Identificação dos genes envolvidos no desenvolvimento estomático via Epidermal Phenotype Scoring

Resumo

Este trabalho descreve dois métodos de fenotipagem sem o uso de cascas epidérmicas para caracterizar os genes que controlam o desenvolvimento estomatizante. O primeiro método demonstra como analisar um fenótipo estomatal usando uma epiderme vegetal corada com O azul de toluidina . O segundo método descreve como identificar ligantes estomatáticos e monitorar suas atividades biológicas.

Resumo

Os estomatos são pequenos poros na superfície das plantas terrestres que estão envolvidos na troca gasosa e na liberação de vapor de água, e sua função é crítica para a produtividade e sobrevivência das plantas. Como tal, a compreensão dos mecanismos pelos quais os estômatos se desenvolvem e padronizam tem um tremendo valor agronômico. Este trabalho descreve dois métodos fenotípicos utilizando Arabidopsis cotyledons que podem ser usados para caracterizar os genes que controlam o desenvolvimento estomático e a padronização. Primeiramente são apresentados os procedimentos para análise dos fenótipos estomatáticos utilizando cotilédones corados com azul de toluidina O. Este método é rápido e confiável e não requer o uso de peelings epidérmicos, que são amplamente utilizados para análises fenotípicas, mas exigem treinamento especializado. Devido à presença de múltiplos resíduos de cisteína, a identificação e geração de peptídeos EPF bioativos que têm um papel no desenvolvimento estomático têm sido desafiadores. Assim, apresenta-se em segundo lugar um procedimento utilizado para identificar ligantes estomatáticos e monitorar sua atividade biológica por bioensaios. A principal vantagem deste método é que ele produz dados reprodutíveis com relativa facilidade, reduzindo a quantidade de solução peptídica e o tempo necessário para caracterizar o papel dos peptídeos no controle do padrão estomático e desenvolvimento. No geral, esses protocolos bem projetados aumentam a eficiência do estudo dos potenciais reguladores estomáticos, incluindo peptídeos secretores ricos em cisteína, que exigem estruturas altamente complexas para sua atividade.

Introdução

A padronização adequada e a diferenciação dos estômatos vegetais são críticas para sua função em dois processos biológicos fundamentais, fotossíntese e transpiração, e são impostas pelas vias de sinalização do peptídeo EPF. Na Arabidopsis, três peptídeos ricos em cisteína secretados, EPF1, EPF2 e STOMAGEN/EPFL9, controlam diferentes aspectos do desenvolvimento estomático e são percebidos pelos componentes do receptor da superfície celular, incluindo quinases receptoras da família ERECTA (ER, ERL1 e ERL2), SERKs e TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Esse reconhecimento, então, leva à regulação negativa dos fatores de transcrição que promovem a diferenciação estomática por um processo dependente de MAPK¹¹. A descoberta desses genes estomatâmicos centrais é alcançada principalmente pela triagem fenotípica de mutantes que exibem defeitos epidérmicos. Este trabalho apresenta métodos de fenotipagem relativamente simples e eficientes para a visualização dos estômatos e outras células epidérmicas, que são necessários para identificar e caracterizar os genes potenciais que controlam a padronização e diferenciação estomática.

A observação dos detalhes da epiderme vegetal tem sido tipicamente realizada por meio de peelings epidérmicos com ou sem coloração com corante como azul de toluidina O (TBO) ou safranina^12,13,14. No entanto, o principal desafio desses métodos é que eles exigem treinamento especializado para descascar a epiderme foliar sem rasgar os tecidos e observar e analisar cuidadosamente os dados de padronização, evitando as imagens retiradas de diferentes partes da folha. Tratamentos químicos para limpar as amostras de tecido com reagentes, como soluções de clareamento à base de hidrato de cloral, também têm sido amplamente utilizados para uma variedade de materiais biológicos ^8,15; esses tratamentos geram uma grande quantidade de informações fenotípicas, fornecendo imagens de alta qualidade, mas também exigem o uso de produtos químicos perigosos (por exemplo, formaldeído, hidrato de cloral). Este artigo apresenta primeiro um método de fenotipagem relativamente fácil e conveniente que produz imagens suficientes para análise quantitativa, mas não requer o uso de produtos químicos perigosos e cascas de folhas epidérmicas para a preparação da amostra. Uma epiderme de cotilédones corada com TBO também é ideal para o estudo do desenvolvimento estomático, pois a falta de tricomas e o menor gradiente de desenvolvimento nos cotilédones permitem a interpretação simples e tratável dos fenótipos epidérmicos.

Os peptídeos estomáticos EPF pertencem ao grupo de peptídeos específicos de plantas, ricos em cisteína, que têm tamanhos maduros relativamente grandes e ligações dissulfeto intramoleculares entre resíduos de cisteína conservados. O correto dobramento conformacional é fundamental para sua função biológica, mas os peptídeos ricos em cisteína, que são produzidos por síntese química ou por um sistema de recombinação heteróloga, podem ser inativos e são uma mistura de peptídeos adequadamente dobrados e desdobrados ^3,7,16. Assim, o rastreamento de peptídeos bioativos que têm um papel no controle do desenvolvimento estomático tem sido uma tarefa muito desafiadora. Este manuscrito descreve adicionalmente um bioensaio para a melhor identificação e caracterização de peptídeos estomáticos bioativos. Neste método, as mudas de Arabidopsis são cultivadas em uma placa de múltiplos poços contendo meios com e sem peptídeos potenciais por 6-7 dias. Em seguida, a epiderme do cotilédones é visualizada usando um microscópio confocal. Em geral, para visualizar claramente a atividade biológica de peptídeos potenciais no desenvolvimento estomático, os genótipos que produzem mais e/ou menos células estomáticas da linhagem, como o mutante epf2, que produz mais células epidérmicas, e a linhagem STOMAGEN-ami, que confere densidade celular epidérmica reduzida ^2,4,5, são utilizados além do controle de Arabidopsis do tipo selvagem (Col-0) para os bioensaios.

No geral, os dois protocolos aqui apresentados podem ser utilizados para a avaliação rápida e eficiente de vários fenótipos epidérmicos e para o rastreamento de pequenos peptídeos e hormônios que têm um papel no controle do padrão estomático e do desenvolvimento.

Protocolo

1. Coloração de Arabidopsis cotyledons com TBO

1. Esterilização de sementes e condições de crescimento
   1. Esterilizar ~30 sementes de Arabidopsis por genótipo em um tubo de microcentrífuga adicionando 1 mL de uma solução de esterilização de sementes (33% de alvejante comercial, 0,1% de Triton X-100) e balançar suavemente por 10-12 min à temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Esterilizar ~30 sementes do tipo selvagem Arabidopsis adesão Columbia (Col-0) e/ou ~60 sementes de plantas transgênicas portadoras de um gene quimicamente induzível (por exemplo, Est::EPF2⁷) para usar plântulas transgênicas cultivadas em placas 1/2 Murashige e Skoog (MS) (2,16 g/L contendo 0,8% de ágar [p/v]) sem indutor (por exemplo, β-estradiol) como controles (Figura 1 e Figura 2).
   2. Retire a solução de esterilização, lave as sementes quatro vezes com 1 mL de água estéril em um exaustor de fluxo laminar e ressuscite-as em ~200 μL de ágar estéril a 0,1%.
   3. Semeie ~30 sementes por genótipo em placas de ágar 1/2 MS ou placas de ágar 1/2 MS contendo um indutor (por exemplo, 10 μM β-estradiol) para a indução química do transgene (por exemplo, Est::EPF2⁷) usando uma pipeta e sele com fita de microporos.
      NOTA: As sementes precisam ser distribuídas uniformemente na placa para evitar colocá-las em estreita proximidade, pois isso impedirá que as mudas cresçam uniformemente.
   4. Estratificar as sementes colocando as placas a 4 °C sem luz por 3-5 dias para sincronizar a germinação.
   5. Após a estratificação, incubar as placas em uma câmara de crescimento a 22 °C sob 120 μmol·m−²·s⁻¹ de luz com um fotoperíodo de 16 h de luz e 8 h de escuridão por 10 dias.
2. Amostragem e coloração TBO de Arabidopsis cotyledons
   1. Aos 10 dias após a germinação, selecione cuidadosamente e corte um dos cotilédones das plântulas individuais que estão crescendo uniformemente com outras mudas na placa para limitar a variabilidade.
      NOTA: Os cotilédones são amostrados de plântulas de 10 dias de idade por não possuírem tricomas e células imaturas da epiderme, o que simplifica a interpretação dos fenótipos epidérmicos.
   2. Colocar cada cotilédones num tubo de microcentrífuga contendo 1 ml de uma solução de fixação (etanol 9:1 a ácido acético) utilizando pinça e deixar a amostra na solução de fixação durante a noite, no mínimo e à temperatura ambiente.
      NOTA: As amostras podem então ser armazenadas por até alguns anos nesta condição. A imagem Figura 2E foi retirada de uma amostra de cotilédones que foi armazenada em solução de fixação por mais de 3 anos. É importante manter o cotilédones numa solução de fixação imediatamente após o corte e colocar não mais do que cinco cotilédones em cada tubo de microcentrífuga para uma preparação homogénea da amostra mais tarde.
   3. Retire a solução de fixação e adicione 1 mL de etanol a 70%. Depois de inverter o tubo algumas vezes, deixe o tubo contendo as amostras em RT por ~ 30 min.
   4. Repita a etapa 1.2.3 usando 1 mL de etanol a 50% e, em seguida, etanol a 20%.
   5. Substitua o 1 mL de etanol a 20% por 1 mL de água destilada e, em seguida, deixe o tubo contendo as amostras de cotilédones por ~30 min após a inversão do tubo algumas vezes.
      NOTA: As amostras podem permanecer em água destilada por mais de 24 h, mas isso não é recomendado para a obtenção de imagens de boa qualidade (imagens bem coradas para diferentes tipos de células epidérmicas) para análise quantitativa.
   6. Retire toda a água destilada do tubo. Em seguida, adicione imediatamente ~200 μL de solução de coloração TBO (TBO a 0,5% em H₂O, filtrado) por ~2 min.
      NOTA: Certifique-se de que cada amostra de cotilédones está uniformemente exposta à solução de TBO, agitando suavemente os tubos durante a incubação. Para evitar a sobrecoloração com TBO (o momento da coloração é essencial e pode ser variável para cada genótipo), não processe mais de seis tubos contendo amostras de cada vez.
   7. Remova a solução de coloração TBO o mais completamente possível e, em seguida, lave imediatamente as amostras algumas vezes, adicionando 1 mL de água fresca destilada.
3. Imagens e análise de dados
   1. Pegue uma lâmina de microscópio e adicione uma gota de 15% de glicerol (~ 50 μL). Coloque o cotilédones com o lado abaxial em glicerol a 15% na lâmina usando pinça fina. Em seguida, cubra-o suavemente com uma tampa para que quaisquer bolhas de ar formadas possam ser removidas da amostra.
   2. Fotografe o lado abaxial da epiderme do cotilédones usando um microscópio de campo brilhante (Figura 1 e Figura 2) e, em seguida, examine o fenótipo epidérmico contando o número de estômatos e outros tipos de células epidérmicas.
   3. Para cada genótipo, calcule o fenótipo epidérmico utilizando as seguintes fórmulas descritas por Jangra et ^al.17:
      Índice estomático (%) = (Número de estômatos/Número total de células epidérmicas) × 100
      Densidade estomática (mm⁻²) = Número de estômatos/Área (mm²)
      NOTA: Captar pelo menos oito cotilédones (N = 8) para cada genótipo e documentar o fenótipo epidérmico de cada genótipo, comparando-o com o fenótipo da planta selvagem e/ou plantas transgênicas que expressam um transgene quimicamente induzível cultivado sem um indutor.

2. Bioensaios para peptídeos estomatáticos

NOTA: O procedimento para bioensaios é mostrado na Figura 3.

1. Esterilização de sementes e condições de crescimento
   1. Esterilize ~ 25 sementes para cada tratamento como acima, e semeie aproximadamente metade das sementes em cada uma das duas placas de ágar 1/2 MS em um exaustor de fluxo laminar.
      NOTA: Use o genótipo com células epidérmicas altas e/ou baixas (por exemplo, epf2²) em vez de usar um fundo do tipo selvagem (por exemplo, Col-0) para detectar facilmente as atividades biológicas dos peptídeos no padrão e diferenciação de células epidérmicas (Figura 4).
   2. Estratificar as sementes durante 3 dias a 4 °C no escuro.
   3. Retire cada uma das duas placas em intervalos de ~10 h e incube as sementes em placas a 22 °C sob 120 μmol·m−²·s⁻¹ de luz com um fotoperíodo de 16 h de luz e 8 h de escuridão por 1 dia.
2. Tratamento peptídico e imagem
   1. Em um exaustor de fluxo laminar, transplante cuidadosamente 10-12 mudas de Arabidopsis de um dia de idade de cada uma das duas placas preparadas em uma placa de 24 poços contendo 1,5 mL de 1/2 MS de meio líquido em cada poço (~ 20 mudas por poço).
      NOTA: O momento do tratamento peptídico para as mudas é crítico para os resultados fenotípicos do tratamento peptídico, portanto, prepare as sementes em duas placas separadas para obter dois estágios diferentes de desenvolvimento de plântulas para o tratamento.
   2. Adicione um tampão sozinho (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) ou duas concentrações diferentes do peptídeo (tipicamente, 1 μM e peptídeo 2,5 μM em 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) a cada poço contendo ~20 mudas de Arabidopsis de um dia germinadas em placas de ágar 1/2 MS.
      NOTA: Remova as alíquotas da solução peptídica de um congelador e mantenha-as em RT por alguns minutos antes do tratamento. Os peptídeos armazenados em um freezer a -80 °C são estáveis por alguns anos, mas os ciclos de congelamento-descongelamento devem ser evitados armazenando a solução peptídica em pequenas alíquotas.
   3. Depois de misturar suavemente as mudas com um tampão sozinho ou uma solução peptídica usando uma pipeta, sele a placa com fita de microporos. Incubar a placa de ensaio em condições de dia longo (fotoperíodo de 16 h, 120 μmol·m−2·s⁻¹ luz) durante 5-7 dias a ²² °C.
      NOTA: Evite que as mudas cresçam muito próximas umas das outras para permitir que cada plântula tenha uma exposição uniforme à solução peptídica. Gire suavemente a placa por 2-3 h antes de incubar a placa em uma câmara de crescimento para aumentar a aeração.
   4. Transferir cada plântula do poço contendo tampão sozinho ou peptídeo em uma lâmina de cobertura e dissecar o cotilédones da plântula. Coloque o lado abaxial do cotilédones para cima usando pinça e corte-o em pequenos pedaços.
   5. Pegue outra lâmina de microscópio limpa e coloque sobre ela uma gota de solução de iodeto de propídio (~25 μL, 2 mg/mL em H₂O).
   6. Coloque um dos pequenos pedaços de cotilédones em uma gota de solução de iodeto de propídio usando pinça e coloque suavemente a tampa. Aplique uma solução adicional de iodeto de propídio na borda da tampa para remover quaisquer bolhas de ar que se formaram.
   7. Fotografe o lado abaxial do cotilédone, utilizando um microscópio confocal, e compare as imagens com as imagens de plântulas cultivadas em meio de 1/2 MS contendo apenas tamponamento.
      NOTA: As imagens apresentadas na Figura 4 foram retiradas de plântulas do tipo selvagem Col-0 ou epf2^2,5 que foram tratadas apenas com tampão (Figura 4A, B) ou dois lotes de solução peptídica EPF2 (Figura 4C-F) e foram armazenadas a -80 °C durante 1 ano.

Resultados

Várias plantas transgênicas estomáticas e mutantes conhecidos por terem menos ou mais densidade estomática e agrupamento (epf2 2,5, epf1 epf2 ^2,5, tmm^12, uma linha⁴ silenciada por STOMAGEN, e linhas transgênicas que carregam o construto de superexpressão Est::EPF1 ou Est::EPF2 induzível por estradiol⁷

Discussão

Os dois métodos de análise fenotípica para identificar e caracterizar os genes que controlam a padronização e diferenciação estomática aqui apresentados são ensaios convenientes e confiáveis, uma vez que os protocolos não exigem o uso de peelings epidérmicos e equipamentos especializados (que são demorados e requerem treinamento especial para o preparo da amostra), mas produzem imagens de alta qualidade para a análise quantitativa dos fenótipos epidérmicos.

Uma limitação dessa técnica para aná...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
18 mm x 18 mm lamínula	VWR	16004-326
Placas estéreis de 24 poços com tampa	VWR	CA62406-183
Fita cirúrgica Micropore 3M	Fisher Scientific	19-027-761	Fita de papel cirúrgico microporoso usada para selar placas MS
76 x 26 mm Lâmina de microscópio	TLG	GEW90-2575-03
Ácido acético, ≥ 99,8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Alvejante doméstico (por exemplo, Clorox)
Microscópio confocal	Nikon		Nikon C2 operada pela NIS-Elements
Ethanol	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Baixado de https://imagej.net/software/fiji/
Fórceps	Sigma-Aldrich	F6521
Mistura de vitaminas da Gamborg	Cassson Labs	GBL01-100ML	Loja em 4 ° C
Glicerol	Fisher Scientific	G33-4
Câmaras de Crescimento	Conviron,  modelo E15		ciclo de luz de 16h, definido em 21° C com intensidade de luz de 120 µ mol· m-2· s-1.
Luzes	HD Supply	25272	Luzes fluorescentes em câmaras de crescimento, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Tubo de microcentrífuga	Fisher Scientific	14-222-155	Tubos nos quais as sementes de Arabidopsis thaliana são colocadas para realizar a esterilização
Microscópio	Nikon		Nikon Eclipse TiE equipado com uma câmera digital DsRi2
Murashige e Skoog sais basais	Cassson Labs	MSP01-1LT	Loja em 4 ° C
Placa de Petri 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z	Placas de Petri nas quais a mídia MS é derramada com o propósito de cultivar Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide	VWR	39139-064
Bisturi	Fisher Scientific	08-916-5A
Sacarose	BioShop	SUC700.5
Azul de toluidina O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Base Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758