É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência

2.8K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/64881

⸱

24 de fevereiro de 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Washington University in St. Louis, 2University of California San Francisco

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve métodos para avaliar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados de pacientes. Aqui estão incluídos métodos abrangentes de chapeamento e coloração, bem como procedimentos de quantificação detalhados e objetivos.

Resumo

A imunofluorescência é uma das técnicas mais utilizadas para visualizar antígenos alvo com alta sensibilidade e especificidade, permitindo a identificação e localização precisas de proteínas, glicanos e pequenas moléculas. Embora esta técnica esteja bem estabelecida em cultura de células bidimensionais (2D), pouco se sabe sobre seu uso em modelos celulares tridimensionais (3D). Os organoides do câncer de ovário são modelos tumorais 3D que recapitulam a heterogeneidade clonal das células tumorais, o microambiente tumoral e as interações célula-célula e célula-matriz. Assim, são superiores às linhagens celulares para a avaliação da sensibilidade a fármacos e biomarcadores funcionais. Portanto, a capacidade de utilizar a imunofluorescência em organoides primários de câncer de ovário é extremamente benéfica na compreensão da biologia desse câncer. O presente estudo descreve a técnica de imunofluorescência para detectar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário (DOP) de alto grau derivados de pacientes serosos. Após a exposição das DOP à radiação ionizante, a imunofluorescência é realizada em organoides intactos para avaliar as proteínas nucleares como focos. As imagens são coletadas usando imagens z-stack em microscopia confocal e analisadas usando software automatizado de contagem de focos. Os métodos descritos permitem a análise do recrutamento temporal e especial de proteínas de reparação de danos no DNA e a colocalização dessas proteínas com marcadores do ciclo celular.

Introdução

O câncer de ovário é a principal causa de morte por malignidade ginecológica. A maioria dos pacientes é tratada com medicamentos prejudiciais ao DNA, como a carboplatina, e aqueles com tumores deficientes em reparo homólogo de recombinação (HRR) podem receber inibidores da polipoli (ADP-ribose) polimerase (PARP) 1,2. No entanto, a maioria dos pacientes desenvolve resistência a essas terapias e morre dentro de 5 anos após o diagnóstico. A desregulação da resposta a danos no DNA (DDR) tem sido associada ao desenvolvimento de câncer de ovário e à resistência à quimioterapia e ao inibidor dePARP3. Assim, o estudo da DDR é imperativo na compreensão da fisiopatologia do câncer de ovário, potenciais biomarcadores e novas terapias direcionadas.

Os métodos atuais para avaliar a DDR utilizam imunofluorescência (FI), pois isso permite a identificação e localização precisas de proteínas de dano ao DNA e análogos de nucleotídeos. Uma vez que há uma quebra de fita dupla (DSB) no DNA, a proteína histona H2AX é rapidamente fosforilada, formando um foco onde as proteínas de reparo de danos ao DNA se reúnem4. Esta fosforilação pode ser facilmente identificada utilizando IF; de fato, o ensaio ɣ-H2AX tem sido comumente empregado para confirmar a indução de um DSB 5,6,7,8,9. O aumento do dano ao DNA tem sido associado à sensibilidade à platina e à eficácia de agentes prejudiciais ao DNA 10,11,12, e ɣ-H2AX tem sido proposto como um biomarcador associado à resposta quimioterápica em outros tratamentos contra o câncer 13. Após um DSB, uma célula proficiente em HRR realiza uma série de eventos que levam o BRCA1 e o BRCA2 a recrutar RAD51 para substituir a proteína de replicação A (RPA) e se ligar ao DNA. O reparo HRR usa um modelo de DNA para reparar fielmente o DSB. No entanto, quando os tumores são deficientes em HRR, eles dependem de vias de reparo alternativas, como a junção final não homóloga (NHEJ). Sabe-se que o NHEJ é propenso a erros e cria uma alta carga mutacional na célula, que usa o 53BP1 como regulador positivo14. Essas proteínas de dano ao DNA podem ser identificadas com precisão como focos usando IF. Além da coloração para proteínas, o IF pode ser usado para estudar a proteção do garfo e a formação de lacunas de DNA de fita simples. A capacidade de ter garfos estáveis tem sido correlacionada com a resposta à platina e, recentemente, ensaios de gap mostraram o potencial de predizer a resposta aos inibidores de PARP 6,15,16,17. Portanto, a coloração para os análogos de nucleotídeos após a introdução no genoma é outra maneira de estudar a DDR.

Até o momento, a avaliação da DDR no câncer de ovário tem sido amplamente limitada a linhagens celulares 2D homogêneas que não recapitulam a heterogeneidade clonal, o microambiente ou a arquitetura de tumores in vivo 18,19. Pesquisas recentes sugerem que os organoides são superiores às linhagens celulares 2D no estudo de processos biológicos complexos, como os mecanismos DDR6. A presente metodologia avalia RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA e geminina em DOP. Esses métodos avaliam o organoide intacto e permitem o estudo dos mecanismos de DDR em um ambiente mais semelhante ao microambiente tumoral in vivo. Juntamente com a microscopia confocal e a contagem automatizada de focos, essa metodologia pode ajudar na compreensão da via DDR no câncer de ovário e na personalização dos planos de tratamento para as pacientes.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

O tecido tumoral e a ascite foram obtidos após a obtenção do consentimento da paciente como parte de um biorrepositório de oncologia ginecológica aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Washington em St. Louis. As pacientes foram incluídas se tivessem câncer de ovário seroso de alto grau em estágio avançado (HGSOC). Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente no banco, salvo indicação em contrário. Todos os reagentes foram preparados à temperatura ambiente (salvo indicação em contrário) e armazenados a 4 °C.

1. Geração de organoides

  1. Gerar os organoides seguindo o relatório publicado anteriormente20.

2. Chapeamento e irradiação de organoides

  1. Usando organoides em cultura, desaloje as abas dos organoides do prato de cultura através da manipulação manual de uma ponta de pipeta. Recolher os organoides num tubo cónico de 15 ml.
  2. Centrifugar o tubo cónico a 1,650 x g durante 5 min a 4 °C. Usando uma pipeta, aspirar o sobrenadante com cuidado.
  3. Adicionar 1.000 μL de uma enzima recombinante isenta de origem animal ao pellet (ver Tabela de Materiais). Misturar a solução e incubar durante 15 minutos a 37 °C.
  4. Centrifugar a solução a 1,650 x g durante 5 min a 4 °C. Usando uma pipeta, aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
  5. Após centrifugação e aspiração, ressuspender o pellet em 1.000 μL de solução salina tamponada com fosfato.
  6. Transferir 10 μL da solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e misturar com 10 μL de azul de tripano.
  7. Tomar 10 μL da solução de células azuis de tripano numa lâmina de câmara de contagem de células e inseri-la na máquina de contagem de células (ver Tabela de Materiais).
  8. Placa de 40.000 células por 20 μL de extrato de membrana basal (BME) em uma lâmina de câmara de vidro de 8 poços (ver Tabela de Materiais). Isso mantém os organoides por 3-5 dias para permitir que as células formem organoides e cresçam até um tamanho adequado.
  9. Para induzir quebras de DNA de fita dupla, irradie os organoides banhados com 10 Gray (Gy) de irradiação ɣ (consulte Tabela de Materiais para detalhes do irradiador).
    NOTA: Isso pode levar até 5-10 min.
  10. Incubar os organoides em seus meios de cultura em incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2 por 4 h.

3. Coloração por imunofluorescência

NOTA: Os volumes referem-se à quantidade por poço da lâmina da câmara de 8 poços (~300 μL).

  1. Após a irradiação e incubação dos organoides, aspirar o meio com uma pipeta, com cuidado, para não perturbar a matriz 3D. Lave com 300 μL de PBS.
  2. Fixe os organoides em 300 μL de paraformaldeído a 2% (PFA) por 10 min.
    NOTAS: Não deixe por muito tempo, pois o BME irá despolimerizar e pode ser aspirado.
  3. Lave os organoides com 300 μL de tampão de coloração (ver Tabela de Materiais). Coloque em um agitador por 5 min.
  4. Para permeabilização, adicione suavemente 300 μL de tampão de permeabilização (ver Tabela de Materiais) e incube por 20 min. Lavar com 300 μL de tampão de coloração. Coloque em um agitador por 5 min.
  5. Adicione 300 μL de tampão de coloração para bloquear a etapa de permeabilização. Coloque em um agitador por 30 min. Aspirar para fora do tampão de coloração usando uma pipeta.
  6. Adicionar 300 μL de anticorpos primários (coelho anti-RAD51, rato anti-Geminin, coelho anti-RPA, rato anti-ɣH2AX, coelho anti-Geminin, rato anti-53BP1; ver Tabela de Materiais) diluídos em tampão de coloração. Incubar a 4 °C durante 16 h.
    NOTA: Evite a co-coloração com o mesmo animal hospedeiro. Deixe a tampa fora para evitar que os anticorpos se misturem nos poços vizinhos.
  7. Remova a solução primária de anticorpos. Realize três lavagens com 300 μL de tampão de coloração por 5 min cada no agitador.
  8. Adicionar 300 μL de anticorpo secundário (anti-rato de cabra Alexa fluor 488 e cabra anti-coelho Alexa fluor 647; ver Tabela de Materiais) diluído em tampão de coloração e incubar durante 1 h no escuro.
    Observação : todas as etapas subsequentes devem ser executadas no escuro.
  9. Aspirar a solução secundária de anticorpos. Adicionar 300 μL de DAPI diluído. Coloque em um agitador por 5 min.
  10. Realize três lavagens com 300 μL de tampão de coloração por 5 min cada no agitador. Remova o tampão de coloração e retire as câmaras utilizando o kit de remoção incluído com as lâminas da câmara (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Certifique-se de não avançar muito para interromper a matriz 3D.
  11. Usando uma ponta de pipeta p200 com a ponta cortada, adicione o meio de montagem (consulte Tabela de materiais) para cobrir cada poço com uma aba organoide (por exemplo, 20-30 μL para cada guia organoide).
  12. Coloque uma tampa sobre o espécime, evitando bolhas.
  13. Pegue o esmalte transparente e pinte-o nas laterais do vidro da tampa para selar a lâmina. Deixe endurecer durante 1 h e coloque-o a -20 °C.
    NOTA: Após a imagem, a lâmina pode ser armazenada por pelo menos 6 meses com perda mínima de fluorescência.

4. Imagens

  1. Adquira imagens usando um microscópio confocal (ver Tabela de Materiais) a 63x a objetivo com óleo de imersão.
    NOTA: Se a imagem de proteínas nucleares, 63x é vantajoso, mas 40x também é aceitável.
  2. Use DAPI para localizar os organoides através da ocular. Selecione os filtros apropriados para microscopia com base nos fluoróforos utilizados. Defina os parâmetros para capturar as imagens z-stack.
    NOTA: Os fluoróforos utilizados no estudo foram DAPI, 488 e 647. Os lasers 405, 488 e 638 foram ligados para visualizar a coloração.
    NOTA: A pilha z recomendada depende do poder de resolução do objetivo.
  3. Ajuste a imagem ao vivo: defina o foco, a intensidade do laser, etc.
    NOTA: Quanto maior a intensidade do laser, maior a probabilidade de a amostra ser fotobranqueada. Portanto, selecione uma intensidade de laser ideal.
  4. Adquira a pilha z.
    NOTA: Isso pode levar até 5-10 min.
  5. A partir das imagens coletadas na pilha z, captura de tela pelo menos três imagens por pilha.
    NOTA: Certifique-se de obter capturas de tela em toda a pilha para não duplicar os núcleos ao quantificar.
  6. Salve cada arquivo como um TIFF e prossiga para a análise (etapa 5).

5. Análise

NOTA: Use o JCountPro para todas as análises de imagem seguindo o relatório21 publicado anteriormente. Para obter este software, consulte a publicação associada.

  1. No painel de análise de objetos (parte superior do programa) na guia de seleção de arquivos (parte inferior do programa), selecione os arquivos TIFF .
  2. Clique em Adicionar para mover os arquivos selecionados para o grupo de arquivos selecionados. Selecione Exibir.
  3. Na guia de segmentação, selecione azul como a cor dos núcleos. Selecione Segmentação automática para otimizar o limiar dos núcleos.
    NOTA: Se a segmentação automática não identificar com precisão os objetos, o usuário poderá ajustar o ajuste fino e o ajuste bruto da imagem ou consultar o manual do usuário para otimizar ainda mais a segmentação.
  4. No painel de objetos, selecione Dividir objetos grandes automaticamente e otimizar o tamanho dos núcleos.
    NOTA: Os núcleos normalmente têm um tamanho incondicional de 5.000 pixels, enquanto o tamanho condicional é de 1.500 pixels. Consulte o manual do usuário para otimizar ainda mais o tamanho dos objetos.
  5. Selecione Identificar objetos para testar os parâmetros.
    NOTA: Se esses parâmetros não forem precisos, o tamanho e o ajuste podem ser ajustados junto com outras configurações. Consulte o manual do usuário para obter instruções sobre otimização adicional.
  6. Depois de ajustar os parâmetros para a imagem, selecione Identificar objetos em todas as imagens para identificar os núcleos em todas as imagens selecionadas.
  7. Selecione o painel Análise de focos (parte superior do programa).
  8. Na guia Selecionar arquivos (parte inferior do programa), selecione os arquivos TIFF que foram usados para análise de objetos e selecione os Botões de seta (>>) para mover as imagens para o grupo de arquivos de imagem.
  9. No grupo de diretórios abaixo dos arquivos de imagem que foram movidos, clique duas vezes na pasta Edição Manual e selecione para mover os arquivos ioc para o grupo de arquivos da coleção de objetos.
    Observação : todos os TIFFs selecionados devem ter correspondido a arquivos ioc.
  10. Pressione Select (Selecionar ) para mover os arquivos para o grupo de arquivos selecionado. Selecione a guia Contagem de focos na parte inferior do programa.
  11. Otimize os parâmetros seguindo as etapas abaixo.
    1. Índice de configurações da cartola: 12.
    2. Canal de foco: Selecione a cor dos focos (verde: ɣ-H2AX; vermelho: RAD51).
    3. Configurações da cúpula H: altura da cúpula %: 30; limiar %: 28 e 28.
    4. Configuração de forma/tamanho: Tamanho mínimo do foco, pixels: 5. Selecione Aplicar forma/tamanho. Tamanho máximo do foco (condicional): 32. Redondeza mínima, x100: 96. Foco máximo, pixels: 60.
    5. Filtro de ruído: tamanho 1.
      NOTA: Se determinar se um núcleo é positivo para coloração de geminina, sob o segundo canal, selecione verde e, em análise, selecione intensidade.
  12. Para testar os parâmetros definidos, selecione os botões abaixo na ordem: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
    Observação : se esses parâmetros não funcionarem, o tamanho e o ajuste podem ser ajustados junto com outras configurações. Consulte o manual do usuário para saber mais sobre como a imagem pode ser ainda mais otimizada.
  13. Uma vez que os parâmetros são otimizados para as imagens selecionadas, selecione Contagem automática para contar os focos em cada imagem por núcleo. Se o segundo canal for desejado, o programa determinará a intensidade que pode ser usada.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

O protocolo apresentado pode colorir, visualizar e quantificar com sucesso proteínas de reparo de danos ao DNA nuclear em organoides. Essa técnica foi utilizada para corar e avaliar as DOP antes e após a irradiação. As DOP foram expostas a 10 Gy de radiação e avaliadas quanto aos seguintes biomarcadores: ɣ-H2AX (Figura 1), um marcador de dano ao DNA; RAD51 (Figura 2), um marcador para HRR; 53BP1, um marcador de NHEJ; RPA, um marcador de tensão de replicação (

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A resposta a danos no DNA desempenha um papel integral no desenvolvimento do câncer de ovário e na resistência à quimioterapia. Portanto, uma compreensão completa dos mecanismos de reparo do DNA é imperativa. Aqui, uma metodologia é apresentada para estudar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides intactos 3D. Um protocolo reprodutível e confiável é desenvolvido utilizando anticorpos característicos para avaliar danos ao DNA, recombinação homóloga, junção final não homóloga e estresse de replicação. É importante...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Somos gratos pela orientação de Pavel Lobachevsky, PhD no estabelecimento deste protocolo. Também gostaríamos de agradecer à Escola de Medicina da Universidade de Washington no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia e Divisão de Oncologia Ginecológica da Universidade de Washington, ao Programa Acadêmico do Reitor da Universidade de Washington, à Fundação do Grupo de Oncologia Ginecológica e ao Programa de Desenvolvimento de Cientistas Reprodutivos por seu apoio a este projeto.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1x solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio (PBS++)Sigma14-040-133
1x solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (PBS)Fisher Scientific 
Anticorpo Ant-53BP1 A BD Biosciences612522diluída a 1:500 em tampão de coloração
Anticorpo Anti-Geminina Abcamab104306diluído para 1:200 em tampão de coloração
Anti-Geminin Antibody ProteinTech10802-1-APdiluído a 1:400 em tampão de coloração
Anti-RAD51 Anticorpo Abcamab133534diluído a 1:1000 em tampão de coloração
Anti-yH2AX Anticorpo Millipore-Sigma05-636diluído a 1:500 em tampão de coloração
Anticorpo Ant-phospho-RPA32 (S4/S8)Bethyl Laboratories A300-245A-Mdiluído a 1:200 em tampão de coloração
Albumina de soro bovino (BSA)Fisher Scientific BP1605 100
Centrífuga; Centrífuga Sorvall St 16RThermo Scientific 
Microscópio Confocal, sistema confocal Leica SP5 DMI4000Leica 
Tubos Cônicos, 15 mLCorning 14-959-53A
Contador de Células Automatizado Countess 3 FL (Máquina de Contagem de Células) Thermo Scientific 
Lâminas de Câmara de Contagem de Células CountessThermo Scientific C10228
Cover SlipLA ColorsQualquer esmalte transparente será suficiente
Cultrex  Extrato de Membrana de Base RGF, Tipo 2  R& D Systems 3533-010-02Provavelmente poderia usar Matrigel ou outra Matriz BME 
DAPI Thermo Scientific   R37606NucBlue Reagente ReadyProbes de Célula Fixa, Diluído em 1x PBS 
Glicina Fisher Scientific 
JCountProJCountProPara acessar o software, envie um e-mail para: jcountpro@gmail.com 
Tubos de MicrocentrífugaFisher Scientific 07-000-243
Esmalte para Unhas StatLabSL102450
Parafomraldeído (PFA), 2% Ciências da Microscopia Eletrônica 157-4Diluir para 4% de PFA em PBS++ para obter 2% de PFA
Permeabilização BufferMade in Lab0.2% X-100 Triton em PBS++ 
PipetaRainin17014382
Ponteiras de Pipeta Chuva
ProLong Gold Antifade MountantThermo Scientific   P36930
Tampão de ColoraçãoFeito em Laboratório0.5% BSA, 0.15% Glicina, 0.1% X-100 Triton em PBS++ 
Sistema de Deslizamento de Câmara Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Thermo Scientific 12-565-8
Triton X-100Sigma-Alderich 
Solução de Azul de Tripano, 0,4%Thermo Scientific 
TrypLE ExpressInvitrogen12604013enzima recombinante X-RAD
320 Irradiador Biológico livre deIrradiação de Raios-X de Precisão X-RAD320
ICN186045475004240389584AMQAF2000NC0756056170149671133248100115250061 origem animal

Referências

  1. Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
  2. Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
  3. Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713(2020).
  4. Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
  5. Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
  6. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  7. Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
  8. Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
  9. Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
  10. Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
  11. Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654(2015).
  12. Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
  13. Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
  14. Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
  15. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  16. Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054(2020).
  17. Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
  18. Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984(2022).
  19. Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
  20. Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
  21. Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
  22. Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
  23. van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709(2020).
  24. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  25. O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732(2016).
  26. Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266(2018).
  27. Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
  28. Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758(2020).
  29. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  30. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  31. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  32. Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Ensaio de ImunofluorescênciaMicroscopia ConfocalOrganoides Derivados de PacientesCultura Celular 3DResposta a Danos no DNALocalização ProteicaAvaliação de BiomarcadoresGama H2AX
Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.