Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência

O câncer de ovário é a principal causa de morte por malignidade ginecológica. A maioria dos pacientes é tratada com medicamentos prejudiciais ao DNA, como a carboplatina, e aqueles com tumores deficientes em reparo homólogo de recombinação (HRR) podem receber inibidores da polipoli (ADP-ribose) polimerase (PARP) ^1,2. No entanto, a maioria dos pacientes desenvolve resistência a essas terapias e morre dentro de 5 anos após o diagnóstico. A desregulação da resposta a danos no DNA (DDR) tem sido associada ao desenvolvimento de câncer de ovário e à resistência à quimioterapia e ao inibidor de^PARP3. Assim, o estudo da DDR é imperativo na compreensão da fisiopatologia do câncer de ovário, potenciais biomarcadores e novas terapias direcionadas.

Os métodos atuais para avaliar a DDR utilizam imunofluorescência (FI), pois isso permite a identificação e localização precisas de proteínas de dano ao DNA e análogos de nucleotídeos. Uma vez que há uma quebra de fita dupla (DSB) no DNA, a proteína histona H2AX é rapidamente fosforilada, formando um foco onde as proteínas de reparo de danos ao DNA se reúnem⁴. Esta fosforilação pode ser facilmente identificada utilizando IF; de fato, o ensaio ɣ-H2AX tem sido comumente empregado para confirmar a indução de um DSB 5,6,7,8,9. O aumento do dano ao DNA tem sido associado à sensibilidade à platina e à eficácia de agentes prejudiciais ao DNA ^10,11,12, e ɣ-H2AX tem sido proposto como um biomarcador associado à resposta quimioterápica em outros tratamentos contra o câncer ¹³. Após um DSB, uma célula proficiente em HRR realiza uma série de eventos que levam o BRCA1 e o BRCA2 a recrutar RAD51 para substituir a proteína de replicação A (RPA) e se ligar ao DNA. O reparo HRR usa um modelo de DNA para reparar fielmente o DSB. No entanto, quando os tumores são deficientes em HRR, eles dependem de vias de reparo alternativas, como a junção final não homóloga (NHEJ). Sabe-se que o NHEJ é propenso a erros e cria uma alta carga mutacional na célula, que usa o 53BP1 como regulador positivo¹⁴. Essas proteínas de dano ao DNA podem ser identificadas com precisão como focos usando IF. Além da coloração para proteínas, o IF pode ser usado para estudar a proteção do garfo e a formação de lacunas de DNA de fita simples. A capacidade de ter garfos estáveis tem sido correlacionada com a resposta à platina e, recentemente, ensaios de gap mostraram o potencial de predizer a resposta aos inibidores de PARP 6,15,16,17. Portanto, a coloração para os análogos de nucleotídeos após a introdução no genoma é outra maneira de estudar a DDR.

Até o momento, a avaliação da DDR no câncer de ovário tem sido amplamente limitada a linhagens celulares 2D homogêneas que não recapitulam a heterogeneidade clonal, o microambiente ou a arquitetura de tumores in vivo ^18,19. Pesquisas recentes sugerem que os organoides são superiores às linhagens celulares 2D no estudo de processos biológicos complexos, como os mecanismos DDR⁶. A presente metodologia avalia RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA e geminina em DOP. Esses métodos avaliam o organoide intacto e permitem o estudo dos mecanismos de DDR em um ambiente mais semelhante ao microambiente tumoral in vivo. Juntamente com a microscopia confocal e a contagem automatizada de focos, essa metodologia pode ajudar na compreensão da via DDR no câncer de ovário e na personalização dos planos de tratamento para as pacientes.

O tecido tumoral e a ascite foram obtidos após a obtenção do consentimento da paciente como parte de um biorrepositório de oncologia ginecológica aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Washington em St. Louis. As pacientes foram incluídas se tivessem câncer de ovário seroso de alto grau em estágio avançado (HGSOC). Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente no banco, salvo indicação em contrário. Todos os reagentes foram preparados à temperatura ambiente (salvo indicação em contrário) e armazenados a 4 °C.

1. Geração de organoides

1. Gerar os organoides seguindo o relatório publicado anteriormente²⁰.

2. Chapeamento e irradiação de organoides

1. Usando organoides em cultura, desaloje as abas dos organoides do prato de cultura através da manipulação manual de uma ponta de pipeta. Recolher os organoides num tubo cónico de 15 ml.
2. Centrifugar o tubo cónico a 1,650 x g durante 5 min a 4 °C. Usando uma pipeta, aspirar o sobrenadante com cuidado.
3. Adicionar 1.000 μL de uma enzima recombinante isenta de origem animal ao pellet (ver Tabela de Materiais). Misturar a solução e incubar durante 15 minutos a 37 °C.
4. Centrifugar a solução a 1,650 x g durante 5 min a 4 °C. Usando uma pipeta, aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
5. Após centrifugação e aspiração, ressuspender o pellet em 1.000 μL de solução salina tamponada com fosfato.
6. Transferir 10 μL da solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e misturar com 10 μL de azul de tripano.
7. Tomar 10 μL da solução de células azuis de tripano numa lâmina de câmara de contagem de células e inseri-la na máquina de contagem de células (ver Tabela de Materiais).
8. Placa de 40.000 células por 20 μL de extrato de membrana basal (BME) em uma lâmina de câmara de vidro de 8 poços (ver Tabela de Materiais). Isso mantém os organoides por 3-5 dias para permitir que as células formem organoides e cresçam até um tamanho adequado.
9. Para induzir quebras de DNA de fita dupla, irradie os organoides banhados com 10 Gray (Gy) de irradiação ɣ (consulte Tabela de Materiais para detalhes do irradiador).
   NOTA: Isso pode levar até 5-10 min.
10. Incubar os organoides em seus meios de cultura em incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO₂ por 4 h.

3. Coloração por imunofluorescência

NOTA: Os volumes referem-se à quantidade por poço da lâmina da câmara de 8 poços (~300 μL).

1. Após a irradiação e incubação dos organoides, aspirar o meio com uma pipeta, com cuidado, para não perturbar a matriz 3D. Lave com 300 μL de PBS.
2. Fixe os organoides em 300 μL de paraformaldeído a 2% (PFA) por 10 min.
   NOTAS: Não deixe por muito tempo, pois o BME irá despolimerizar e pode ser aspirado.
3. Lave os organoides com 300 μL de tampão de coloração (ver Tabela de Materiais). Coloque em um agitador por 5 min.
4. Para permeabilização, adicione suavemente 300 μL de tampão de permeabilização (ver Tabela de Materiais) e incube por 20 min. Lavar com 300 μL de tampão de coloração. Coloque em um agitador por 5 min.
5. Adicione 300 μL de tampão de coloração para bloquear a etapa de permeabilização. Coloque em um agitador por 30 min. Aspirar para fora do tampão de coloração usando uma pipeta.
6. Adicionar 300 μL de anticorpos primários (coelho anti-RAD51, rato anti-Geminin, coelho anti-RPA, rato anti-ɣH2AX, coelho anti-Geminin, rato anti-53BP1; ver Tabela de Materiais) diluídos em tampão de coloração. Incubar a 4 °C durante 16 h.
   NOTA: Evite a co-coloração com o mesmo animal hospedeiro. Deixe a tampa fora para evitar que os anticorpos se misturem nos poços vizinhos.
7. Remova a solução primária de anticorpos. Realize três lavagens com 300 μL de tampão de coloração por 5 min cada no agitador.
8. Adicionar 300 μL de anticorpo secundário (anti-rato de cabra Alexa fluor 488 e cabra anti-coelho Alexa fluor 647; ver Tabela de Materiais) diluído em tampão de coloração e incubar durante 1 h no escuro.
   Observação : todas as etapas subsequentes devem ser executadas no escuro.
9. Aspirar a solução secundária de anticorpos. Adicionar 300 μL de DAPI diluído. Coloque em um agitador por 5 min.
10. Realize três lavagens com 300 μL de tampão de coloração por 5 min cada no agitador. Remova o tampão de coloração e retire as câmaras utilizando o kit de remoção incluído com as lâminas da câmara (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Certifique-se de não avançar muito para interromper a matriz 3D.
11. Usando uma ponta de pipeta p200 com a ponta cortada, adicione o meio de montagem (consulte Tabela de materiais) para cobrir cada poço com uma aba organoide (por exemplo, 20-30 μL para cada guia organoide).
12. Coloque uma tampa sobre o espécime, evitando bolhas.
13. Pegue o esmalte transparente e pinte-o nas laterais do vidro da tampa para selar a lâmina. Deixe endurecer durante 1 h e coloque-o a -20 °C.
    NOTA: Após a imagem, a lâmina pode ser armazenada por pelo menos 6 meses com perda mínima de fluorescência.

4. Imagens

1. Adquira imagens usando um microscópio confocal (ver Tabela de Materiais) a 63x a objetivo com óleo de imersão.
   NOTA: Se a imagem de proteínas nucleares, 63x é vantajoso, mas 40x também é aceitável.
2. Use DAPI para localizar os organoides através da ocular. Selecione os filtros apropriados para microscopia com base nos fluoróforos utilizados. Defina os parâmetros para capturar as imagens z-stack.
   NOTA: Os fluoróforos utilizados no estudo foram DAPI, 488 e 647. Os lasers 405, 488 e 638 foram ligados para visualizar a coloração.
   NOTA: A pilha z recomendada depende do poder de resolução do objetivo.
3. Ajuste a imagem ao vivo: defina o foco, a intensidade do laser, etc.
   NOTA: Quanto maior a intensidade do laser, maior a probabilidade de a amostra ser fotobranqueada. Portanto, selecione uma intensidade de laser ideal.
4. Adquira a pilha z.
   NOTA: Isso pode levar até 5-10 min.
5. A partir das imagens coletadas na pilha z, captura de tela pelo menos três imagens por pilha.
   NOTA: Certifique-se de obter capturas de tela em toda a pilha para não duplicar os núcleos ao quantificar.
6. Salve cada arquivo como um TIFF e prossiga para a análise (etapa 5).

5. Análise

NOTA: Use o JCountPro para todas as análises de imagem seguindo o relatório^{21 publicado anteriormente}. Para obter este software, consulte a publicação associada.

1. No painel de análise de objetos (parte superior do programa) na guia de seleção de arquivos (parte inferior do programa), selecione os arquivos TIFF .
2. Clique em Adicionar para mover os arquivos selecionados para o grupo de arquivos selecionados. Selecione Exibir.
3. Na guia de segmentação, selecione azul como a cor dos núcleos. Selecione Segmentação automática para otimizar o limiar dos núcleos.
   NOTA: Se a segmentação automática não identificar com precisão os objetos, o usuário poderá ajustar o ajuste fino e o ajuste bruto da imagem ou consultar o manual do usuário para otimizar ainda mais a segmentação.
4. No painel de objetos, selecione Dividir objetos grandes automaticamente e otimizar o tamanho dos núcleos.
   NOTA: Os núcleos normalmente têm um tamanho incondicional de 5.000 pixels, enquanto o tamanho condicional é de 1.500 pixels. Consulte o manual do usuário para otimizar ainda mais o tamanho dos objetos.
5. Selecione Identificar objetos para testar os parâmetros.
   NOTA: Se esses parâmetros não forem precisos, o tamanho e o ajuste podem ser ajustados junto com outras configurações. Consulte o manual do usuário para obter instruções sobre otimização adicional.
6. Depois de ajustar os parâmetros para a imagem, selecione Identificar objetos em todas as imagens para identificar os núcleos em todas as imagens selecionadas.
7. Selecione o painel Análise de focos (parte superior do programa).
8. Na guia Selecionar arquivos (parte inferior do programa), selecione os arquivos TIFF que foram usados para análise de objetos e selecione os Botões de seta (>>) para mover as imagens para o grupo de arquivos de imagem.
9. No grupo de diretórios abaixo dos arquivos de imagem que foram movidos, clique duas vezes na pasta Edição Manual e selecione para mover os arquivos ioc para o grupo de arquivos da coleção de objetos.
   Observação : todos os TIFFs selecionados devem ter correspondido a arquivos ioc.
10. Pressione Select (Selecionar ) para mover os arquivos para o grupo de arquivos selecionado. Selecione a guia Contagem de focos na parte inferior do programa.
11. Otimize os parâmetros seguindo as etapas abaixo.
    1. Índice de configurações da cartola: 12.
    2. Canal de foco: Selecione a cor dos focos (verde: ɣ-H2AX; vermelho: RAD51).
    3. Configurações da cúpula H: altura da cúpula %: 30; limiar %: 28 e 28.
    4. Configuração de forma/tamanho: Tamanho mínimo do foco, pixels: 5. Selecione Aplicar forma/tamanho. Tamanho máximo do foco (condicional): 32. Redondeza mínima, x100: 96. Foco máximo, pixels: 60.
    5. Filtro de ruído: tamanho 1.
       NOTA: Se determinar se um núcleo é positivo para coloração de geminina, sob o segundo canal, selecione verde e, em análise, selecione intensidade.
12. Para testar os parâmetros definidos, selecione os botões abaixo na ordem: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
    Observação : se esses parâmetros não funcionarem, o tamanho e o ajuste podem ser ajustados junto com outras configurações. Consulte o manual do usuário para saber mais sobre como a imagem pode ser ainda mais otimizada.
13. Uma vez que os parâmetros são otimizados para as imagens selecionadas, selecione Contagem automática para contar os focos em cada imagem por núcleo. Se o segundo canal for desejado, o programa determinará a intensidade que pode ser usada.

O protocolo apresentado pode colorir, visualizar e quantificar com sucesso proteínas de reparo de danos ao DNA nuclear em organoides. Essa técnica foi utilizada para corar e avaliar as DOP antes e após a irradiação. As DOP foram expostas a 10 Gy de radiação e avaliadas quanto aos seguintes biomarcadores: ɣ-H2AX (Figura 1), um marcador de dano ao DNA; RAD51 (Figura 2), um marcador para HRR; 53BP1, um marcador de NHEJ; RPA, um marcador de tensão de replicação (Figura 3); e geminina, um marcador do ciclo celular da fase G2/S14. A dose de 10 Gy foi escolhida com base em pesquisas previamente publicadas que estudaram danos ao DNA em câncer de ovário 6,22. O software JCountPro foi utilizado para identificar o núcleo e quantificar o número de focos dentro do núcleo com parâmetros ilustrados13 (Figura 4). O software identifica o núcleo (Figura 4A,B), depois os focos nucleares (Figura 4C) e filtra os focos das células positivas para geminina (Figura 4D).

Figura 1: Focos ɣ-H2AX em DOP antes e após a irradiação. Imagens representativas de focos DAPI e ɣ-H2AX em DOPs antes e depois da irradiação a 10x com inserções de 63x. Barras de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Focos de RAD51 e geminina em DOP antes e após a irradiação. Imagens representativas de DAPI, geminina, RAD51 e co-coloração de focos de geminina/RAD51 DOP antes e após a irradiação a 10x com inserções de 63x. Barras de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: RPA e 53BP1 em DOP antes e após a irradiação. Imagens representativas de (A) DAPI, RPA; (B) geminina, 53BP1 e cocoloração de focos de geminina/53BP1 a 10x com inserções de 63x. Barras de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: O fluxo de trabalho de quantificação do software JCountPro. (A) Na análise de objetos, o canal azul é selecionado para identificar os objetos azuis, núcleos, e depois é otimizado automaticamente selecionando a segmentação automática (seta vermelha). (B) Sob divisão automática, o tamanho do objeto (núcleos) é adaptado ao tamanho da imagem e ampliação. O botão identificar objeto é selecionado para testar os parâmetros (1) e o botão identificar objetos em todas as imagens (seta vermelha) é selecionado para identificar objetos (núcleos) para cada imagem. (C) Na aba de análise de focos, as imagens são inseridas e os parâmetros de contagem de focos são definidos: primeiro, a cor dos focos é selecionada sob o canal de foco, verde; o índice de cartola é definido como 12; as configurações da cúpula H são definidas para ter uma porcentagem de altura da cúpula de 30 e uma porcentagem limite de 28; a forma e o tamanho dos focos são otimizados para o tamanho da imagem com os parâmetros manuais de pixels de tamanho máximo de foco em 60 e arredondamento mínimo x 100 em 96; finalmente, o filtro de ruído é aplicado. As configurações são testadas aplicando a cartola, a cúpula H e a contagem de focos (1-3). Para quantificar os focos ɣ-H2AX por célula, pressione start (seta vermelha). (D) Para os focos RAD51, as configurações são aplicadas conforme ilustrado para os focos ɣ-H2AX, exceto o canal de foco que é alterado para vermelho; no entanto, para identificar núcleos que são corados com geminina, o segundo canal é selecionado para verde, e a análise é alterada para intensidade. Os parâmetros são testados aplicando a cartola, a cúpula H e a contagem de focos (1-3), pressionando em seguida start (seta vermelha) para quantificar todos os focos RAD51 e avaliando a intensidade do verde por célula em cada imagem. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.