O presente protocolo descreve métodos para avaliar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados de pacientes. Aqui estão incluídos métodos abrangentes de chapeamento e coloração, bem como procedimentos de quantificação detalhados e objetivos.
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Artigo de método
Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imunofluorescência é uma das técnicas mais utilizadas para visualizar antígenos alvo com alta sensibilidade e especificidade, permitindo a identificação e localização precisas de proteínas, glicanos e pequenas moléculas. Embora esta técnica esteja bem estabelecida em cultura de células bidimensionais (2D), pouco se sabe sobre seu uso em modelos celulares tridimensionais (3D). Os organoides do câncer de ovário são modelos tumorais 3D que recapitulam a heterogeneidade clonal das células tumorais, o microambiente tumoral e as interações célula-célula e célula-matriz. Assim, são superiores às linhagens celulares para a avaliação da sensibilidade a fármacos e biomarcadores funcionais. Portanto, a capacidade de utilizar a imunofluorescência em organoides primários de câncer de ovário é extremamente benéfica na compreensão da biologia desse câncer. O presente estudo descreve a técnica de imunofluorescência para detectar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário (DOP) de alto grau derivados de pacientes serosos. Após a exposição das DOP à radiação ionizante, a imunofluorescência é realizada em organoides intactos para avaliar as proteínas nucleares como focos. As imagens são coletadas usando imagens z-stack em microscopia confocal e analisadas usando software automatizado de contagem de focos. Os métodos descritos permitem a análise do recrutamento temporal e especial de proteínas de reparação de danos no DNA e a colocalização dessas proteínas com marcadores do ciclo celular.
Introdução
O câncer de ovário é a principal causa de morte por malignidade ginecológica. A maioria dos pacientes é tratada com medicamentos prejudiciais ao DNA, como a carboplatina, e aqueles com tumores deficientes em reparo homólogo de recombinação (HRR) podem receber inibidores da polipoli (ADP-ribose) polimerase (PARP) 1,2. No entanto, a maioria dos pacientes desenvolve resistência a essas terapias e morre dentro de 5 anos após o diagnóstico. A desregulação da resposta a danos no DNA (DDR) tem sido associada ao desenvolvimento de câncer de ovário e à resistência à quimioterapia e ao inibidor dePARP3....
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Protocolo
O tecido tumoral e a ascite foram obtidos após a obtenção do consentimento da paciente como parte de um biorrepositório de oncologia ginecológica aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Washington em St. Louis. As pacientes foram incluídas se tivessem câncer de ovário seroso de alto grau em estágio avançado (HGSOC). Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente no banco, salvo indicação em contrário. Todos os reagentes foram preparados à temperatura ambiente (salvo indicação em contrário) e armazenados a 4 °C.
1. Geração de organoides
- Gerar os organoides seguindo o....
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Resultados
O protocolo apresentado pode colorir, visualizar e quantificar com sucesso proteínas de reparo de danos ao DNA nuclear em organoides. Essa técnica foi utilizada para corar e avaliar as DOP antes e após a irradiação. As DOP foram expostas a 10 Gy de radiação e avaliadas quanto aos seguintes biomarcadores: ɣ-H2AX (Figura 1), um marcador de dano ao DNA; RAD51 (Figura 2), um marcador para HRR; 53BP1, um marcador de NHEJ; RPA, um marcador de tensão de replicação (
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Discussão
A resposta a danos no DNA desempenha um papel integral no desenvolvimento do câncer de ovário e na resistência à quimioterapia. Portanto, uma compreensão completa dos mecanismos de reparo do DNA é imperativa. Aqui, uma metodologia é apresentada para estudar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides intactos 3D. Um protocolo reprodutível e confiável é desenvolvido utilizando anticorpos característicos para avaliar danos ao DNA, recombinação homóloga, junção final não homóloga e estresse de replicação. É importante.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Somos gratos pela orientação de Pavel Lobachevsky, PhD no estabelecimento deste protocolo. Também gostaríamos de agradecer à Escola de Medicina da Universidade de Washington no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia e Divisão de Oncologia Ginecológica da Universidade de Washington, ao Programa Acadêmico do Reitor da Universidade de Washington, à Fundação do Grupo de Oncologia Ginecológica e ao Programa de Desenvolvimento de Cientistas Reprodutivos por seu apoio a este projeto.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1x solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (PBS) | Fisher Scientific | ||
| Anticorpo Ant-53BP1 | A BD Biosciences | 612522 | diluída a 1:500 em tampão de coloração |
| Anticorpo Anti-Geminina | Abcam | ab104306 | diluído para 1:200 em tampão de coloração |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluído a 1:400 em tampão de coloração |
| Anti-RAD51 Anticorpo | Abcam | ab133534 | diluído a 1:1000 em tampão de coloração |
| Anti-yH2AX Anticorpo | Millipore-Sigma | 05-636 | diluído a 1:500 em tampão de coloração |
| Anticorpo Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluído a 1:200 em tampão de coloração |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrífuga; Centrífuga Sorvall St 16R | Thermo Scientific | ||
| Microscópio Confocal, sistema confocal Leica SP5 DMI4000 | Leica | ||
| Tubos Cônicos, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Contador de Células Automatizado Countess 3 FL (Máquina de Contagem de Células) | Thermo Scientific | ||
| Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Qualquer esmalte transparente será suficiente | |
| Cultrex Extrato de Membrana de Base RGF, Tipo 2 | R& D Systems | 3533-010-02 | Provavelmente poderia usar Matrigel ou outra Matriz BME |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Reagente ReadyProbes de Célula Fixa, Diluído em 1x PBS |
| Glicina | Fisher Scientific | ||
| JCountPro | JCountPro | Para acessar o software, envie um e-mail para: jcountpro@gmail.com | |
| Tubos de Microcentrífuga | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Esmalte para Unhas | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldeído (PFA), 2% | Ciências da Microscopia Eletrônica | 157-4 | Diluir para 4% de PFA em PBS++ para obter 2% de PFA |
| Permeabilização Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton em PBS++ | |
| Pipeta | Rainin | 17014382 | |
| Ponteiras de Pipeta | Chuva | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Tampão de Coloração | Feito em Laboratório | 0.5% BSA, 0.15% Glicina, 0.1% X-100 Triton em PBS++ | |
| Sistema de Deslizamento de Câmara Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | ||
| Solução de Azul de Tripano, 0,4% | Thermo Scientific | ||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | enzima recombinante X-RAD |
| 320 Irradiador Biológico livre de | Irradiação de Raios-X de Precisão | X-RAD320 |
Referências
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2....
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Reimpressões e permissões
