Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) modellen som et værktøj til at studere ovarievævstransplantation

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

Summary

Her beskriver vi en protokol til udvikling af en chick chorioallantoic membrane (CAM) xenografting model for humant ovarievæv og demonstrerer effektiviteten af teknikken, graft revaskularisering tidsramme og vævets levedygtighed over en 6 dages podningsperiode.

Abstract

Kryopræservering og transplantation af ovarievæv er en effektiv strategi til bevarelse af fertiliteten, men har en stor ulempe, nemlig massivt follikeltab, der opstår kort efter reimplantation på grund af unormal follikelaktivering og død. Gnavere er benchmarkmodeller til undersøgelse af follikelaktivering, men omkostningerne, tiden og de etiske overvejelser bliver mere og mere uoverkommelige, hvilket driver udviklingen af alternativer. Chick chorioallantoic membrane (CAM) -modellen er særlig attraktiv, idet den er billig og opretholder naturlig immundefekt op til dag 17 efter befrugtning, hvilket gør den ideel til at studere kortvarig xenografting af humant ovarievæv. CAM er også stærkt vaskulariseret og har været meget udbredt som en model til at udforske angiogenese. Dette giver det en bemærkelsesværdig fordel i forhold til in vitro-modeller og tillader undersøgelse af mekanismer, der påvirker den tidlige follikeltabsproces efter podning. Protokollen skitseret heri har til formål at beskrive udviklingen af en CAM xenografting model for humant ovarievæv, med specifik indsigt i effektiviteten af teknikken, graft revaskularisering tidsramme, og væv levedygtighed over en 6 dages podning periode.

Introduction

Efterspørgslen efter fertilitetsbevarelse for onkologiske og godartede indikationer samt sociale årsager er steget dramatisk i de seneste årtier. Imidlertid er forskellige behandlinger, der anvendes til at helbrede ondartede og ikke-ondartede sygdomme, meget giftige for gonaderne og kan resultere i iatrogen for tidlig ovarieinsufficiens, hvilket i sidste ende fører til infertilitet1. Etablerede teknikker til fertilitetsbevarelse omfatter embryokryopræservering, umoden eller moden oocytforglasning og kryopræservering af ovarievæv 2,3,4. Frysning af ovarievæv er den eneste tilgængelige mulighed for at bevare fertiliteten hos præpubertale piger eller kvinder, der kræver øjeblikkelig kræftbehandling. Genoprettelsen af endokrin funktion efter ovarievævstransplantation forekommer hos over 95% af forsøgspersonerne, med levende fødselsrater fra 18% til 42%5,6,7,8,9.

Selvom transplantationen af frosset-optøet ovarievæv har vist sig at være vellykket, er der stadig plads til forbedringer. Da ovariekortikale fragmenter transplanteres uden vaskulær anastomose, oplever de faktisk en periode med hypoxi, hvor transplantatrevaskularisering finder sted 10,11,12. Langt de fleste undersøgelser, der undersøger transplantation af humant ovarievæv, har brugt en xenografting model, hvor ovarievæv transplanteres til immundefekte mus. Den fuldstændige revaskularisering af xenotransplantaterne tager omkring 10 dage, hvor både værts- og transplantatkarrene bidrager til dannelsen af funktionelle kar 12,13,14. Omkring 50% -90% af follikelreserven går tabt i løbet af dette hypoxiske vindue før afslutningen af transplantatrevaskularisering 10,15,16. Det er blevet kraftigt foreslået, at dette massive follikeltab forekommer gennem både direkte follikeldød, som demonstreret ved et fald i det absolutte follikelantal, der er tilbage efter podning, og aktiveringen af primordial follikelvækst, som indikeret af ændringer i follikelproportioner mod øgede vækstfollikler17,18.

Interessant nok har tidligere forskningsarbejder ved hjælp af forskellige animalske ovarievæv podet til chick chorioallantoic membran (CAM), som har en forfatning, der efterligner det typiske podningssted i bughinden, rapporteret hæmning af spontan follikelaktivering, hvor den oprindelige follikelreserve forbliver intakt i op til 10 dage 19,20,21,22. Vores team har tidligere demonstreret, at podning af frosset-optøet humant ovarievæv til CAM udgjorde en pålidelig tilgang til undersøgelse af human ovarievævstransplantation i sine første iskæmiske stadier23 og viste for nylig, at denne podningsmetode var i stand til at modvirke follikelaktivering24.

CAM-modellen er især tiltalende, ikke kun fordi æg er meget billigere end mus, men også på grund af den meget vaskulariserede karakter af CAM, hvilket muliggør undersøgelse af sammenhængen mellem follikelaktivering og ovarietransplantatrevaskularisering. Fuglesystemet er faktisk en af de mest almindelige og alsidige måder at studere angiogenese25 på. Chick embryo udvikling (ED) tager 21 dage indtil udklækning, og CAM dannes inden for de første 4-5 dage gennem fusion af allantois og chorion26. Især er kyllingembryoet en naturligt immundefekt vært indtil dag 17 i ED, så xenografting eksperimenter kan udføres uden risiko for transplantatafvisning27,28. Desuden giver CAM-modeltilgangen ingen anledning til etiske eller juridiske betænkeligheder med hensyn til EU-lovgivning29, hvilket gør den til et attraktivt alternativ til andre dyremodeller. Med hensyn til avlsbetingelser behøver kyllingembryoner kun en inkubator indstillet til 37 °C med en relativ luftfugtighed på 40%-60%. Disse begrænsede forsøgskrav reducerer forskningsomkostningerne betydeligt sammenlignet med brug af mus med immundefekt.

Protokollen, der præsenteres heri, har til formål at beskrive udviklingen af en CAM-xenograftingmodel for humant ovarievæv og give specifik indsigt i effektiviteten af teknikken, tidsrammen for transplantatrevaskularisering og vævets levedygtighed over en 6-dages podningsperiode. Denne protokol kunne være af stor interesse for at undersøge mekanismerne bag tidligt follikeltab efter podning og studere virkningen af flere stoffer (vækstfaktorer, hormoner osv.) på dette fænomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Brugen af humant væv blev godkendt af Institutional Review Board ved det katolske universitet i Louvain. Patienterne gav deres skriftlige informerede samtykke til brug af deres ovarievæv til forskningsformål.

1. Bestilling af dag 0 æg, der med stor sandsynlighed er embryoneret

  1. Find en certificeret laboratoriekvalitet Lohman-udvalgt hvid leghorn æg leverandør, der rapporterer høje satser for embryonerede æg, som primært afhænger af kyllingernes alder.

2. Forberedelse af æggene til inkubation

  1. Før æggene ankommer, samles og ligevægtes æginkubatoren til 37 °C i 40% -60% relativ luftfugtighed. Overvåg temperatur og luftfugtighed ved at indsætte et termometer og hygrometer i inkubatoren. Sørg for, at inkubatorens låg er udstyret med et glasvindue, så inkubatorens interne parametre kan kontrolleres uden at skulle åbne det (figur 1).
  2. Efter at have modtaget dag 0 æg fra Lohman-udvalgte hvide leghorn kyllinger fra en certificeret laboratoriekvalitet ægleverandør, rengør overfladen af skallerne med befugtet papir og tør dem straks.
    BEMÆRK: Da æggeskalsmembranen er porøs, kan autoklaveret vand bruges til at rengøre ægoverflader og kontrollere fugtigheden i inkubatoren for at minimere kontamineringsrisici.
  3. Mærk æggene ved hjælp af en markør (f.eks. dato og ægnummer).
  4. Inkuber æggene med den spidse ende nedad, og drej dem for at lade CAM-modulet udvikle sig. Drej æggene manuelt 180 ° to til tre gange om dagen, eller brug en automatisk rotator.
    BEMÆRK: For at sikre, at æggene faktisk roteres, kan æggeskallen mærkes med et "X" og "O" på de to modsatte sidesider ved hjælp af en blyant eller markør. Glasvinduet i inkubatorens låg gør det muligt at kontrollere æggens rotation uden at åbne enheden.

3. Åbning af æggeskallen på dag 3 af ED

BEMÆRK: Et rektangulært vindue er lavet i æggeskallen på dag 3 i ED.

  1. Forbered laminar flowhætten for at arbejde under sterile forhold. Anbring følgende instrumenter under emhætten, og desinficer dem i 70% ethanol (hvis de ikke allerede er steriliseret):
    -Æggestativ
    -Æggelys eller brændvidde kold lyskilde
    -Markør
    -Steril lige stift
    -Steril 19 G kanyle
    -5 ml steril sprøjte
    -Rulle savklinge
    -Steril pincet
    -Tape
  2. Overfør et æg fra inkubatoren til æggestativet placeret under emhætten, og sluk ægrotatoren.
  3. I mørket skal du identificere æggets luftlomme ved at placere æggelyset (eller den fokale kolde lyskilde) mod æggeskallen. Luftlommen er lokaliseret i den stumpe ende af ægget. Brug en markør til at lokalisere midten af luftlommen på æggeskallen.
  4. Tænd lysene. Lav et lille hul i æggeskallen, hvor det markeres ved forsigtigt at dreje en steril lige stift. En lille åbning på omkring 1 mm i diameter er normalt tilstrækkelig.
    BEMÆRK: Pas på ikke at skubbe stiften hele vejen gennem ægget. Hvis dette sker, skal du kassere ægget.
  5. Tilslut en steril 19 G kanyle til en steril 5 ml sprøjte.
  6. I mørket skal du lokalisere æggeblommesækken ved hjælp af æggelysesværspræparatet (eller den fokale kolde lyskilde) og punktere ægget gennem hullet i trin 3.4 med den sterile 19 G nål vinklet 45 ° mod bunden af ægget; Vær meget forsigtig med ikke at forstyrre æggeblommesækken. Opsug mellem 1,5-2 ml albumen for at løsne CAM fra skallen, og luk derefter hullet med et stykke tape.
    BEMÆRK: Hvis æggeblommesækken forstyrres under aspiration, vil den opsugede væske i sprøjten være gulfarvet snarere end gennemsigtig (albumen). Hvis dette sker, skal nålen og sprøjten udskiftes. Hvis en relativt stor mængde æggeblomme suges op, kan det bringe embryoets levedygtighed i fare.
  7. Tænd lysene. Placer ægget vandret, og tegn et rektangulært vindue, der måler 1 cm x 1,5 cm med en markør. Gør ikke vinduet større end den sædvanlige bredde af standard tape.
  8. Hold ægget i den ene hånd, og så forsigtigt det tidligere tegnede vindue ind i æggeskallen ved hjælp af et rullesavblad. Sørg for, at skallen ikke revner og ikke skærer helt ned til den deprimerede CAM. Blæs regelmæssigt for at fjerne skalstøv og snavs.
  9. Skub sterile tang under det rektangulære stykke savet skal, og tag fat behændigt for at fjerne det rent uden at beskadige CAM. Kassér desuden den hvide ydre skalmembran for at kunne se embryoet og dets CAM.
    BEMÆRK: Hvis noget æggeskalsstøv eller snavs falder på CAM, kan det fjernes ved hjælp af sterile pincet, idet man er meget forsigtig med ikke at rive CAM.
  10. Identificer levedygtige embryonerede æg. De kan ses af deres klare albumen og den vaskulære ring omkring embryoet, hvor et bankende hjerte undertiden kan detekteres selv på dette stadium (dag 3 i ED). Kassér ikke-befrugtede eller døde embryoner.
  11. Placer tape over det nyoprettede vindue for at undgå dehydrering. Sørg for at folde den ene ende over sig selv for at lette fjernelsen.
  12. Sæt ægget tilbage i inkubatoren med det åbne vindue opad og båndet berører ikke CAM. Brug et foldet stykke papir eller en del af æggestativet til at forhindre ægget i at rulle. Sørg for, at den roterende bakke er slukket.
  13. Gentag trin 3.2-3.12 for at åbne de resterende æg.

4. Podning af frosset-optøet humant ovarievæv til CAM

BEMÆRK: Transplantation til CAM bør ideelt set påbegyndes mellem dag 7-10 i ED.

  1. Kryopræserverede kortikale strimler i æggestokkene under den laminære strømningshætte i overensstemmelse med protokollen beskrevet andetsteds30.
  2. Skær de kortikale strimler i tre fragmenter på 4 mm x 2 mm x 1 mm. Brug et stykke som en ikke-podet kontrol og de to andre til xenografting i 1 dag eller 6 dage.
    BEMÆRK: Hvis der er nok væv til rådighed, skal du arbejde i to eksemplarer.
  3. Overfør et æg fra inkubatoren til æggestativet placeret under emhætten med vinduet opad.
  4. Skræl båndet af vinduet, og sørg for, at embryoet er levedygtigt. På dette stadium har levedygtige embryoner omfattende vaskulatur, et klart albumen, et synligt hjerteslag og nogle embryobevægelser.
  5. Forbered podningsstedet ved forsigtigt at traumatisere et lille område af CAM-modulet ved at lægge en 1 cm2 strimmel sterilt etherekstraheret linsepapir på epiteloverfladen og fjerne det med det samme.
    BEMÆRK: CAM er en uigennemtrængelig barriere, medmindre membranen er blevet traumatiseret ved fjernelse af den øvre peridermale del af det dobbelte epitellag, hvilket efterlader basallaget intakt. Denne teknik forbedrer også revaskulariseringsprocessen ved at aktivere sårheling. Hvis det sterile etherekstraherede linsepapir forbliver på CAM-modulet for længe, kan membranen klæbe til linsepapiret og rive. Hvis dette sker, skal du kassere ægget.
  6. Tag fat i en frossen-optøet ovariekortikal strimmel (4 mm x 2 mm x 1 mm) med mikrokirurgisk tang, og læg den på den traumatiserede CAM med medullær side mod CAM. Pod et vævsstykke pr. Æg.
  7. Dæk vinduet med tape, og returner forsigtigt ægget til inkubatoren. Sørg for, at æggeskallens åbning sidder oprejst, og ægget er sikkert.
  8. Gentag trin 4.1-4.7 til podning af alle de resterende væv.
    BEMÆRK: Implantaterne skal kontrolleres på hver podningsdag for at vurdere embryoets levedygtighed og overvåge ændringer i vaskulaturen.

5. Høstning af transplantaterne

BEMÆRK: Xenotransplantater skal høstes senest på dag 17 i ED, da embryoets immunsystem bliver modent og kompetent fra dag 18.

  1. Placer ægget på et stativ, og forstør vinduet i æggeskallen for at give mulighed for bedre transplantatvisualisering og lettere manipulation.
  2. Evaluer transplantatet makroskopisk, og vær særlig opmærksom på CAM's vaskulære reaktion mod transplantatet. Tag digitale fotografier eller videoer til posten.
  3. Tag fat i vævet eller den omgivende CAM med tang, og brug en saks eller en skalpel til at skære transplantatet fra CAM omhyggeligt.
    BEMÆRK: Transplantaterne bliver dækket med et andet lag CAM omkring dag 3 af podning og bliver til sidst indkapslet. De kan også have flyttet sig inde i ægget på dag 6, hvilket gør det vanskeligt at hente dem i nogle tilfælde.
  4. Det udskårne væv analyseres ved hjælp af en hvilken som helst metode, der er egnet til det givne forsøg. I denne undersøgelse blev vævsstykker fastgjort i paraformaldehyd, paraffinindlejret og farvet med hæmatoxylin og eosin ved at følge nedenstående trin:
    1. Fastgør fragmenterne i 4% paraformaldehyd i 24 timer, og indlejr dem i paraffin ved hjælp af en automatisk indlejringsenhed med trinene nævnt i tabel 1.
    2. Lad de paraffinindlejrede blokke stå natten over ved 4 °C, før du skærer dem i 5 μm tykke sektioner med et mikrotom.
    3. Vævsstykkerne spredes på et glasglas anbragt på en varmeplade (30 °C), og lad dem tørre i 2 timer efterfulgt af 24 timer i en ovn ved 37 °C.
    4. Derefter plettes diasene med hæmatoxylin og eosin efter en protokol beskrevet andetsteds31. Derefter digitaliseres prøverne ved hjælp af en diasscanner, og analyser dem ved hjælp af en billedanalysesoftware.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overlevelsesrater for kyllingeembryoner
Embryooverlevelsesraten fra vinduesdannelse (dag 3 i ED) til ovarievævstransplantation (dag 7 i ED) var 79% (33/42). Da procentdelen af embryonerede dag 0-æg er ukendt, blev overskydende dag 0-æg fra Lohman-udvalgte hvide leghornskyllinger bestilt for at sikre, at der ville være tilstrækkelige embryonerede æg til podning. I alt 23 levedygtige dag 7-æg blev brugt til podning, hvoraf det ene omkom i løbet af de første 24 timer, hvilket resulterede i en samlet embryooverlevelsesrate på 96% efter transplantation (22/23).

Makroskopisk aspekt af transplantaterne
Efter 1 dags podning så transplantaterne levedygtige ud i 100% (10/10) af tilfældene og var allerede i det mindste delvist klæbende til CAM, hvilket viste et hjul-eger mønster af blodkar, der var nødvendige for deres vaskularisering (figur 2A, B). Efter 6 dages podning var alle implantaterne stadig klæbende (figur 2C), bortset fra to, der ikke fastgjorde sig til CAM. De fik et nekrotisk udseende og blev udelukket fra yderligere analyse (figur 3), hvilket resulterede i en overlevelsesrate for podet væv på 83% (10/12) efter 6 dage. Alt i alt viste levedygtighedsvurderingen af de humane ovarietransplantater en samlet vævsoverlevelsesrate på 91 % (20/22), uanset podningsdagen (tabel 2).

Omkring dag 3 efter transplantation viste transplantaterne sig at være dækket af et andet lag CAM, og de blev til sidst indkapslet, hvilket førte til endnu bedre transplantatvaskularisering (figur 2C). Samlet set var 80% af transplantationerne også trængt ind i ægget (figur 2D), hvilket i nogle tilfælde gjorde det svært at hente dem på dag 6.

Mikroskopisk vurdering af transplantaterne
I alt 30 frosne-optøede humane ovariefragmenter opnået fra fem forskellige patienter blev analyseret og fikseret i 4% paraformaldehyd på podningsdag 0, dag 1 eller dag 6, indlejret i paraffin og serielt skåret i 5 μm sektioner til histologisk evaluering (figur 4).

For at vurdere overlevelsesraten for follikler i æggestokkene blev follikler talt i 12 tilfældige hæmatoxylin- og eosinfarvede sektioner pr. Tidspunkt og pr. Patient. Kun morfologisk normale follikler med en synlig oocyt blev taget i betragtning ved analyse32. Sunde follikler blev observeret på alle tidspunkter (figur 4B-D). Follikeloverlevelsesraterne blev beregnet ved at bestemme den resterende follikeltæthed (antal follikler/mm3) efter podning og normalisere den til follikeltætheden i ikke-podede kontroller (betragtes som 100%). Follikeltæthederne havde tendens til at falde efter transplantation, men ikke nok til at nå statistisk signifikans (p > 0,8) (tabel 2). Tilsvarende blev follikeloverlevelsesraterne opretholdt i podningsperioden på 95% ± 19% på dag 1 og 83% ± 27% på dag 6 (p > 0,5).

Revaskulariseringsprocessen blev yderligere undersøgt ved påvisning af røde fugleblodlegemer i kar fra det xenopodede ovarievæv. Fugleerytrocytter er let at skelne, da de er kerneformede (figur 4A, C, D). Overraskende nok var vi i stand til at observere fugleerytrocytter i æggestokkene i 30% af implantaterne efter kun 1 dags transplantation og i alle implantaterne på dag 6, hvilket udviste meget hurtig revaskularisering (tabel 2).

Figure 1
Figur 1: Æg inkubator. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Makroskopisk aspekt af levedygtige implantater. A) Podedag 0. (B) Implantater på dag 1, hvor CAM-modulet viser et hjul-eger mønster af blodkar mod æggestokkene. (C) Implantater indkapslet af CAM på dag 6, hvilket fører til endnu bedre transplantatvaskularisering. (D) Transplantat, der trænger ind i ægget. Pilene peger på det podede ovarievæv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Makroskopisk aspekt af nekrotiske implantater. (A) Sundt udseende ovarievæv på dag 0 af podning. (B) Nekrotisk aspekt af implantatet 6 dage senere. Pilene peger på æggestokkene. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Mikroskopisk aspekt af implantater. Hæmatoxylin og eosinfarvede sektioner af implantater podet i (A,B) 1 dag og i (C,D) 6 dage. Pilespidserne peger på fuglerøde blodlegemer, der perfuserer æggestokkene efter (A) 1 dag og (C, D) 6 dages podning. Pilene angiver sunde udseende urfollikler i implantater podet i (B) 1 dag og (C, D) 6 dage. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Trin Bade Tidspunkt
Anden fiksering 1 Formalin 10% badeværelse 2 timer
Dehydrering 7 methanol bade 7x 1 time
Tydeliggørelse 3 toluen bade 3x 1 time
Befrugtning 3 flydende paraffinbade (60°C) 15 min – 30 min – 30 min

Tabel 1: Paraffinindlejringstrin.

Ikke-podet Podning dag 1 Podning dag 6 P-værdi
Makroskopisk aspekt af transplantater
Overlevelsesrate for væv - 100% (10/10) 83% (10/12) /
Mikroskopisk aspekt af transplantater
Follikeltæthed (n/mm3) 848 ± 272 817 ± 370 684 ± 236 p > 0,8
Follikel overlevelsesrate 100% 95% ± 19% 83% ± 27% p > 0,5
Fuglerøde blodlegemer til stede i implantater 0% (0/10) 30% (3/10) 100% (10/10) /

Tabel 2: Resultater. Statistisk analyse udført ved hjælp af envejs ANOVA, efterfulgt af Sidak-korrektion. Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest udfordrende del af protokollen, der er beskrevet her, er at lave det lille hul, der kræves for at aspirere albumen for at løsne CAM fra æggeskallen, inden der oprettes et vindue. Anvendelse af for meget tryk kan resultere i overpenetration eller kan endda knække og ødelægge ægget og forårsage uigenkaldelig skade på CAM og dets vaskulatur. For at holde fejl på et minimum under de første forsøg på at adskille CAM, anbefales det kraftigt at øve sig på at lave små huller i æggeskallen af ikke-befrugtede, købmandskøbte æg ved hjælp af en lige stift. I betragtning af den naturlige variation i fertiliteten på tværs af partier sammen med det faktum, at ikke alle embryoner overlever proceduren, anbefales det desuden at få overskydende æg fra ægleverandøren. For at opnå optimale embryooverlevelsesrater og en veludviklet CAM skal æggene inkuberes under ideelle forhold. I tilfælde af lav levedygtighed kan forskellige aspekter skyldes og skal undersøges. Ægleverandøren bør kontaktes, da levedygtigheden af embryoner fra leverandøren simpelthen kan være lavere på dette tidspunkt. Lav æglevedygtighed kan også skyldes unøjagtige eller uhensigtsmæssige inkubatorindstillinger, hvilket kan kompromittere CAM-udviklingen. Brug af et uafhængigt hygrometer og termometer kan sikre, at indstillingerne er nøjagtige og stabile, men detaljerede fejlfindingsinstruktioner skal leveres af producenten. Endelig er det også blevet foreslået, at for hyppig kontrol af transplanterede æg kan resultere i temperatur- og fugtighedsudsving, hvilket kan have skadelige virkninger på de podede embryoner33.

I den nuværende protokol blev vinduesåbningen af æggeskallen udført på dag 3 af ED ved at aspirere omkring 2 ml albumen fra embryoet for at løsne CAM fra skallen, hvilket igen tillod oprettelse af et vindue uden at beskadige CAM. Embryooverlevelsesraten 4 dage senere var 79%, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser 34,35. Andre metoder er blevet rapporteret med varierende grad af succes. Et alternativ er at skubbe CAM-modulet væk fra skallen ved at suge til luftsækken, typisk omkring dag 7-10 i ED. Denne metode kræver ikke, at ægget punkteres33,36. Undersøgelser, der rapporterer embryooverlevelsesrater ved hjælp af sidstnævnte teknik, er få og langt imellem i litteraturen, hvor et hold rapporterer op til 90% af embryooverlevelsen36. En anden mulighed at overveje er skalfri kyllingembryokultur, også kendt som ex ovo-kultur. Fjernelse af æggeskallen giver ubegrænset adgang til embryoet, hvilket letter embryomanipulation og kirurgi og også tillader brug af billeddannelsesteknikker med høj opløsning til levende eksperimenter, såsom fluorescensmikroskopi og mikrocomputertopografi37,38. For at udføre ex ovo-kultur overføres embryoet, herunder dets ekstraembryonale membraner, til en specifik kulturindeslutning mellem dag 2 og dag 4 i ED. Denne teknik er imidlertid meget invasiv, idet embryoner normalt dør omkring dag 12, og færre end 18% af dem overlever indtil dag 1538,39.

Under xenografting eksperimenterne rapporteret heri, blev humane ovarieimplantater podet til CAM'er, der var blevet forsigtigt traumatiseret ved at påføre en lille strimmel sterilt ether-ekstraheret linsepapir på overfladen af epitelet og fjerne det straks. Samlet set var embryooverlevelsesraterne fremragende og nåede 96% i podningsperioden, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der involverede transplantation af ovarievævsfragmenter til CAMs23,40. Desuden har denne fremgangsmåde vist sig at øge transplantatadhæsionsraterne og forbedre den efterfølgende etablering af neovaskularisering, med angiogenese sandsynligvis induceret af den indledende sårhelingsproces23. Faktisk viste xenografting rotte ovarievæv til murin sårhelende granuleringsvæv sig at forbedre transplantatvaskularisering41. På samme måde skabte Donnez et al. i den første levende fødsel, der blev rapporteret efter ortopisk transplantation af kryopræserveret humant ovarievæv, et peritonealt vindue og koagulerede dets margener 7 dage før implantation for at stimulere angiogenese og neovaskularisering på transplantationsstedet42.

Med hensyn til den histologiske vurdering af podet humant ovarievæv var follikeloverlevelsesraterne opmuntrende, idet mere end 80% af folliklerne forblev intakte efter 6 dages podning. Interessant nok er follikeloverlevelsesraterne rapporteret i litteraturen efter transplantation af humant frosset optøet ovarievæv til bughinden hos immundefekte mus kun omkring 30% 10,14,18,43,44, hvilket er meget lavere end i denne undersøgelse. Vores fund af forbedret follikeloverlevelse efter podning af humant ovarievæv til CAM bekræfter vores nyligt offentliggjorte data, hvor vi demonstrerer, at CAM hæmmer follikelaktivering og apoptose24. Desuden var fugleblodkar i stand til at trænge ind i implantaterne, som det fremgår af tilstedeværelsen af aviær erytrocytter efter kun 1 dags transplantation. Alt i alt viser disse resultater, at CAM-tilgangen er en passende model til yderligere undersøgelse af transplantation af humant ovarievæv, da det understøtter vævets overlevelse.

Den største ulempe ved CAM-modellen er den begrænsede periode, hvor podning er mulig. Faktisk kan transplantation tidligst udføres på dag 7 i ED, så snart CAM har udviklet sig tilstrækkeligt, indtil dag 17, før kyllingembryonerne erhverver immunkompetence og lukker. På trods af den korte podningsvarighed er CAM-modellen stadig et nyttigt værktøj til at studere human ovarievævstransplantation i sine første iskæmiske stadier. Man kan også bruge denne model til at teste virkningen af proangiogene faktorer, beskyttende antioxidantmidler, cytokiner, vækst- og reproduktionsrelaterede hormoner og faktorer, der styrer follikelaktivering i podet humant ovarievæv, alt sammen under eksperimentelle forhold, der let kan kontrolleres25,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Mira Hryniuk, BA, for at gennemgå artiklens engelske sprog.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agani hypodermic needle, 19 G Terumo Europe AN*1950R1 19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock Terumo Europe SS*05LE1 5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2 3DHISTECH Image analysis software
Diethyl ether Merck Chemicals 603-022-00-4 Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5% Merck 1098441000 Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%) VWR 97139010 Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge Liebherr 7081260 Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate Schott SLK2 Hot plate used to dry the slides
Incubator Thermo Forma Scientific 3111 10365156 Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source Leica CLS 150 XE Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541 VWR 111-5003 Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin MERCK 1092491000 Staining solution
Methanol VWR 20847307 Methanol
Microtome ThermoScientific-MICROM HM325-2 Microtome
Pannoramic P250 Flash III 3DHISTECH / Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde  Merck 1,04,00,51,000 Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R Sigma P3683-1KG Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile Greiner 628161 Sterile petri dish
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 Pin holder
Polyhatch Brinsea CP01F Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm Sencys / Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins Fine Science Tools 26007-02 Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios  Angelantoni Industrie ST-00275400000 Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90° VWR 631-9483 Glass slides 
Tissue-Tek VIP 6Al Sakura 60320417-0711 VID6E3-1 Automatic embedding device
Titanium forceps Fine Science Tools 11602-16 Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa VWR 28701364 Paraffin-embedding solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
  2. Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247 (2021).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. New England Journal of Medicine. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  4. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. Nature Reviews Endocrinology. 9 (12), 735-749 (2013).
  5. Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
  6. Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
  7. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  8. Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
  9. Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
  10. Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
  11. Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
  12. Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
  13. Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
  14. Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
  15. Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
  16. Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
  17. Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
  18. Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
  19. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
  20. Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
  21. Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
  22. Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
  23. Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
  24. Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
  25. Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
  26. Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876 (2020).
  27. Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
  28. Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61 (2018).
  29. Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
  30. Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986 (2008).
  32. Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
  33. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651 (2020).
  34. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  35. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522 (2013).
  36. Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411 (2015).
  37. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
  38. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154 (2010).
  39. Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
  40. Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  41. Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
  42. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  43. Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  44. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  45. Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).

Tags

Biologi udgave 196 follikelaktivering follikeltab kryopræservering transplantation gnavermodeller alternativer omkostningseffektive tidsbesparende etiske overvejelser xenografting humant ovarievæv immundefekt angiogenese postpodning follikeltabsproces CAM xenografting model revaskulariseringstidsramme vævslevedygtighed
Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) modellen som et værktøj til at studere ovarievævstransplantation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossay, C., Cacciottola, L.,… More

Hossay, C., Cacciottola, L., Storder, S., Van Kerk, O., Dolmans, M. M. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation. J. Vis. Exp. (196), e64867, doi:10.3791/64867 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter