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Predição de Farmacologia de Rede e Validação Experimental do Mecanismo de Ação do Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Contra o Adenocarcinoma Pulmonar

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DOI:

10.3791/64847

⸱

3 de março de 2023

 ,  ,  , 
1Dongzhimen Hospital affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 2Traditional Chinese Medicine Department, Peking University People's Hospital

Neste artigo

Resumo

Este estudo revela o mecanismo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar com base na farmacologia de rede e verificação experimental. O estudo também demonstra que a via de sinalização PI3K/AKT desempenha um papel vital na ação do Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar.

Resumo

Nosso objetivo foi estudar o mecanismo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar (LUAD) com base na farmacologia de rede e verificação experimental. Os componentes efetivos e alvos potenciais de Trichosanthis e Fritillaria thunbergii foram coletados por experimentos de alto rendimento e banco de dados guiados por referência (HERB) da medicina tradicional chinesa e um banco de dados de similaridade ensemble approach (SEA), e os alvos relacionados ao LUAD foram consultados pelos bancos de dados GeneCards e Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Uma rede fármaco-componente-doença-alvo foi construída pelo software Cytoscape. Análises da rede de interação proteína-proteína (PPI), da ontologia gênica (GO) e da enciclopédia de Kyoto de enriquecimento de genes e genomas (KEGG) foram conduzidas para obter alvos centrais e vias-chave. Um extrato aquoso de células de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii e A549 foi utilizado para posterior validação experimental. Através do banco de dados HERB e busca na literatura, 31 compostos efetivos e 157 potenciais genes-alvo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii foram examinados, dos quais 144 foram alvos regulatórios de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento de adenocarcinoma pulmonar. A análise do enriquecimento funcional do GO mostrou que o mecanismo de ação do Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra o adenocarcinoma pulmonar é principalmente a fosforilação de proteínas. A análise do enriquecimento da via de KEGG sugeriu que o tratamento do adenocarcinoma pulmonar por Trichosanthes-Fritillaria thunbergii envolve principalmente a via de sinalização PI3K/AKT. A validação experimental mostrou que um extrato aquoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii pode inibir a proliferação de células A549 e a fosforilação de AKT. Através da farmacologia de rede e validação experimental, verificou-se que a via de sinalização PI3K/AKT desempenha um papel vital na ação do Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar.

Introdução

O câncer de pulmão refere-se a tumores malignos originados da mucosa brônquica pulmonar, incluindo carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de grandes células e carcinoma de pequenascélulas1. O adenocarcinoma de pulmão (LUAD) é o tipo mais comum de câncer de pulmão, correspondendo a cerca de 40% do total de casos de câncer depulmão2. A maioria dos pacientes é diagnosticada em estágio avançado ou com metástase à distância e, assim, perde a oportunidade dacirurgia3. No tratamento clínico atual, a quimiorradioterapia concomitante é a estratégia mais comum para o tratamento da LUAD, mas sua aplicação é limitada devido a reações adversasgraves4.

A medicina tradicional chinesa (MTC) pode efetivamente aliviar os sintomas clínicos de pacientes com LUAD e reduzir as reações adversas causadas pela radioterapia e quimioterapia, tornando-se, assim, um foco de pesquisa 5,6,7. Na medicina tradicional chinesa, o câncer de pulmão pertence à categoria de "acúmulo pulmonar" e "petroso pulmonar". A deficiência de Qi e a interação de catarro, estase e veneno são importantes na patogênese do câncer de pulmão. Portanto, tonificar o Qi e eliminar o catarro e a estase sanguínea são os principais métodos de tratamento clínico8 para o câncer de pulmão de acordo com a teoria daMTC9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) e Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) representam um par de drogas comum no tratamento do câncer de pulmão, e essa combinação tem como efeito limpar o calor e reduzir o catarro10,11,12. No entanto, seu mecanismo de ação ainda não está claro, e mais pesquisas precisam ser conduzidas.

A farmacologia de redes é um método abrangente baseado na teoria da biologia de sistemas e farmacologia multidirecional que visa revelar complexas relações em rede entre múltiplas drogas e doenças13. As prescrições tradicionais chinesas têm as características de serem multicomponentes e multialvo, o que significa que são muito adequadas para o estudo da farmacologia de rede14,15. Recentemente, a farmacologia de redes emergiu como uma abordagem poderosa no estudo de fórmulas de MTC e tornou-se um hotspot de pesquisa16,17.

No entanto, até onde sabemos, todas as pesquisas em farmacologia de redes são apresentadas como texto. Apresentar essa tecnologia por meio de vídeo reduzirá muito o limiar de aprendizado e facilitará a divulgação dessa tecnologia, que é uma das vantagens deste artigo. Neste estudo, tomamos como exemplo Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra adenocarcinoma pulmonar para predição farmacológica de rede e validação experimental.

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Protocolo

Todos os procedimentos de farmacologia de rede foram realizados de acordo com as Diretrizes para Métodos de Avaliação de Farmacologia de Rede18. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os regulamentos de gestão laboratorial da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim.

1. Predição farmacológica de rede

  1. Seleção de componentes ativos
    1. Abra o banco de dados HERB (http://herb.ac.cn)19 e use "Gualou" (nome chinês para Trichosanthes kirilowii Maxim) e "Zhebeimu" (nome chinês para Bulbus Fritillariae thunbergii) como palavras-chave para obter os componentes dos dois medicamentos. Faça o download da lista e das estruturas SMILES canônicas dos componentes relacionados dos dois medicamentos.
    2. Determine se o componente obtido é o componente ativo.
      1. Incluir como componentes ativos aqueles que apresentam valores de biodisponibilidade oral (OB) e fármaco-like (DL) no banco de dados do grupo HERB (i.e., componentes com OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18)20,21.
      2. Se o componente não tiver valores de OB e DL, insira o componente no banco de dados suíço ADME (http://www.swissadme.ch/index.php)22 para obter as informações sobre cada componente. Inclua componentes com absorção GI "alta" e pelo menos dois valores de DL "Sim" como componentes ativos.
  2. Previsão de destino dos componentes ativos
    1. Abra o banco de dados HERB (http://herb.ac.cn). Pesquise e copie as estruturas SMILES canônicas dos componentes ativos.
    2. Abra o banco de dados SEA (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. Cole as estruturas SMILES canônicas dos componentes ativos na caixa de pesquisa e clique em Testar SEA para obter a chave de destino, o nome de destino, o valor P e o MaxTC de cada componente ativo.
    3. Copie os dados em uma planilha e use a função de filtragem do arquivo de planilha para filtrar os destinos dos componentes ativos pela chave Target (Human, P < 0.05 e MaxTC > 0.5).
    4. Copie todos os alvos para uma planilha e remova as duplicatas para obter os alvos da droga.
  3. Predição de alvos de doença
    1. Abra os bancos de dados GeneCards (https://www.genecards.org)24 e Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM, https://www.omim.org)25 e use Lung Adenocarcinoma como palavra-chave para obter os alvos da doença do adenocarcinoma pulmonar.
    2. Faça o download das planilhas dos alvos da doença. Exclua os destinos repetidos para obter os destinos do LUAD.
  4. Construção de uma rede droga-componente-doença-alvo
    1. Copie os alvos relacionados ao LUAD e os alvos de drogas na mesma coluna em uma nova planilha. Use a função Dados - Identificar duplicatas na barra de ferramentas para obter destinos de interseção dos destinos relacionados ao LUAD e dos destinos relacionados ao componente ativo Trichosanthes-Fritillaria thunbergii .
    2. Abra o Cytoscape 3.8.0. Clique em Arquivo na barra de menus e selecione Importar > rede do arquivo para importar o arquivo de planilha. Otimize o tamanho e a cor dos nós de rede através da barra de estilos no painel de controle esquerdo.
    3. Use a função Analisar rede para a análise de topologia de rede . Clique em Ferramentas na barra de menus e selecione Analisar rede. No painel Tabela , clique no Grau na barra de título para organizar os componentes por grau em ordem decrescente. Tome os dez principais componentes e alvos como os principais componentes ativos e alvos principais.
  5. Construção da rede PPI e triagem das proteínas centrais
    1. Abra o banco de dados STRING (https://cn.string-db.org/)26. Cole a lista de formato de texto dos alvos potenciais de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra LUAD na caixa de diálogo Lista de nomes . Selecione Homo sapiens em Organismos e clique nos botões PESQUISAR > CONTINUAR .
    2. Quando os resultados estiverem disponíveis, clique em Configurações e marque Alta Confiança (0,700) em Configurações Básicas > Pontuação Mínima de Interação Necessária. Marque Ocultar nós desconectados na rede em Configurações avançadas e clique no botão ATUALIZAR.
    3. Clique em Exportações na barra de título e baixe o texto tabular curto da relação PPI no formato TSV.
    4. Abra o Cytoscape 3.8.0. Clique em Arquivo > Importar > rede do arquivo para importar o arquivo de formato TSV para análise visual.
    5. Use a função Analisador de Rede para realizar a análise topológica. Otimize o tamanho e a cor dos nós de rede através da barra de estilos no painel de controle esquerdo.
  6. Análise de enriquecimento KEGG
    1. Abra a plataforma Metascape (https://metascape.org/)27. Cole a lista em formato de texto dos potenciais alvos terapêuticos na caixa de diálogo e, em seguida, clique no botão Enviar. Marque H. sapiens em Input as Species e Analysis as Species e, em seguida, clique no botão Custom analysis. Selecione Enriquecimento, marque apenas o Caminho KEGG e clique em Análise de Enriquecimento. Depois que a barra de progresso atingir 100%, clique no botão laranja da Página do Relatório de Análise para obter os resultados do enriquecimento.
    2. Clique em All in One Zip File para baixar o resultado do enriquecimento e, em seguida, abra o arquivo _ FINAL_GO.csv na pasta Enrichment_GO para obter o resultado.
    3. Abra o software R (https://cran.r-project.org/). Digite install.package (" ggplot2") e library (ggplot2) em R para a instalação do pacote ggplot2 R. Pressione Enter para executar o programa de visualização KEGG.

2. Verificação experimental

  1. Preparo de medicamentos
    NOTA: Fritillaria thunbergii Miq e Trichosanthes kirilowii Maxim foram comprados do Hospital Dongzhimen, afiliado à Universidade de Medicina Chinesa de Pequim.
    1. Misture 50 g de Fritillaria thunbergii Miq e 50 g de Trichosanthes kirilowii Maxim juntos. Mergulhe a mistura em 1 L de água destilada durante 20 minutos e, em seguida, decocte a mistura a 100 °C sob pressão normal durante 1 h.
    2. Filtrar a decocção para obter um filtrado com uma camada dupla de gaze médica estéril e, em seguida, usar papel de filtro de 80 μm para filtrar ainda mais o extrato. Repita a operação acima três vezes.
    3. Misture o filtrado para obter uma decocção de aproximadamente 1,2 L. Colocar a solução no balão de um evaporador rotativo. Ajuste a velocidade de rotação para 50 rpm com uma temperatura de 37 °C. Misture e condense as decocções em um extrato no evaporador rotativo por 6 h para obter um líquido viscoso.
    4. Ligue o mecanismo de liofilização a vácuo para pré-resfriar a temperatura a -40 °C. Coloque o extrato obtido na bandeja de material e coloque-o na armadilha fria para congelamento.
    5. Quando a temperatura da armadilha fria atingir -50 °C e o material tiver sido congelado por 2 h, transfira os materiais congelados para uma prateleira de secagem colocada na armadilha fria. Ligue a bomba de vácuo para iniciar o processo de liofilização. Retire o pó liofilizado e guarde-o na geladeira a -20 °C para uso posterior.
  2. Cultivo celular
    1. Configure o meio DMEM completo com 89% de DMEM meio básico, 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
    2. Depois de remover as células A549 do azoto líquido, incube as células num banho-maria a 37 °C e mexa até derreter o meio no frasco para injetáveis.
    3. Adicione um volume quádruplo de meio completo DMEM nas células fundidas. Centrifugar as células (4 °C, 679 x g, 5 min) e eliminar o sobrenadante.
    4. Ressuspender as células precipitadas com 6 mL de meio DMEM completo, plaqueá-las em um balão de cultura T25 e incubar o frasco em uma incubadora de células a 37 °C, 5% CO2.
  3. Detecção de viabilidade celular
    1. Digerir as células A549 da fase logarítmica de crescimento com 1 mL de tripsina a 0,25% por 1 min a 37°C. Adicione 1 mL de meio DMEM completo para neutralizar a tripsina e sopre suavemente para promover a eliminação celular. Centrifugar a mistura para obter o pellet de célula (4 °C, 192 x g, 5 min). Ressuspender as células obtidas usando meio completo DMEM.
    2. Adicione a suspensão celular a um hemocitômetro e conte usando um contador de células automatizado. Diluir para 5 x 104 células/mL utilizando meio completo de DMEM.
    3. Dissolver 1 g de extrato aquoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii em 10 mL de solução de PBS e filtrá-lo através de um filtro de 0,22 μm. Diluir a mistura para 90 mg/mL, 80 mg/ml, 70 mg/mL, 60 mg/mL, 50 mg/mL, 40 mg/mL, 30 mg/mL, 20 mg/mL e 10 mg/mL usando PBS.
    4. Plaquear as células diluídas em placas de 96 poços com 100 μL por poço. Após a adesão celular, adicionar 1 μL de extratos aquosos de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii de diferentes concentrações para ajustar a concentração de cada poço para 900 μg/mL, 800 μg/mL, 700 μg/mL, 600 μg/mL, 500 μg/mL, 400 μg/mL, 300 μg/mL, 200 μg/mL e 100 μg/mL.
    5. Eliminar o meio original após 24 h de cultura e adicionar 100 μL de meio básico DMEM para posterior incubação durante 2 h a 37 °C, 5% CO2.
    6. Após o tratamento acima, adicionar 20 μL de solução de MTS (Tabela de Materiais) e incubar as células por mais 1 h a 37 °C, 5% CO2.
    7. Transfira a mistura incubada para uma placa diferente. Meça a absorbância (OD) em um comprimento de onda de 490 nm usando um leitor de microplacas. Calcule a viabilidade celular usando a seguinte fórmula:
      Viabilidade (%) = 100 × (DO da amostra tratada − DO do meio)/(DO da amostra controle − DO do meio).
      NOTA: Uma concentração mínima próxima de IC50 é definida como uma dose elevada. A concentração na qual a proliferação celular começa a ser inibida é definida como uma concentração de baixa dose, e o valor intermediário é definido como uma concentração de dose média para estudos experimentais subsequentes. Neste estudo, 400 μg/mL, 600 μg/mL e 800 μg/mL foram utilizados nas doses baixa, média e alta.
  4. Intervenção medicamentosa e coleta de amostras
    NOTA: O crescimento celular foi plotado contra o tempo para determinar a fase logarítmica.
    1. Diluir as células A549 da fase logarítmica de crescimento para 5 x 105 células/mL. Adicione 2 mL da suspensão celular a uma placa de 6 poços e cresça por 12 horas.
    2. Repetir o passo 2.3.3 para obter diluições de 80 mg/mL, 60 mg/mL e 40 mg/mL de PBS do extrato aquoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Adicionar 20 μL da solução PBS, 20 μL do extracto aquoso de 40 mg/ml de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, 20 μL do extracto aquoso de 60 mg/ml de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii e 20 μL do extracto aquoso de 80 mg/ml de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ao grupo de controlo em branco, ao grupo de baixa concentração, ao grupo de concentração média e ao grupo de alta concentração, respectivamente. Descarte o sobrenadante após 24 h de intervenção e limpe as células com PBS três vezes.
      NOTA: As concentrações do grupo controle em branco, grupo de baixa concentração, grupo de concentração média e grupo de alta concentração do extrato aquoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii foram 0 μg/mL, 400 μg/mL, 600 μg/mL e 800 μg/mL, respectivamente.
    3. Adicionar 250 μL de tampão RIPA (contendo 1% de PMSF e 1% de inibidor de fosfatase) a cada poço e lisar as células por 30 min. Recolher o lisado para centrifugação (4 °C, 6.714 x g, 10 min) e obter o sobrenadante.
  5. Mancha ocidental
    1. Detectar a concentração de proteínas das amostras pelo método BCA de acordo com as instruções do fabricante. Use o tampão RIPA para ajustar a concentração de cada amostra para que seja consistente.
    2. Misturar 40 μL da amostra de proteína com 10 μL de tampão de carga 5x e ferver durante 5 minutos a 100 °C. Centrifugar (4 °C, 6.714 x g, 10 min) a mistura para obter o sobrenadante para experimentos subsequentes.
    3. Isolar as proteínas por eletroforese em gel usando eletroforese vertical de 120 V.
    4. Prepare um "sanduíche" elétrico (esponja - papel filtro - gel - membrana PVDF - papel filtro - esponja). Mergulhe o aparelho de transferência em um banho de gelo e transfira a proteína para membranas de PVDF a 70 V por 60 min.
    5. Utilizar 100 mL de solução de TBST (Tween-20 a 0,05% [v/v], Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) e 5 g de leite em pó desnatado para configurar o leite a 5%. Pré-diluir os anticorpos AKT e p-AKT com o diluente de anticorpos na proporção de 1:1.000.
    6. Bloquear a membrana de PVDF em leite em pó desnatado a 5% durante 1 h com agitação. Após o bloqueio, elimine o leite bloqueador e adicione o anticorpo primário diluído para incubação durante a noite a 4 °C.
    7. Depois de remover o anticorpo primário, use a solução de TBST para lavar a membrana de PVDF cinco vezes por 5 min cada.
    8. Pré-diluir o anticorpo secundário com o diluente de anticorpos na proporção de 1:5.000. Adicionar o anticorpo secundário e incubar à temperatura ambiente (TR) por 1,5 h. Depois de remover o anticorpo secundário, use a solução de TBST para lavar a membrana de PVDF cinco vezes por 5 min cada.
    9. Detecte a proteína usando um sistema de detecção por quimioluminescência.

3. Acoplamento molecular

  1. Abra o banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org)28. Digite os símbolos de destino na caixa de pesquisa e clique no botão PESQUISAR . No subtítulo Estrutura , clique em Download para as estruturas 3D dos alvos de proteína.
  2. Abra o banco de dados RCSB PDB (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Digite o nome das macromoléculas de proteína na caixa de pesquisa. Faça o download das estruturas das macromoléculas proteicas em formato PDB.
  3. Faça o download do pacote de instalação dos softwares UCSF Chimera 1.16 (https://vina.scripps.edu/) e AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). Instale e abra o software UCSF Chimera 1.16. Clique em Arquivo > Abrir para exibir a proteína receptora.
  4. Clique em Ferramentas > Edição de Estrutura > Dock Prep e marque Excluir solvente, Adicionar hidrogênio e Adicionar cargas no popover para remover água e adicionar hidrogenação e balancear cargas. Clique em Gravar arquivo Mol2 para salvar a proteína do receptor no formato mol2. Execute o mesmo passo no ligante.
  5. Clique em Arquivo > Abrir para exibir o ligante de formato mol2 no software UCSF Chimera 1.16. Em Ferramentas > Análise de Superfície/Ligação > AutoDock Vina, defina a barra Receptor para o nome da proteína receptora e a barra Ligante para o nome do ligante. Digite um valor na caixa atrás de Centro e Tamanho para ajustar o espaço recém-desenvolvido, tornando possível abranger totalmente o ligante e o receptor.
  6. Clique em OK para a triagem virtual de acoplamento molecular para obter o local ideal para a ligação do ligante ao receptor. Registre o valor de energia de ligação na posição ideal.

4. Análise estatística

  1. Abra o software estatístico SPSS 26.0. Clique em Arquivo > Importar Dados para carregamento de dados.
  2. Apresentar os dados experimentais como média ± desvio padrão.
  3. Compare vários grupos usando uma ANOVA unidirecional.
    LEGENDA: P < 0,05 foi considerado estatisticamente significante neste trabalho.

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Resultados

Um total de 31 componentes ativos relacionados a Trichosanthes-Fritillaria thunbergii foram identificados, incluindo 21 componentes de Trichosanthes e 10 componentes de Fritillaria thunbergia, bem como 144 alvos correspondentes. No total, 9.049 e 67 genes relacionados ao LUAD foram extraídos do banco de dados GeneCards e do banco de dados OMIM, respectivamente. Após a exclusão de genes duplicados, 9.057 genes relacionados ao LUAD foram identificados. A intersecção dos genes relacionados ao LUAD...

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Discussão

Geralmente, um estudo completo de farmacologia em rede inclui a identificação de componentes ativos a partir de bancos de dados, a aquisição de alvos correspondentes a componentes ativos e doenças, a construção de uma rede droga-componente-doença-alvo e a previsão de alvos e vias centrais. A associação entre componentes ativos e proteínas centrais (docking molecular) é preliminarmente prevista pela tecnologia computacional, e a verificação final é conduzida por meio de um experimento.

A seleçã...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Programa de Treinamento em Inovação da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (No: 202110026036).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% de tripsina-EDTAGibcoR001100
A549  linha celularProcellCL-0016
AKT anticorpoCST4691S
BCA Protein Assay KitSolarbioPC0020
Sistema de detecção de quimioluminescênciaShanghai Qinxiang Scientific Instrument FactoryChemiScope 6100
Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)Solarbio11995
Kit de quimioluminescência aprimorada (ECL)de RM00021ABclonal
ScienCell0025
HRP IgG anti-coelho da cabra (H+L)Kit de ensaio ABclonalAS014
MTSPromegaG3580
anticorpo p-AKTCST6040S
Penicilina estreptomicinaGibcoC14-15070-063
Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)SolarbioP0100
Inibidor de fosfataseBeyotimeP1081
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)MembranasP1020
liseMilliporeISEQ00010
RIPAEvaporador rotativo SolarbioR0010
Xangai Yarong Fábrica de Instrumentos BioquímicosRE52CS-1
Mecanismo de liofilização a vácuoNingbo Scientz BiotecnologiaSCIENTZ-10
β-Actina anticorpoABclonalAC026
Soro bovino fetal de difluoreto de polivinilideno Solarbio Solução de

Referências

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