Aqui, descrevemos um protocolo para o desenvolvimento de um modelo de xenoenxertia de membrana corioalantóica (CAM) para tecido ovariano humano e demonstramos a eficácia da técnica, o tempo de revascularização do enxerto e a viabilidade tecidual ao longo de um período de enxertia de 6 dias.
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Artigo de método
Modelo de membrana corioalantóide de pintinhos (CAM) como ferramenta para o estudo do transplante de tecido ovariano
Neste artigo
Resumo
Resumo
A criopreservação e o transplante de tecido ovariano são uma estratégia eficaz para preservar a fertilidade, mas têm uma grande desvantagem, a perda maciça de folículos que ocorre logo após o reimplante devido à ativação anormal dos folículos e morte. Os roedores são modelos de referência para investigar a ativação dos folículos, mas o custo, o tempo e as considerações éticas estão se tornando cada vez mais proibitivos, impulsionando o desenvolvimento de alternativas. O modelo de membrana corioalantóide de pintinhos (CAM) é particularmente atraente, sendo barato e mantendo a imunodeficiência natural até o 17º dia pós-fertilização, tornando-o ideal para o estudo de xenoenxertia de curto prazo de tecido ovariano humano. A MAC também é altamente vascularizada e tem sido amplamente utilizada como modelo para explorar a angiogênese. Isso lhe confere uma notável vantagem sobre os modelos in vitro e permite a investigação dos mecanismos que afetam o processo de perda precoce dos folículos pós-enxerto. O protocolo aqui descrito visa descrever o desenvolvimento de um modelo de xenoenxertia CAM para tecido ovariano humano, com conhecimentos específicos sobre a eficácia da técnica, o período de revascularização do enxerto e a viabilidade tecidual ao longo de um período de enxertia de 6 dias.
Introdução
A demanda pela preservação da fertilidade por indicações oncológicas e benignas, bem como razões sociais, aumentou dramaticamente nas últimas décadas. No entanto, vários tratamentos utilizados para curar doenças malignas e não malignas são altamente tóxicos para as gônadas e podem resultar em insuficiência ovariana prematura iatrogênica, levando à infertilidade1. Técnicas estabelecidas para preservação da fertilidade incluem criopreservação de embriões, vitrificação de oócitos imaturos ou maduros e criopreservação de tecido ovariano 2,3,4
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Protocolo
O uso de tecido humano foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Católica de Lovaia. As pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para o uso do tecido ovariano para fins de pesquisa.
1. Ordenar o dia 0 ovos que são altamente prováveis de serem embrionados
- Encontre um fornecedor certificado de ovos Leghorn brancos selecionados em laboratório Lohman que relata altas taxas de ovos embrionados, o que depende principalmente da idade dos pintinhos.
2. Preparação dos ovos para incubação
- Antes da chegada dos ovos, monta....
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Resultados
Taxas de sobrevivência de embriões de pintinhos
A taxa de sobrevivência do embrião desde o janelamento (dia 3 de DE) até o enxerto de tecido ovariano (dia 7 de DE) foi de 79% (33/42). Uma vez que a porcentagem de ovos embrionados do dia 0 é desconhecida, ovos supranumerários do dia 0 de galinhas brancas Leghorn selecionadas por Lohman foram encomendados para garantir que ovos embrionados suficientes estivessem disponíveis para enxertia. Um total de 23 ovos viáveis do dia 7 foram usados para enxertia, .......
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Discussão
A parte mais desafiadora do protocolo descrito aqui é fazer o pequeno orifício necessário para aspirar a albumina a fim de desprender a CAM da casca do ovo antes de criar uma janela. Aplicar muita pressão pode resultar em superpenetração ou até mesmo rachar e destruir o ovo, causando danos irrevogáveis à CAM e sua vasculatura. Para minimizar os erros durante as tentativas iniciais de separar o CAM, é altamente recomendável praticar fazer pequenos buracos na casca do ovo de ovos não fertilizados comprados em supermercado .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Mira Hryniuk, BA, pela revisão da língua inglesa do artigo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulha hipodérmica Agan, 19 G | Terumo Europe | AN*1950R1 | Agulha de 19 G para aspirar albumina |
| Terumo, 5 mL de bloqueio Luer concêntrico | Terumo Europe | SS*05LE1 | Seringa estéril de 5 mL |
| Caseviewer v2.2 | de análise de imagem | 3DHISTECH | |
| Éter dietílico | Merck Chemicals | 603-022-00-4 | Éter estéril para traumatizar o CAM |
| Solução aquosa de Eosina Y 0,5% | Solução | de coloração Merck 1098441000 | |
| Solução aquosa de formaldeído 4% tamponada (Formalina 10%) | VWR | 97139010 | Formaldeído usado para fixação de tecidos |
| Geladeira | Liebherr | 7081260 | Geladeira a 4 ° C usado para embutir em parafina |
| Placa de aquecimento | Schott | SLK2 | Placa quente usada para secar as lâminas |
| Incubadora | Thermo Forma Scientific 3111 | 10365156 | Forno usado para incubação de lâminas |
| Leica CLS 150 XE microscópio fonte de luz fria | Leica | CLS 150 XE | Fonte de luz fria focal para vela os ovos Lenço |
| de limpeza de lentes, grau 541 | VWR | 111-5003 | Tecido para embeber em éter estéril para traumatizar o CAM |
| Hematoxilina de Mayer | MERCK | 1092491000 | Solução de coloração |
| Metanol | VWR | 20847307 | Metanol |
| Micrótomo | ThermoScientific-MICROM | HM325-2 | Micrótomo |
| Pannoramic P250 Flash III | Scanner 3DHISTECH | / | Slide com ampliação de 20x |
| Paraformaldeído | Merck | 1,04,00,51,000 | Solução de incorporação de parafina |
| Paraplast Plus | R Sigma | P3683-1KG | de parafina |
| , 60x15 mm, | Greiner | estéril 628161 | Placa de Petri estéril |
| Suporte | de pinos Fine Science Tools | 26016-12 | Suporte de pinos |
| Polyhatch | Brinsea | CP01F | Incubadora de ovos com rotador automático |
| Lâmina de serra de rolagem, 132 mm | Sencys | / | Lâmina de serra para criar uma janela na casca do ovo |
| Pinos de inserção de aço inoxidável | Ferramentas Fine Science | 26007-02 | Pino reto para fazer um buraco na casca do ovo |
| Steril-Helios | Angelantoni Industrie | ST-00275400000 | Capuz de fluxo laminar |
| Superfrost Plus bords rodé s 90° | VWR | 631-9483 | Corrediças de vidro |
| Tissue-Tek VIP 6Al | Sakura | 60320417-0711 VID6E3-1 | Dispositivo de incorporação automática |
| Pinça de titânio | Fine Science Tools | 11602-16 | Pinça para remoção de casca de ovo e manipulação de tecido ovariano |
| Tolueno, pa | VWR | 28701364 | Solução de inclusão de parafina |
Referências
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
- Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C.
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Reimpressões e permissões
