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Penn State Cancer Institute, The Pennsylvania State University

Summary

Ici, l’injection intrapéritonéale de cellules leucémiques est utilisée pour établir et propager la leucémie myéloïde aiguë (LAM) chez la souris. Cette nouvelle méthode est efficace dans la transplantation en série de cellules AML et peut servir d’alternative pour ceux qui peuvent éprouver des difficultés et des incohérences avec l’injection intraveineuse chez la souris.

Abstract

Il existe un besoin non satisfait de nouvelles thérapies pour traiter la leucémie myéloïde aiguë (LAM) et la rechute associée qui implique des cellules souches leucémiques persistantes (LSC). Un modèle expérimental de rongeurs AML pour tester des thérapies basées sur la transplantation réussie de ces cellules par injections rétro-orbitales chez des souris receveuses est semé d’embûches. L’objectif de cette étude était de développer une méthode simple, fiable et cohérente pour générer un modèle murin robuste de LAM en utilisant une voie intrapéritonéale. Dans le protocole actuel, les cellules de la moelle osseuse ont été transduites avec un rétrovirus exprimant l’oncoprotéine de fusion MLL-AF9 humaine. L’efficacité des populations de lignées négatives (Lin-) et Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) en tant que CLL donneurs dans le développement de la LAM primaire a été testée, et l’injection intrapéritonéale a été adoptée comme nouvelle méthode pour générer la LAM. La comparaison entre les injections intra-péritonéales et rétro-orbitales a été faite dans des transplantations en série pour comparer et contraster les deux méthodes. Les cellules Lin- et LSK transduites avec le virus MLL-AF9 humain bien greffé dans la moelle osseuse et la rate des receveurs, conduisant à une LAM à part entière. L’injection intrapéritonéale de cellules de donneur a établi la LAM chez les receveurs lors de la transplantation en série, et l’infiltration de cellules de LAM a été détectée dans le sang, la moelle osseuse, la rate et le foie des receveurs par cytométrie en flux, qPCR et analyses histologiques. Ainsi, l’injection intrapéritonéale est une méthode efficace d’induction de la LAM utilisant la transplantation en série de cellules leucémiques de donneur.

Introduction

La leucémie myéloïde aiguë (LAM) est un type d’hémopathie maligne d’étiologie diverse avec un mauvais pronostic1. La génération de modèles animaux de LAM jette les bases de la compréhension de ses variations complexes et de sa pathobiologie dans le but de découvrir de nouvelles thérapies2. La leucémogenèse chez la souris implique la transplantation de cellules de donneurs exprimant des oncoprotéines de fusion, y compris des fusions impliquant le gène de la leucémie de lignée mixte (MLL) pour induire puissamment la LAM, afin d’imiter la maladie chez l’homme3. Diverses origines cellulaires de cellules de donneurs ont été rapportées lors de la transplantation de LAM4 associée au gène LAM, et on sait très peu de choses sur les cellules responsables de l’origine de la maladie.

Plusieurs voies ont été développées pour la transplantation chez la souris; plutôt qu’une injection intra-fémorale, qui introduit directement des cellules donneuses mutantes dans la moelle osseuse5, une injection intraveineuse qui utilise le plexus du sinus veineux, la veine de la queue et la veine jugulaire a été largement utilisée pour générer des modèles murins de LAM 6,7,8,9. Dans le cas de l’injection rétro-orbitale (r.o.), divers inconvénients inhérents, tels que la limitation du volume, la forte demande technique, le peu de risques de tentatives répétées ou d’erreurs, et les lésions oculaires potentielles, ont été des pierres d’achoppement majeures avec peu ou pas d’alternatives viables7. L’injection de veines de queue peut avoir des problèmes similaires en plus des blessures locales; Pour faciliter la procédure, les souris ont souvent besoin d’être réchauffées pour dilater leurs veines de la queue10. Il est également difficile de localiser la veine de la queue sans source de lumière supplémentaire, en particulier chez la souche C57BL / 6 de souris. Pour l’injection de la veine jugulaire, le personnel de recherche a besoin d’une formation suffisante pour localiser la veine et limiter les complications possibles. De plus, les injections du sinus veineux et de la veine jugulaire doivent être effectuées sous anesthésie, ce qui ajoute un autre niveau de complexité. Ainsi, il est tentant d’explorer de nouvelles voies de transplantation pour faciliter l’établissement de modèles murins de LMA.

L’injection intrapéritonéale (i.p.) est couramment utilisée pour administrer des médicaments, des colorants et des anesthésiques 11,12,13,14,15; Il a également été utilisé pour introduire des cellules hématopoïétiques pour l’hématopoïèse ectopique16 et pour transplanter des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse dans divers modèles murins 17,18,19,20,21. Cependant, il a été rarement utilisé pour établir des tumeurs malignes hématopoïétiques chez la souris, en particulier pour étudier la progression de la LMA.

La présente étude décrit la faisabilité de l’injection intraveineuse dans la génération de modèles murins AML, en plus de comparer l’efficacité de transplantation des populations de lignées négatives (Lin-) et Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) en tant que cellules donneuses. Ces résultats fournissent un moyen simple et efficace de générer des modèles expérimentaux de LAM et de leucémies myéloïdes connexes. Une telle méthode a le potentiel d’approfondir notre compréhension des mécanismes de la maladie et de fournir un modèle relativement facile pour tester des thérapies expérimentales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les expériences ont été préapprouvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie.

1. Préparation des tampons et des réactifs

  1. Préparer des plaques de gélose LB supplémentées en ampicilline (AP) (plaques stériles de 10 cm). Pour ce faire, dissoudre 10 g de bouillon LB avec de la gélose dans 400 mL d’eau distillée, remuer et porter le volume à 500 mL. Stériliser la solution par autoclavage, puis laisser refroidir la solution, ajouter 0,5 mL d’ampicilline (stock : 150 mg/mL) dans la solution et agiter pour mélanger. Ajouter immédiatement 18 mL de solution dans une plaque stérile de 10 cm près d’une lampe à alcool, laisser solidifier à température ambiante et conserver les plaques à l’envers à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
  2. Préparer le média LB en dissolvant 10 g de LB sans gélose dans 500 mL d’eau distillée. Stériliser la solution par autoclavage, laisser refroidir la solution, ajouter 0,5 mL d’ampicilline (stock : 150 mg/mL) dans la solution et agiter pour mélanger.
  3. Préparer un tampon d’écoulement en ajoutant 5 mL de pénicilline/streptomycine et 10 mL de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (hiFBS) dans 485 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS).
    REMARQUE: Pour désactiver FBS par chauffage, placez les bouteilles FBS décongelées dans un bain-marie à 56 ° C. Assurez-vous que les bouteilles ne se renversent pas ou ne sont pas immergées dans le bain-marie. La température est critique pour une dégradation complète; pour s’en assurer, attendez que la température se stabilise à 56 °C après avoir mis les bouteilles au bain-marie. Remuez doucement les bouteilles toutes les 10 minutes trois fois. Ne laissez pas le sérum incuber pendant plus de 30 minutes.
  4. Préparer le milieu d’entretien en ajoutant 50 mL de hiFBS, 5 mL de L-glutamine et 5 mL de pénicilline/streptomycine dans 440 mL de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Préparer les milieux de transfection en ajoutant 50 mL de hiFBS et 5 mL de L-glutamine dans 445 mL de milieu DMEM.
  5. Préparer un tampon de lyse des globules rouges (GR) en ajoutant 4,145 g deNH4Cl, 0,504 g de NaHCO3 et 16,81 mg d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans 500 mL d’eau distillée. Préparer le milieu modifié de Dulbecco (IMDM) incomplet d’Iscove en ajoutant 75 mL de hiFBS, 5 g d’albumine sérique bovine (BSA), 0,5 mL d’insuline à 10 mg/mL, 2,5 mL d’holotransférrine à 4 mg/mL, 3,5 μL de β-mercaptoéthanol, 5 mL de L-glutamine et 0,5 mL de ciprofloxacine dans 416,5 mL de milieu IMDM.
  6. Préparer 10 mL de 2x milieux IMDM, dans lesquels la concentration de cytokines est deux fois supérieure à la quantité dans 1x milieu IMDM, en ajoutant 10 μL de 50 ng/μL de mr-SCF, 20 μL de 25 ng/μL mr-Flt3L, 20 μL de 10 ng/μL mr-IL-6, 20 μL de 10 ng/μL mr-IL-3, 10 μL de 10 mg/mL d’insuline, et 50 μL d’holotransférrine à 4 mg/mL dans 9,87 mL de milieu IMDM incomplet.
    REMARQUE : Assurez-vous que le tampon d’écoulement, le tampon de lyse des globules rouges, les milieux d’entretien, les milieux de transfection et les milieux IMDM incomplets sont stérilisés par filtre avant utilisation.

2. Transformation plasmidique

  1. Décongeler 20 μL de cellules compétentes α-Select sur glace. Ajouter 1 μL (~2 ng) de plasmide22 MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 aux cellules compétentes décongelées et mélanger doucement en tapotant le tube. Incuber la réaction sur la glace pendant 30 min.
  2. Choc thermique du mélange par incubation pendant 40 s dans un bloc chauffant à 42 °C. Transférer immédiatement le tube sur de la glace pendant 2 min.
  3. Ajouter 1 mL de média LB (sans ampicilline) dans le tube et agiter à 37 °C et 200 rpm pendant 1 h.
  4. Centrifuger le tube à température ambiante à 500 x g pendant 4 min et jeter 0,9 mL de surnageant. Remettez le précipité en suspension dans les 0,1 mL restants de milieu LB.
  5. Étaler les cellules compétentes transformées sur des plaques de gélose AP LB préchauffées (37 °C). Incuber la plaque à l’envers à 37 °C pendant 12-16 h.
  6. Prélever une seule colonie et dépenser les cellules transformées dans 10 ml de milieu AP LB pendant une nuit à 37 °C et 200 tr/min.
  7. Ajouter 5 mL de cellules compétentes transformées épuisées à 500 mL de milieu AP LB dans une fiole et incuber la fiole pendant une nuit à 37 °C et 200 tr/min.
  8. Extraire le plasmide à l’aide d’une trousse d’extraction de plasmide conformément aux instructions du fabricant et remettre en suspension dans 0,5 mL d’eau ultrapure autoclavée. Quantifier le plasmide à l’aide d’un spectrophotomètre.

3. Transfection de cellules écotropes Phoenix (pECO)

  1. Culture de 2 x 106 pECO cellules/plaque dans un milieu d’entretien en plaques de 10 cm dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 à 37 °C. S’assurer que les cellules pECO sont maintenues dans une phase de croissance exponentielle et se divisent activement avant le passage.
  2. Lorsque les cellules deviennent confluentes à 80 %, laver les plaques avec 5 mL de DPBS deux fois, ajouter 1 mL de trypsine dans la plaque et incuber dans un incubateur humidifié à 5 % de CO 2 à 37 °C pendant2 min. Récolter les cellules avec 5 mL de milieu d’entretien dans un tube stérile de 15 mL et centrifuger à 4 °C et 400 x g pendant 3 min. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 5 mL de fluide d’entretien.
  3. Mélanger 10 μL de suspension cellulaire et 10 μL de bleu de trypan et charger 10 μL sur un hémocytomètre pour compter les cellules.
    Nombre total de cellules/ml = (nombre total de cellules comptées x facteur de dilution x 104 cellules/ml)/ nombre de carrés comptés)
    Ensemencer 2 x 10 6 cellules/plat dans des boîtes de6 cm en utilisant 5 mL de milieu d’entretien pour la transfection et cultiver les cellules dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C.
  4. Remplacer le milieu d’entretien par 5 mL de milieu de transfection lorsque les cellules deviennent confluentes à 50 % à 60 % après 18 h de culture.
  5. Conserver le réactif de transfection à température ambiante pendant au moins 30 minutes avant la transfection.
  6. Ajouter 5,5 μg de plasmide MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC322 à 0,5 mL de milieu DMEM ordinaire dans un tube stérile de 1,5 mL. Mélangez-le doucement en tapotant le tube et laissez-le reposer pendant 10 min.
  7. Ajouter 14,6 μL (3x la quantité de plasmide; v/p) de réactif de transfection dans le tube et tapoter doucement le tube toutes les 10 minutes trois fois.
  8. Ajouter uniformément le mélange goutte à goutte à toutes les zones de la vaisselle avec les cellules pECO dans les milieux de transfection. Déplacez doucement les plats vers l’avant et vers l’arrière 10 fois et latéralement 10 fois. Incuber les plats dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 à 37 °C pendant 48 h.
  9. Mesurer l’efficacité de la transfection par microscopie à florescence et cytométrie en flux pour la protéine fluorescente verte (GFP) comme décrit en22. Les cellules sont d’abord fermées sur FSC-A/FSC-H et FSC-A et SSC-A pour acquérir des singulettes. La population GFP+ est fermée sur le graphique FL1 en la comparant à des cellules non transfectées.
  10. Recueillir et filtrer les surnageants à travers un filtre à seringue de 0,45 μm dans un tube stérile de 50 mL. Utilisez immédiatement les surnageants pour la transduction ou congelez-les dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.
    REMARQUE: les cellules pECO doivent être correctement mélangées et ensemencées uniformément dans des plats. Laissez les cellules se répandre en déplaçant les plats vers l’avant et vers l’arrière 10 fois et latéralement 10 fois pendant l’ensemencement. Le nombre de cellules à ensemencer peut varier en fonction des variations de comptage. Pour trouver le nombre optimal de cellules d’ensemencement qui peut atteindre une confluence de 50% à 60% après 18 h de culture, il est utile d’ensemencer des cellules avec des dilutions en série.

4. Transduction lentivirale

  1. Euthanasier des souris C57BL6/J femelles CD45.1 âgées de 8 à 10 semaines (deux à trois souris donneuses par souris receveuse) dans une chambre de CO2 .
  2. Stérilisez tout le corps des souris avec de l’éthanol à 70%. Placez les souris sur un tampon chirurgical stérile sur une planche en polystyrène et épinglez les jambes à travers les coussinets de la souris.
  3. Coupez la peau au-dessus de la cavité abdominale à la ligne médiane et élargissez l’espace sous-cutané vers les pattes postérieures avec des ciseaux stériles à extrémité pointue.
  4. Étendez l’incision de la ligne médiane abdominale jusqu’aux chevilles. Élargissez l’espace sous-cutané sous les pattes postérieures avec les lames de ciseaux stériles à extrémité tranchante.
  5. Couper le tendon d’Achille avec des ciseaux stériles à extrémité pointue. Tenez le tendon à l’aide d’une pince avec des dents et coupez l’autre extrémité attachée au fémur pour enlever le muscle gastrocnémien.
  6. Coupez le tendon du quadriceps attaché au genou avec des ciseaux stériles à extrémité tranchante. Tenez le tendon à l’aide d’une pince avec des dents et coupez les têtes musculaires attachées au fémur pour enlever le muscle gastrocnémien.
  7. Coupez les autres muscles entourant le fémur à l’extrémité attachée au tibia avec des ciseaux stériles à extrémité pointue.
  8. Coupez la cheville avec des ciseaux stériles à extrémité tranchante, en veillant à ce que le tibia reste intact. Tenez l’extrémité distale du fémur à l’aide d’une pince avec des dents et coupez l’articulation de la hanche avec des ciseaux stériles à extrémité pointue, en veillant à ce que la tête fémorale reste intacte.
  9. Transférer les tibias et les fémurs dans un tampon d’écoulement dans un tube stérile de 15 mL.
  10. Séparez le tibia et le fémur en brisant le genou à la main. Retirez la rotule, le cartilage et les condyles fémoraux pour exposer le plateau tibial et le fémur distal à la main. Retirez les muscles à l’aide d’une gaze stérile, puis faites tremper les os dans un tampon d’écoulement.
  11. Couper le col du fémur et rincer les cellules de la moelle osseuse avec un tampon d’écoulement des deux extrémités du fémur à l’aide d’une seringue de 10 ml avec une aiguille de 23 g.
  12. Couper la malléole tibiale et rincer les cellules de la moelle osseuse avec un tampon d’écoulement des deux extrémités du tibia à l’aide d’une seringue de 10 ml avec une aiguille de 23 g.
  13. Disperser les cellules en pipetant de haut en bas à l’aide d’une seringue de 10 ml avec une aiguille de 18 g. Centrifuger la suspension unicellulaire à 4 °C et 400 x g pendant 3 min.
  14. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de tampon de lyse des globules rouges pour lyser les globules rouges pendant 3 min.
  15. Ajouter 5 mL de tampon d’écoulement pour arrêter la lyse et centrifuger la suspension cellulaire à 4 °C et 400 x g pendant 3 min.
  16. Placer une crépine cellulaire de 70 μm sur un tube stérile de 50 mL. Suspendre la pastille avec 5 ml de tampon d’écoulement, mélanger et passer à travers la crépine cellulaire pour recueillir les cellules.
  17. Ajuster la concentration de la cellule avec un tampon de débit à 1 x 108/mL dans des tubes en polypropylène à fond rond.
  18. Sélectionnez les cellules Lin- à l’aide d’un kit d’isolation de cellules hématopoïétiques de souris conformément aux instructions du fabricant.
  19. Gardez de côté trois tubes de 1 x 104 cellules dans 100 μL de tampon pour un témoin non coloré et deux témoins simples colorés par anticorps pour l’anti-souris conjugué APC CD117 (c-Kit) et l’anti-souris conjugué PE-Cy7 Ly-6A/E (Sca-1). Utiliser 1 μL d’anticorps (à partir de 0,2 mg/mL de stock) pour chacun des témoins colorés par des anticorps.
  20. Colorer le reste des cellules dans un tube avec les deux anticorps (4 μL de chacun à partir de 0,2 mg / mL de stock) dans 400 μL. Incuber les tubes sur de la glace dans l’obscurité pendant 0,5-1 h.
  21. Après coloration, laver les cellules en ajoutant 1 mL de tampon de débit et centrifuger à 4 °C et 400 x g pendant 3 min.
  22. Remettez en suspension les cellules pour le témoin non coloré et les témoins uniques colorés par anticorps dans 100 μL de tampon de débit. Resuspendre les cellules colorées par deux anticorps dans 1 mL de tampon de débit pour le tri.
  23. Trier les cellules souches hématopoïétiques (CSH) en tant que population LSK à l’aide d’un trieur de cellules tel que décrit dans23,24.
  24. Pendant la coloration, enduire une capsule stérile de 6 cm de rétronectine comme suit : Préparer 100 μg/mL de rétronectine dans du PBS et ajouter 0,9 mL de PBS et 0,1 mL de rétronectine dans une boîte de 6 cm. Enrober le plat d’une hotte stérile à température ambiante pendant 2 h. Ensuite, retirer la rétronectine et bloquer le plat avec 0,5 mL de BSA filtré à 2% (en PBS) pendant 30 min. Lavez le plat avec 5 ml de PBS deux fois et le plat est prêt pour la transduction.
  25. Centrifuger les CSH triées ou les cellules Lin- non triées à 4 °C et 400 x g pendant 3 min et les remettre en suspension dans 3 mL de 2x (de cytokines) de milieu IMDM et 3 mL de surnageant viral (généré à partir de l’étape 3.10) dans une boîte recouverte de rétronectine. Incuber la capsule dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 à 37 °C pendant 6 ou 24 h.
    NOTE: Dans la présente étude, les cellules Lin- ont été triées ou non triées selon le plan expérimental.

5. Transplantation en série (Figure 1)

REMARQUE : Les souris receveuses primaires étaient des souris C57BL6/J mâles âgées de 8 à 10 semaines (CD45.2). Ils ont reçu de l’eau ad libitum contenant des antibiotiques pour prévenir les infections digestives opportunistes, de 3 jours avant la transplantation à 7 jours après la transplantation. Les souris receveuses primaires ont été irradiées sublétalement (4,75 Gy) 3 heures avant la transplantation25. L’isoflurane n’a pas été appliqué aux souris par injection intrapéritonéale.

  1. Après transduction pendant 6 ou 24 h, récolter les cellules par centrifugation à température ambiante et 400 x g pendant 3 min. Utilisez la trypsine pour recueillir les cellules attachées au fond du plat si nécessaire. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans du PBS préchauffé. Déterminer le volume de PBS en fonction du nombre de receveurs (c.-à-d. 0,1 mL/souris et 0,5 mL/souris pour les receveurs recevant des injections rétro-orbitales et intrapéritonéales, respectivement).
  2. Placer les souris réceptrices irradiées sous létale dans une chambre d’isoflurane (le débit d’oxygène est réglé à 1,0 L/min et le vaporisateur d’isoflurane à 5 %). Appliquez une pommade humide sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Les souris sont prêtes pour d’autres procédures lorsque le rythme cardiaque tombe à 60 battements par minute.
  3. Injecter des cellules dans des souris receveuses primaires rétro-orbitalement (0,1 mL/souris)7 ou intrapéritonéale (0,5 mL/souris)26 avec une aiguille 27 G1/2. Observez les souris en continu jusqu’à ce qu’elles acquièrent suffisamment de conscience pour maintenir la position couchée sternale. Surveillez quotidiennement le bien-être des souris après la transplantation.
  4. Après 1 mois, prélever du sang chaque semaine par saignement rétro-orbitaire pour surveiller la leucocytose en évaluant la numération globulaire complète (FSC) sur un hémadet comme décrit ci-dessous.
    1. Placez la souris latéralement après l’anesthésie avec de l’isoflurane (le débit d’oxygène est réglé sur 1,0 L/min et le vaporisateur d’isoflurance est réglé sur 5%). Les souris sont prêtes pour d’autres procédures lorsque le rythme cardiaque tombe à 60 battements par minute.
    2. Proptose l’œil avec le pouce et l’index. Pénétrer dans le plexus du sinus veineux avec un tube capillaire hémacrit astérile à travers le canthus interne.
    3. Prélevez 20 à 25 μL de sang dans un tube de prélèvement sanguin EDTA et fermez les paupières pour arrêter le saignement. Appliquez une goutte de solution ophtalmique de sulfate de gentamicine sur l’œil.
  5. Au point final, lorsque les globules blancs (GB) atteignent 4 x 10 4 cellules/μL, euthanasier la souris dans une chambre de CO2 et isoler les cellules de la moelle osseuse en rinçant les fémurs et les tibias avec un tampon d’écoulement, suivie d’une lyse des globules rouges comme mentionné à l’étape4.
  6. À la fin, récoltez les splénocytes comme mentionné ci-dessous.
    1. Euthanasier la souris dans une chambre CO2 . Placez les souris sur un tampon chirurgical stérile sur une planche en polystyrène et épinglez les jambes à travers les coussinets de la souris. Stérilisez tout le corps des souris avec de l’éthanol à 70%.
    2. Coupez la peau et les muscles à la ligne médiane pour exposer la cavité abdominale avec des ciseaux stériles à extrémité pointue. Isolez la rate avec des ciseaux stériles à extrémité tranchante et placez-la dans un tampon d’écoulement dans un tube stérile de 15 mL.
    3. Mailler la rate à travers une passoire stérile de 70 μm dans un plat de 6 cm avec 3 mL de tampon d’écoulement. Transférer les cellules de la capsule dans un tube stérile de 15 mL et centrifuger la suspension unicellulaire à 4 °C et 400 x g pendant 3 min.
    4. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de tampon de lyse des globules rouges pour lyser les globules rouges pendant 3 min. Ajouter 5 mL de tampon d’écoulement pour arrêter la lyse et centrifuger la suspension cellulaire à 4 °C et 400 x g pendant 3 min.
    5. Placer une crépine cellulaire de 70 μm sur un tube stérile de 50 mL. Suspendre la pastille avec 5 mL de tampon d’écoulement, mélanger et passer à travers la crépine cellulaire pour recueillir les cellules.
  7. Identifier les cellules primaires (1°) de LAM en colorant les splénocytes et les cellules de la moelle osseuse avec un anticorps anti-souris CD45.1 conjugué FITC et en les détectant sur un cytomètre en flux. Les cellules sont d’abord fermées sur FSC-A/FSC-H et FSC-A et SSC-A pour acquérir des singulettes. La population de CD45,1+ est fermée sur la parcelle FL1 en la comparant à des cellules non colorées.
  8. Pour la transplantation secondaire (2°), remettre en suspension les cellules spléniques de LAM CD45.1 des receveurs 1° r.o. dans PBS (0,1 mL/souris) et les injecter rétro-orbitalement à des souris C57BL6/J mâles CD45.2. Parallèlement, remettre en suspension les cellules spléniques AML de receveurs 1° i.p. dans PBS (0,5 mL/souris) et les injecter intrapéritonéale à des souris mâles Ai14TdTomato 27 âgées de 8 à 12 semaines.
  9. Pour la transplantation tertiaire (3°), remettre en suspension des cellules de LAM isolées de la moelle osseuse ou de la cavité péritonéale de receveurs 2° i.p. et les injecter intrapéritonéale à des souris Ai14TdTomato (RFP+) ou CD45.2, respectivement. Resuspendre les cellules de LMA isolées de la cavité péritonéale des receveurs de 2° r.o. et les transplanter par injection r.o. chez des souris Ai14TdTomato (RFP+).
    NOTE: Pour la transplantation 2°, nous avons identifié la progression de la maladie chez les receveurs 2° en surveillant le CBC dans le sang périphérique. Pour confirmer davantage l’établissement de la LMA, nous avons recueilli du sang périphérique entier par ponction cardiaque ainsi que de la moelle osseuse, de la rate et du foie. De plus, nous avons effectué un lavage i.p. pour collecter les cellules i.p. Des suspensions unicellulaires ont été acquises à partir de moelle osseuse, de rate et de lavage intraveineux comme décrit ci-dessus. Les cellules de ces sites ont été analysées sur un cytomètre en flux après la lyse des globules rouges. Les cellules de LAM ont été reconnues comme des cellules RFP négatives (RFP-). Pour la transplantation 3°, nous avons échantillonné des cellules de sang, de moelle osseuse, de rate, de foie et d’IP au point final ; Les cellules RFP ou CD45.1+ ont été identifiées comme des cellules AML et examinées par cytométrie en flux. Aucune irradiation ou eau antibiotique n’a été administrée aux souris réceptrices à 2° et 3°.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la transduction virale MLL-AF9 dans les CSH de la moelle osseuse et des transplantations en série (1°, 2° et 3°). Le tri des populations doublement positives Sca-1 et c-Kit à l’aide d’un trieur de cellules indiqué dans la zone d’ombrage en pointillés est considéré comme facultatif, si les ressources le permettent. La figurine a été créée à l’aide de BioRender (https://biorender.com/). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Lavage intrapéritonéal

  1. Injecter 5 mL de milieu IMDM incomplet dans la cavité péritonéale deux fois pour recueillir les cellules dans un tube stérile de 15 mL. Centrifuger la suspension cellulaire à température ambiante et 400 x g pendant 3 min. Transplantation de cellules de LAM (4 x 105 cellules/souris) de la cavité péritonéale de receveurs à 2° par injection intraveineuse chez des souris receveuses de CD45,2 à 3° (n = 3).

7. Analyse histologique 28

  1. Isoler la rate, le foie et les fémurs des souris lors de l’euthanasie. Fixez-les dans 5 ml de formol tamponné à 10 % (v/v). Échantillonnez la rate et le foie de homologues sains pour des comparaisons.
  2. Intégrez les tissus fixes dans la paraffine et coupez-les en sections. Colorer les sections avec des colorants à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E).
  3. Obtenez les images au microscope à un grossissement 20x installé avec un logiciel compatible pour l’analyse histologique.

8. Effectuer une PCR semi-quantitative (qPCR)

  1. Préparer les ARN dans le réactif à ARN conformément aux instructions du fabricant.
  2. Utilisez des ARN de 0,5 à 1,0 μg pour synthétiser l’ADNc à l’aide d’un kit de transcription inverse de l’ADNc conformément aux instructions du fabricant.
  3. Utilisez l’ADNc pour effectuer la qPCR à l’aide d’un kit qPCR et exécutez les échantillons dans un système qPCR. Utilisez les sondes TaqMan pré-validées suivantes : KMT2A (ML ; Ref Seq: ARN ribosomique NM_001197104(2), IDT)29 et 18S (Hs99999901_s1).
  4. Chargez les amplicons KMT2A et 18S sur un gel d’agarose à 2% pour visualiser l’expression. Acquérir des images dans un imageur installé avec le logiciel compatible.

9. Traitement des données

  1. Analysez les résultats à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique et présentez les résultats sous forme de moyenne ± SEM. Générez des figures à l’aide d’un outil d’illustration commerciale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Comparaison de l’efficacité de transplantation de cellules de LAM murines par les voies de transplantation r.o. et i.p.
Auparavant, l’établissement de 1° AML a été rapporté chez des souris receveuses transplantées rétro-orbitalement avec des cellules LSK transduites MLL-AF9, et la transplantabilité de cellules AML 1° a été démontrée par transplantation en série30. La présente étude est la première à évaluer la possibilité d’utiliser des cellules Lin- de moelle osseuse pour effectuer une transplantation. La présence d’une leucocytose aberrante (Figure 2A) et l’infiltration accrue de cellules leucémiques (CD45.1+) dans la moelle osseuse et la rate (Figure 2B) appuient la faisabilité de l’utilisation de cellules Lin- de la moelle osseuse pour générer une LAM de 1°. Pour comparer la période d’induction de la maladie, deux souris donneuses par receveur ont été euthanasiées pour isoler les cellules LSK ou Lin. D’après les résultats, aucune différence significative n’a été observée chez les receveurs de 1° transplantés avec des cellules LSK ou Lin- (Figure 2C).

Lors de l’examen des métastases de 1° AML, il a été découvert que les cellules AML se propagent dans la cavité abdominale des receveurs 1° par les cellules Lin- transduites par MLL-AF9 (Figure supplémentaire 1). Cette découverte a inspiré l’exploration pour tester si l’injection intraveineuse pouvait être adoptée dans la génération de LAM murine, qui pourrait servir de nouvelle voie de transplantation plus facile. En raison du succès de l’utilisation de la population Lin- de la moelle osseuse comme cellules donneuses de LAM, les données actuelles ont confirmé l’établissement de 1° AML par injection i.p. de cellules Lin- de moelle osseuse transduites MLL-AF9, comme on le voit sous forme de leucocytose (Figure 2D) et de présence de cellules AML (CD45.1+) dans la moelle osseuse et la rate de souris receveuses (Figure 2E). Cependant, la transplantation par injection intraveineuse a pris plus de temps à développer une LAM que par injection r.o., même si les receveurs ont reçu un nombre égal de cellules de donneur (Figure 2F). En outre, les souris transplantées rétro-orbitalement avec plus de cellules Lin- (5,125 x 10 6 cellules/souris) sur la figure 2F semblaient développer une LAM plus rapidement que celles transplantées avec moins de cellules Lin- (3,69 x 106 cellules/souris) sur la figure 2C.

En raison de l’incohérence inhérente au temps d’incubation chez les receveurs de LMA à 1° (figure 2F), on a tenté de tester la transplantation intraveineuse chez des receveurs de 2°. Pour la transplantation 2°, l’injection intra-péritonéale a été réalisée avec 8 x 105 cellules AML isolées de receveurs intra-péritonéaux transplantés 1°. Les receveurs 2° ont présenté une leucocytose (Figure 2G) et une hépatosplénomégalie significative (Figure 2H) moins d’un mois après la transplantation, une nette progression par rapport à la transplantation 1°. Conformément à cette observation, des cellules de LAM (RFP-) ont également été détectées dans le sang périphérique, la moelle osseuse et la rate (figure 2I), ainsi que dans la cavité péritonéale (figure supplémentaire 1). En outre, l’expression de l’oncogène KMT2A dans le sang, la rate et le foie de receveurs de 2° a également confirmé la génération réussie de la LAM (Figure 2J). De plus, l’analyse histologique a également démontré l’infiltration de cellules leucémiques dans la rate et le foie de souris transplantées intrapéritonéales (Figure 2K). Ces données confirment que les cellules de LAM générées par injection intraveineuse à 1° sont transplantables chez les receveurs à 2°. De plus, l’injection par injection intraveineuse de 8 x 10 5 cellules de LAM par souris chez les receveurs a permis d’obtenir une greffe comparable à l’injection de 8 x 105 cellules de LAM par souris chez les receveurs (Figure 2L).

L’une des principales caractéristiques des LSC est la transplantabilité en série; ainsi, pour mieux vérifier l’établissement de la LAM chez les receveurs de 2°, ce protocole a tenté de vérifier si les cellules AML issues de la transplantation 2° i.p. restaient transplantables en série, ainsi que la faisabilité de la greffe de cellules souches par injection intraveineuse dans la transplantation 3°. Des cellules de LAM isolées de la moelle osseuse (8 x 10 5 cellules leucémiques/souris dans 0,5 mL de PBS) ou d’un lavage intra (4 x 10 5 cellules leucémiques/souris dans0,5 mL de PBS) de receveurs à 2° ont été injectées à des receveurs de 3°. Bien qu’ayant été transplantées avec des cellules de donneurs générées à partir de différentes sources, les souris receveuses 3° présentaient des signes aigus de LAM (dans les 3 et 4 semaines pour les cellules de la moelle osseuse et les cellules IP, respectivement), y compris la leucocytose (Figure 3A) et l’hépatosplénomégalie (Figure 3B), la présence de cellules leucémiques dans le sang, la moelle osseuse et la rate (Figure 3C) et l’expression de KMT2A (Figure 3D ). L’observation histologique du fémur et de la rate a également démontré l’infiltration de cellules leucémiques (Figure 3E). À titre de comparaison, l’injection r.o. de splénocytes leucémiques (4 x 105 cellules) provenant de receveurs à 2° était également capable d’engendrer et de développer une LAM chez des receveurs de 3°, caractérisée par une leucocytose (figure supplémentaire 2A), une hépatosplénomégalie (figure supplémentaire 2B) et l’infiltration de cellules de LAM dans le sang, la moelle osseuse et la rate (figure supplémentaire 2C).

La transplantation intra-péritonéale est efficace même pour une transplantation 3° de cellules AML
Par rapport aux transplantations 2° et 3°, on pourrait facilement conclure que la transplantation 3° (Figure 3F) progressait beaucoup plus rapidement que la transplantation 2° (Figure 2L) pour les injections i.p. et r.o. Notamment, l’injection par injection intraveineuse de 4 x 105 cellules de LMA/souris a développé une LAM plus tardive que l’injection r.o. du même nombre de cellules de LAM pendant 6 jours (figure 3F), ce qui indique peut-être le temps consacré à la migration de la cavité péritonéale à la niche de la moelle osseuse. Fait intéressant, la fréquence élevée des cellules leucémiques dans la cavité péritonéale (figure supplémentaire S2) chez les souris transplantées 3° suggère que la cavité péritonéale peut également fournir la niche pour l’expansion rapide des cellules leucémiques. Par ailleurs, la présence de cellules leucémiques dans la cavité péritonéale de receveurs 1° et 3° transplantés rétro-orbitalement indiquait la circulation mutuelle des cellules leucémiques entre la cavité péritonéale et le système sanguin, justifiant la transplantation i.p. Collectivement, ces résultats valident l’utilisation de l’injection intraveineuse dans la transplantation en série de LAM.

Figure 2
Figure 2 : Génération d’un modèle murin de LAM en transplantation 1° et 2°. (A) Formule sanguine complète (CBC; 1 x 10 3 cellules/μL de sang), globule blanc, neutrophiles (NE), lymphocytes (LY), monocytes (MO), éosinophiles (OE) et basophiles (BA) profil de souris receveuses 1° transplantées rétro-orbitalement avec des cellules Lin- de moelle osseuse transduites MLL-AF9 (5,125 x 106 cellules/souris) par hémédace (n =3). (B) Analyse cytométrique en flux de la fréquence des cellules AML (CD45.1+) dans la moelle osseuse et la rate de souris recevrices de 1° CD45.2 transplantées rétro-orbitalement avec des cellules Lin- (5,125 x 106 cellules/souris) transduites par MLL-AF9 (n = 3). (C) Durée d’incubation de 1° AML chez les receveurs transplantés rétro-orbitalement avec des cellules LSK de moelle osseuse transduites MLL-AF9 (3,16 x 105 cellules/souris isolées de deux donneurs, n = 4) ou des cellules Lin- (3,69 x 106 cellules/souris isolées de deux donneurs, n = 3). Chaque receveur a reçu des cellules isolées de deux donneurs. (D) Analyse CBC de souris receveuses 1° transplantées intrapéritonéale avec des cellules Lin- de moelle osseuse transduites MLL-AF9 (5,125 x 106 cellules/souris) par hémavet (n = 4). (E) Analyse cytométrique en flux de la fréquence des cellules AML (CD45.1+) dans la moelle osseuse et la rate de souris recevrices de 1° CD45.2 transplantées intrapéritonéale avec des cellules Lin- de moelle osseuse transduites MLL-AF9 (5,125 x 106 cellules/souris, n = 3). (F) Durée d’incubation de 1° LAM chez les receveurs transplantés rétro-orbitalement (n = 3) ou intrapéritonéaux (n = 3) avec des cellules Lin- de moelle osseuse transduites MLL-AF9. Chaque receveur a reçu la même quantité de cellules de donneur (5,125 x 106 cellules/souris). (G) Analyse CBC de receveurs de 2° transplantés intrapéritonéale avec des cellules de LAM (8 x 105 cellules/souris) isolées de la rate de 1° i.p. transplantés par hémadet (n = 3). (H) Poids (mg) de la rate et du foie de souris receveuses à 2° transplantées intrapéritonéale avec des cellules AML (8 x 105 cellules/souris) isolées de la rate des receveurs transplantés au 1° i.p. Les zones ombragées représentent les fourchettes de poids normales de la rate et du foie. Image représentative de la rate et du foie de souris receveuses à 2° et de homologues sains. (I) Analyse cytométrique en flux de la fréquence des cellules AML (RFP-) dans le sang, la moelle osseuse et la rate de souris receveuses RFP+ 2° transplantées intrapéritonéale avec des cellules AML (8 x 105 cellules/souris) isolées de la rate de 1° i.p. receveurs transplantés (n = 3). (J) Expression génique de KMT2A et 18S présentée sous la forme d’une bande d’ADN. Les ARN ont été isolés dans le sang, la moelle osseuse, la rate et le foie de souris receveuses de 2° transplantées intrapéritonéale avec des cellules AML (8 x 105 cellules/souris) isolées de la rate des receveurs transplantés 1° i.p. (K) Images représentatives des changements histologiques dans la rate (panneau de gauche) et le foie (panneau de droite) de 2° receveurs transplantés intrapéritonéale avec des cellules AML (8 x 105 cellules/souris) isolées de la rate de 1° i.p. receveurs transplantés et homologues sains. (L) Durée d’incubation de 2° LAM chez les receveurs transplantés rétro-orbitalement (4 x 10 5/souris, n = 9) ou intrapéritonéaux (8 x 105/souris, n = 4) avec des cellules de LAM isolées de receveurs transplantés 1° r.o. et i.p., respectivement. Les résultats sont moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : 3° transplantation de cellules AML par transplantation i.p. (A-E) 3° RFP+ ou CD45.2 souris réceptrices. A gauche : injection intraveineuse de cellules AML (8 x 105 cellules/souris) provenant de la moelle osseuse de receveurs 2°. A droite : injection intraveineuse de cellules de LAM (4 x 105 cellules/souris) provenant de la cavité péritonéale (p.i.) de receveurs 2° (n = 3). (A) Analyse CBC de souris receveuses 3° par hémavet. (B) Poids (mg) de la rate et du foie des souris receveuses à 3°. Les zones ombragées représentent les fourchettes de poids normales de la rate et du foie. (C) Analyse cytométrique en flux de la fréquence des cellules de LAM (à gauche : RFP-; à droite : CD45.1+) dans le sang, la moelle osseuse et la rate de souris receveuses à 3°. (D) Expression génique de KMT2A et 18S présentée sous la forme d’une bande d’ADN. Les ARN ont été isolés dans le sang, la moelle osseuse, la rate et le foie de souris receveuses à 3°. (E) Images représentatives des changements histologiques dans la rate (panneau de gauche) et le fémur (panneau de droite) de souris receveuses à 3°. (F) Durée d’incubation de 3° LAM chez les receveurs transplantés rétro-orbitalement (4 x 10 5 cellules/souris, n = 3) ou intrapéritonéaux (4 x 105 cellules/souris, n = 3) avec des cellules de LAM isolées de receveurs transplantés 2° r.o. et i.p., respectivement. Les résultats sont moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Analyse cytométrique en flux de l’infiltration de cellules AML dans la cavité péritonéale. Fréquence des cellules de LAM dans le lavage péritonéal de 1° receveurs transplantés rétro-orbitalement (1° RO, n = 2), 2° receveurs transplantés intra-péritonéale (2° IP, n = 2) et 3° receveurs transplantés par injection intra-IP avec des cellules de LAM de moelle osseuse (3° BM-IP, n = 3) et i.p. cellules AML (3° IP-IP, n = 3), ainsi que 3° receveurs transplantés par injection r.o. de splénocytes AML (3° SP-RO, n = 3). Les résultats sont moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : 3° transplantation de splénocytes AML par injection r.o. (A) Analyse CBC de souris receveuses à 3° transplantées rétro-orbitalement avec des cellules AML (4 x 105 cellules/souris) provenant de la rate de souris receveuses à 2°. (B) Poids (mg) de rate et de foie de souris receveuses transplantées rétro-orbitalement à 3°. Les zones ombragées représentent les fourchettes de poids normales de la rate et du foie. (C) Fréquence des cellules AML (RFP-) dans le sang, la moelle osseuse et la rate de souris receveuses transplantées rétro-orbitalement à 3° (n = 3). Les résultats sont moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ces études décrites ci-dessus fournissent des preuves à l’appui que la transplantation de cellules Lin- est comparable à celle de cellules LSK dans la génération de LAM murine de 1°. En outre, les données actuelles montrent également que l’injection intraveineuse est une méthode efficace et pratique pour établir la LAM murine par rapport à l’injection intraveineuse (ou r.o.).

En plus des cellules LSK, d’autres populations telles que le progéniteur granulocytaire-monocytaire (GMP), le progéniteur lymphoïde commun (CLP) et le progéniteur myéloïde commun (CMP) ont été substituées en tant que cellules donneuses dans la génération de LAM induite par MLL-AF9 à 1° avec différentes durées d’incubation31,32, bien que la comparaison quantitative fasse défaut pour suggérer le choix optimal. Dans la présente étude, Lin- et LSK isolés à partir des mêmes souris donneuses n’avaient aucune différence apparente dans la génération de LMA induite par MLL-AF9 à 1°, étant donné que les cellules progénitrices myéloïdes transduites (Sca-1-) étaient capables d’initier AML33. Compte tenu des dépenses et du temps requis pour le tri basé sur la cytométrie en flux de la population LSK, ces études soutiennent l’utilisation de la population Lin- comme cellules donneuses pour la transplantation 1°. Ainsi, les étapes de 4.19 à 4.23 dans ce protocole ne sont pas nécessaires mais facultatives, et n’affectent pas le résultat final.

En termes de quantité de souris donneuses dans 1° transplantation, un donneur a pu fournir ~1,0 à 1,5 x 105 cellules LSK, et un receveur transplanté avec cette quantité de cellules LSK a développé 1° AML en environ 4 mois. Cependant, augmenter le nombre de donneurs pour accumuler des cellules LSK jusqu’à ~3 x 105 cellules par receveur peut raccourcir la durée d’incubation à ~70 jours. Ainsi, deux donneurs devraient suffire pour générer rapidement 1° AML. Ce principe s’applique également aux cellules Lin, dans lesquelles ~1,0 à 2,5 x 106 cellules Lin- peuvent être isolées de chaque souris donneuse. Cependant, lorsque la densité cellulaire du donneur a été augmentée, le délai d’exécution de la leucémogenèse était considérablement plus court. Ces données doivent être prises en considération pour décider du nombre de souris donneuses à l’étape 4.1.

Par rapport à l’injection r.o., l’injection i.p. a pris environ ~20 jours de plus pour développer la LAM 1° à part entière, mais cette limitation a été surmontée en augmentant le nombre de cellules donneuses pour l’injection i.p. Malgré cette différence apparente, les deux méthodes ont montré un taux de greffe similaire (>80%) dans la moelle osseuse et la rate au point final, indiquant l’applicabilité générale de l’injection intraveineuse dans la transplantation 1° dans la LMA. La période d’incubation relativement longue pour la transplantation 1°, ainsi que sa progression imprévisible de la maladie en termes d’incohérence de la latence chez les souris receveuses, constituent une limitation majeure pour les expériences contrôlées, telles que les interventions pharmacologiques et les études mécanistes. Ainsi, il est recommandé d’utiliser des cellules leucémiques à 1° pour la transplantation lors de transplantations en série ultérieures, typiquement 2° (Figure 1). Étant donné que jusqu’à 3 x 108 cellules leucémiques dans la rate (et 6 x 107 cellules dans la moelle osseuse) peuvent être générées à partir de chaque 1° receveur à l’extrémité, ce qui serait suffisant pour effectuer une transplantation de 2° sur plus de 300 souris, il est suggéré de transplanter autant de cellules que possible à moins de receveurs pour raccourcir la latence et augmenter le taux de greffe de 1° transplantation, ce qui est important pour l’étape 4.1 et l’étape 5.2.

Compte tenu de sa latence constante et courte, la transplantation 2° peut être utilisée dans de multiples applications, y compris les expériences in vivo mentionnées ci-dessus. En outre, l’injection intraveineuse facilite également la procédure de transplantation abondante pour les techniciens inexpérimentés. Par rapport à la voie d’injection r.o., qui génère généralement la LAM en 3 semaines, la méthode d’injection par IP a pris un peu plus de temps (~ 4 semaines) avec le même nombre de cellules de donneur pour établir une LAM complète. Même si c’est relativement plus facile et plus pratique, l’augmentation du nombre de cellules transplantées ou la réalisation d’une greffe tertiaire peut également accélérer la progression de la LAM par injection intraveineuse.

En résumé, la principale limite de cette technique est le temps d’incubation plus long que l’injection intraveineuse avec la même quantité de cellules de donneur dans les transplantations 1° et 2°. Cependant, il peut être facilement surmonté en augmentant le nombre de cellules à transplanter. Outre les avantages évidents, cette technique a également d’autres applications. Par exemple, la capacité d’utiliser des méthodes de transplantation par IP peut également servir à cultiver régulièrement ces cellules sans avoir besoin de milieux de culture in vitro coûteux. Pour étendre l’application de cette technique à d’autres hémopathies malignes, telles que la leucémie lymphoïde et la leucémie myéloïde chronique, ainsi qu’aux xénogreffes dérivées de patients, d’autres études doivent être menées à l’avenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Flow Cytometry Core Facility du Huck Institute et l’Histopathology Core Facility du Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, pour leur soutien technique en temps opportun. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Institute for Cancer Research (KSP), du Penn State College of Agricultural Sciences, du Penn State Cancer Institute, du projet USDA-NIFA 4771, numéro d’acquisition 00000005 à K.S.P. et R.F.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
a-Select competent cells  Bioline BIO-85027
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma Aldrich Cat# A-9434
Ampicillin Sigma Aldrich Cat# A0797
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade Gemini bio-products Cat# 700-102P
Ciprofloxacin HCl GoldBio.com Cat# C-861-100
DMEM, high glucose, no glutamine Gibco Cat# 11960-044
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning Cat# 21-031-CV
EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade Calbiochem Cat# 324503
Fetal Bovine Serum - Premium Select Atlanta Biologicals Cat# S11550
Holo-transferrin, bovine Sigma Aldrich Cat# T1283
Insulin solution human Sigma Cat# I-9278
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco Cat# 12440-053
L-glutamine 200 mM (100×) solution HyClone, Gelifesciences Cat# SH30034.01
LB broth, Lennox NEOGEN Cat #: 7290A
LB Broth with agar (Miller) Sigma Aldrich Cat# L-3147
Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) Miltenyi Biotec Cat# 130-124-211
Mouse Interleukin-3 (IL-3) Gemini bio-products Cat# 300-324P
Mouse Interleukin-6 (IL-6) Gemini bio-products Cat# 300-327P
Mouse Stem Cell Factor (SCF) Gemini bio-products Cat# 300-348P
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Corning Cat# 30-002-CI
Phenix-Eco (pECO) cells ATCC CRL-3214
Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular JT. Baker Cat# 2940-01
Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) BioLegend  Cat # 105812
Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) BD Pharmingen Cat# 558162
Recombinant Murine Flt3-Ligand Pepro Tech, INC. Cat# 250-31L
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment TaKaRa Cat# T100A
TransIT-293 Reagent MirusBio Cat# MIR 2705
TRI Reagent Sigma Aldrich Cat# T9424
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco Cat # 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco Cat# 25200-056
β-Mercaptoethanol (BME) Sigma Aldrich Cat# M3148
Commercial Assays 
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit  StemCell technologies Cat# 19856A
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher  Cat# 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMix Quanta Bio Cat# 95051-500
Plasmid Maxi Kit (25) Qiagen Cat#:12163
Animals
Ai14TdTomato mice Jackson Laboratory Strain # 007914
CD45.1 C57BL6/J mice  Jackson Laboratory Strain # 002014
CD45.2 C57BL6/J mice  Jackson Laboratory Strain # 000664
Instruments and Softwares
Adobe illustrator  Version 25.2.3
BD accuri C6 flow cytometer BD Biosciences
FlowJo 10.8.0 BD
GeneSys software program  Version 1.5.7.0
GraphPad Prism version 6  GraphPad
Hemavet 950FS  Drew Scientific
7300 Real time PCR system Applied Biosystems
Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging G:Box Chemi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
  3. Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
  4. Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
  5. Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
  6. Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
  7. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  8. Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
  9. Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
  10. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
  11. Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
  12. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
  13. Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
  14. Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
  15. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  16. Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
  17. Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
  18. Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
  19. Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
  20. Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
  21. Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
  22. Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
  23. Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
  24. Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
  25. Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
  26. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  27. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  28. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  29. Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
  30. Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
  31. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  32. Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
  33. Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).

Tags

Recherche sur le cancer numéro 191
Transplantation intrapéritonéale pour générer une leucémie myéloïde aiguë chez la souris
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qian, F., Arner, B. E., Nettleford,… More

Qian, F., Arner, B. E., Nettleford, S. K., Paulson, R. F., Prabhu, K. S. Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice. J. Vis. Exp. (191), e64834, doi:10.3791/64834 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter