Este protocolo descreve um método simples e minimamente invasivo para transplante e obtenção de imagens de células NIT-1 em camundongos imunodeficientes combinados não-obesos diabéticos (NOD)-graves desafiados com esplenócitos purificados de camundongos NOD espontaneamente diabéticos.
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Artigo de método
Monitoramento Bioluminescente da Sobrevida do Enxerto em Modelo de Transferência Adotiva de Diabetes Autoimune em Camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O diabetes tipo 1 é caracterizado pela destruição autoimune das células beta produtoras de insulina do pâncreas. Um tratamento promissor para essa doença é o transplante de células-tronco derivadas de células-tronco. Modificações genéticas, no entanto, podem ser necessárias para proteger as células transplantadas da autoimunidade persistente. Modelos de camundongos diabéticos são uma ferramenta útil para a avaliação preliminar de estratégias para proteger células transplantadas do ataque autoimune. Descrito aqui é um método minimamente invasivo para transplante e imagem de enxertos celulares em um modelo de transferência adotiva de diabetes em camundongos. Neste protocolo, células da linhagem beta pancreática murina NIT-1 expressando o transgene luciferase luciferase luc2 são transplantadas subcutaneamente em camundongos imunodeficientes diabéticos não obesos (NOD)-imunodeficientes combinados graves (scid). Esses camundongos são injetados simultaneamente por via intravenosa com esplenócitos de camundongos NOD espontaneamente diabéticos para transferir autoimunidade. Os enxertos são imageados em intervalos regulares por meio de imagens bioluminescentes não invasivas para monitorar a sobrevivência celular. A sobrevivência das células mutantes é comparada à das células controle transplantadas no mesmo camundongo.
Introdução
O diabetes tipo 1 (DM1) é causado pela destruição autoimune das células beta produtoras de insulina do pâncreas. A perda de massa da célula beta resulta em deficiência de insulina e hiperglicemia. Os pacientes com DM1 dependem de múltiplas injeções diárias de insulina exógena e experimentam episódios de hiperglicemia grave e hipoglicemia ao longo de suas vidas. As complicações relacionadas a esses episódios incluem retinopatia diabética, diminuição da função renal eneuropatia1.
As injeções de insulina são um tratamento, mas não uma cura para a DM1. A substituição da massa perdida de células beta, no entanto, tem o po....
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Protocolo
Figura 1: O fluxo de trabalho para transplante e imagem de enxertos em um modelo de transferência adotiva de diabetes em camundongos. Células NIT-1 expressando o transgene vagalume luciferase (luc2) são transplantadas subcutaneamente em camundongos NOD-scid. Os camundongos são injetados simultaneamente....
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Resultados
Uma visão geral do protocolo é descrita na Figura 1. A sobrevivência de duas linhagens celulares, como um mutante e um controle não-alvo, pode ser comparada, ou a sobrevivência de uma linhagem celular pode ser medida em vários grupos de camundongos, como camundongos tratados com drogas versus controles tratados com veículo. A Figura 3A mostra três camundongos NOD-scid fêmeas de 8 semanas de idade transplantados com uma linhagem celular não-alvo (esquerda) e uma .......
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Discussão
A DM1 é uma doença devastadora para a qual não existe cura atualmente. A terapia de reposição de células beta oferece um tratamento promissor para pacientes com essa doença, mas a barreira crítica a essa estratégia é o potencial de ataque autoimune recorrente contra as células beta transplantadas. A engenharia genética de células SC-beta para reduzir sua visibilidade imunológica ou suscetibilidade é uma solução potencial para este problema. Descrito aqui é um protocolo para imagens não invasivas de células beta transplan.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos à Dra. Erica P. Cai e ao Dr. Yuki Ishikawa pelo desenvolvimento do método descrito neste protocolo (ver ref. 11). A pesquisa nos laboratórios de S.K. e P.Y. é apoiada por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Instituto de Células-Tronco de Harvard e Fundação Beatson. T.S. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK) (T32 DK007260-45), e K.B. foi apoiado em parte por uma bolsa da Fundação Mary K. Iacocca.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% de tripsina, 0,53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Isolado clonal de crescimento rápido e altamente transfectável derivado de células renais embrionárias humanas transformadas com o antígeno T grande SV40 |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Almofadas de preparação de álcool, álcool isopropílico 70% | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| Seringa BD 5ml Ponta Luer-Lok | BD | 309646 | |
| BD Agulha PrecisionGlide 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Seringa Ponta Deslizante | BD | 309659 | |
| Blasticidina S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Filtro de células premium SureStrain, 70 µ m, estéril | Southern Labware | C4070 | Ou use filtro estéril semelhante com tamanho de poro de 40-70um |
| CellDrop contador de células automatizado | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Ou use dispositivo contador de células semelhante |
| Corning 100 mL Penicilina-Estreptomicina Solução, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Pipetas de Aspiração Descartáveis, Poliestireno, Estéril, Capacidade=2 mL | VWR | 414004-265 | Ou use pipeta de aspiração semelhante |
| D-Luciferina, sal de potássio, grau de biologia molecular, pó, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, glicose alta, piruvato, sem glutamina | Gibco | 10313039 | |
| tubos Falcon BD, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Soro Bovino Fetal | Gibco | 10437-028 | |
| Pinça premium para tecidos, 1 x 2 dentes 5 pol, Aço Alemão | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Tira de teste de glicose na urina | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Ou use uma tira de teste semelhante para medições de glicose na urina/sangue |
| GlutaMAX– 1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Lâmpada de aquecimento infravermelho | Cole Parmer | 03057-00 | Ou use lâmpada infravermelha semelhante |
| Seringa de insulina 0,5 mL, U-100 29 G 0,5 em | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurano, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| Sistema de imagem in vivo IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 Instrumento para coleta não invasiva de imagens bioluminescentes de células transplantadas Software de | |
| análise de imagem viva | Perkin Elmer | 128113 | Software para coletar e quantificar sinais bioluminescentes |
| Tubos de microcentrífuga seal-rite, 1,5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Ou use tubos de microcentrífuga estéreis semelhantes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Linha de células beta pancreáticas derivada de camundongos NOD/Lt |
| NOD. Cg-Prkdcscid/J | O Laboratório Jackson 001303 | camundongos homozigotos para a grave mutação espontânea de deficiência imunológica combinada Prkdcscid, comumente referido como scid, são caracterizados por ausência de células T funcionais e células B, linfopenia, hipogamaglobulinemia e um microambiente hematopoiético normal. | |
| NOD/ShiLtJ | O Laboratório Jackson | 001976 | A linhagem de camundongos NOD/ShiLtJ (comumente chamada de NOD) é um modelo poligênico para diabetes tipo 1 autoimune |
| PBS, pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | Sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Plasmídeo feito internamente | disponível mediante solicitação | Veja o Arquivo Suplementar 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polietilenimina, Linear, MW 25.000, Grau de Transfecção (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Limitador para roedores, rodada 1 estilo broome em | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Tesoura, pontiaguda | Fisher Scientific | 08-940 | Ou use outra tesoura feita de aço inoxidável de grau cirúrgico Placas de |
| cultura tratadas com cultura de tecidos | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Ou use outras placas de Petri tratadas com cultura de células estéreis |
| Pinças/Fórceps, de precisão fina com ponta média | Fisher Scientific | 12-000-157 |
Referências
- Katsarou, A., et al. Type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016(2017).
- Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Pagliuca, F. W., et al.
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Reimpressões e permissões
