Os organoides derivados do paciente (DOP) são uma cultura tridimensional (3D) que pode imitar o ambiente tumoral in vitro. No câncer de ovário seroso de alto grau, as DOPs representam um modelo para estudar novos biomarcadores e terapias.
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Artigo de método
Geração e Cultivo de Organoides Derivados de Pacientes com Câncer de Ovário Seroso de Alto Grau
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os organoides são modelos de tumores dinâmicos 3D que podem ser cultivados com sucesso a partir de tecido tumoral de ovário derivado do paciente, ascite ou líquido pleural e ajudam na descoberta de novas terapêuticas e biomarcadores preditivos para o câncer de ovário. Esses modelos recapitulam a heterogeneidade clonal, o microambiente tumoral e as interações célula-célula e célula-matriz. Além disso, eles demonstraram corresponder ao tumor primário morfologicamente, citologicamente, imuno-histoquimicamente e geneticamente. Assim, os organoides facilitam a pesquisa sobre as células tumorais e o microambiente tumoral e são superiores às linhagens celulares. O presente protocolo descreve métodos distintos para gerar organoides de câncer de ovário derivados de pacientes a partir de tumores, ascite e amostras de líquido pleural com uma taxa de sucesso superior a 97%. As amostras do paciente são separadas em suspensões celulares por digestão mecânica e enzimática. As células são então banhadas utilizando um extrato de membrana basal (BME) e são suportadas com meios de crescimento otimizados contendo suplementos específicos para a cultura de câncer de ovário seroso de alto grau (HGSOC). Depois de formar organoides iniciais, as DOP podem sustentar a cultura a longo prazo, incluindo a passagem para expansão para experimentos subsequentes.
Introdução
Em 2021, aproximadamente 21.410 mulheres nos Estados Unidos foram recém-diagnosticadas com câncer de ovário epitelial, e 12.940 mulheres morreram dessa doença1. Embora avanços suficientes tenham sido feitos na cirurgia e na quimioterapia, mais de 70% dos pacientes com doença avançada desenvolvem resistência quimioterápica e morrem dentro de 5 anos após o diagnóstico 2,3. Assim, novas estratégias para tratar esta doença mortal e modelos representativos e confiáveis para a pesquisa pré-clínica são urgentemente necessários.
Linhagens celulares de câncer e xenoen....
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Protocolo
Todos os espécimes de tecido humano coletados para pesquisa foram obtidos de acordo com o protocolo aprovado pelo Institutional Review Board (IRB). Os protocolos descritos abaixo foram realizados em um ambiente estéril de cultura de tecidos humanos. O termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de seres humanos. As pacientes elegíveis tinham que ter um diagnóstico ou diagnóstico presumido de câncer de ovário, estar dispostas e capazes de assinar o consentimento informado e ter pelo menos 18 anos de idade. Tecido tumoral (tumor primário maligno ou sítios metastáticos), ascite e líquido pleural foram obtidos de pacientes consensuais no momento do procedimento.....
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Resultados
Para gerar DOPs, as amostras foram digeridas mecanicamente e enzimaticamente em suspensões unicelulares. As células foram então ressuspensas em BME e suplementadas com meios especificamente modificados (Figura 3). Os organoides são tipicamente estabelecidos ao longo de um período de tempo de 10 dias, após o qual demonstram organoides discretos em cultura (Figura 4).
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Discussão
O câncer de ovário é extremamente mortal devido ao seu estágio avançado no diagnóstico, bem como ao desenvolvimento comum de resistência à quimioterapia. Muitos avanços na pesquisa do câncer de ovário foram feitos utilizando linhas celulares de câncer e modelos PDX; no entanto, há uma necessidade evidente de um modelo in vitro mais representativo e acessível. As DOP têm demonstrado representar com precisão a heterogeneidade tumoral, o microambiente tumoral e as características genômicas e transcriptômicas de seu.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Somos gratos pela orientação de Ron Bose, MD, PhD, e pela assistência de Barbara Blachut, MD, no estabelecimento deste protocolo. Também gostaríamos de agradecer à Escola de Medicina da Universidade de Washington no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia e Divisão de Oncologia Ginecológica da Universidade de Washington, ao Programa Acadêmico do Decano da Universidade de Washington e ao Programa de Desenvolvimento de Cientistas Reprodutivos por seu apoio a este projeto.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicilina-Estreptomicina | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| Prato para Cultura de Tecidos de 10 cm | TPP | 93100 | |
| 10 mL Pipeta | |||
| 100 µ m Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL tubos de centrífuga | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldeído Fixador | Sigma-Aldrich | ||
| 37 ° C banho-maria | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Suplemento de Mídia Condicionada | Millipore Sigma | SCM104 | |
| Placas de 6 poços | TPP | 92006 | |
| 70% Etanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Centrífuga 17504044 | |||
| B-27 | Life | ||
| Cultrex Tipo 2 | R& D Systems | 3533-010-02 | extrato de membrana basal |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Buffer de Reação | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator com Aquecedores | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | Usamos o protocolo do fabricante. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptídeo, L-alanil-L-glutamina |
| Hematoxilina e Eosina Cera | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast | Fisher Scientific | ||
| Recipiente de Congelamento Mr. Frosty | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetilcisteína | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipeta com Pontas | |||
| p200 Pipeta com Pontas | |||
| Pipetas Pasteur 9 " | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Controlador | |||
| pipeta Prostaglandina E2 | R & D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinante Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Meio de congelamento | Invitrogen | 12648010 | |
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inibidor (Y-27632) | R & D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | de Cultura de Tecidos TP90076 | MidSci | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | enzima recombinante de origem animal |
| Tipo II Collagenase Life | Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
Referências
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organ....
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Reimpressões e permissões
